Name: Wachsende Magnetotaktische Bakterien der Gattung Magnetospirillum: Stämme MSR-1, AMB-1 und MS-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Magnetospirillum-Stämme MSR-1, AMB-1 und MS-1 in flüssigen und halbfesten Medien mit optimierter Sauerstoffkontrolle kultivieren. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Forschung.

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Wir danken Richard B. Frankel für seine Hilfe bei MTB-Kulturen, Adam P. Hitchcock und Xiaohui Zhu für ihre Unterstützung beim Aufbau der MTB-Kulturen an der McMaster University und Marcia Reid für Ausbildung und Zugang zu der Elektronenmikroskopie-Anlage (McMaster University, Faculty of Health Sciences). Diese Arbeit wurde von den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC) und der US National Science Foundation unterstützt.

1. Installation der N-2 -Station
Hinweis: Wählen Sie den Innendurchmesser des Rohres, so dass es an der Gas-Tank mit minimaler Leckage angeschlossen werden kann und damit die Zylinder eine 1 mL kunststoffspritze fest in dieser Schlauch passt. Eine Abbildung des kompletten N2 Begasung Bahnhof ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt.
<ol><li>Installieren Sie sicher einen N-2 -Gas-Tank in der Nähe einer Bank auf der gibt es genügend Raum zum Einrichten der N-2 -Station (eine Länge von ca. 50 cm).</li>
	<li>Verbinden Sie mit dem Tank ein Stück Schlauch lang genug um das Gebiet zu erreichen, wo der Bahnhof gebaut wird. Wenn nötig, auftragen Sie Teflonband am Ausgang des Tanks, um Undichtigkeiten zu vermeiden.</li>
	<li>Um eine Station in der Lage, sprudelnden fünf Flaschen des Mediums zur gleichen Zeit zu bauen, schneiden Sie vier Stück Schlauch von ca. 5 cm Länge.</li>
	<li>Montieren Sie die Stücke von Schläuchen in einer Linie mit drei Dreiwege t-förmigen Kunststoff-Fittings. Schließen Sie ein Ende der Linie an den Schlauch am Ausgang des N2 Tanks durch eine zusätzliche t-förmigen Einbau. Hinzufügen eines 90° Bogens passend am anderen Ende.</li>
	<li>Verwendung Band fügen Sie die Struktur auf eine horizontale Metallstab platziert ca. 30 cm über der Bank.</li>
	<li>Schließen Sie fünf Stücke von Rohr (ca. 20 cm lang) auf die freie Ausgänge der Armaturen im Schritt 1.4 installiert.</li>
	<li>Entfernen Sie die Kolben aus fünf 1,0 mL Kunststoffspritzen und schneiden das größere Ende des diese Spritzen (i.e., die gegenüberliegende Seite zur Nadel), halten nur die abgestuften Teil. Diese Spritzen nicht zu fest mit Watte, füllen.</li>
	<li>Legen Sie die Spritzen in den 20 cm langen vertikalen Stücken von Schläuchen und verwenden Sie Seifenwasser, um sicherzustellen, dass es keine Leckage beim N2 fließt.</li>
	<li>Entfernen Sie die Kappen der fünf 25 G Nadeln (0,5 x 25 mm) und legen Sie diese Nadeln in 10 cm Stücke von dünnen Schlauch. Sicherstellen Sie, dass die Nadeln fest in das Rohr passen. Achtung: Besteht eine Messerstecherei während dieses Schritts. Tun Sie es langsam und vorsichtig.</li>
	<li>Befestigen Sie die Nadeln in Schritt 1,9, die Spritzen der N-2 -Station vorbereitet. Sicherzustellen Sie, dass N2 durch alle fünf Linien fließt und halten Sie die Station auf Stand-by.</li>
</ol>2. Wachstum mittelfristig Vorbereitung
Hinweis: Es ist möglich, die Menge des Mediums vorbereitet, einzustellen, wie in den Schritten 2.1.2, 2.2.2 und 2.3.8 erläutert. Die Menge an Wasser und Chemikalien verwendet muss nur proportional angepasst werden. Die Rolle der alle mittelkomponenten ist in ergänzenden Tabelle1beschrieben.
<ol><li>Vorbereitung der flüssigen Wachstumsmedium für MSR-1<ol>
<li>Bereiten Sie eine 10 mM Eisen Citrat-Lösung durch Zugabe von 0,245 g ferric Citrate in 100 mL destilliertem, entionisiertem Wasser. Erhitzen Sie und unter Rühren Sie auflösen bis eine gelbe bis Orange klar, dass die Lösung erreicht ist. Autoklaven die Lösung mit einem Standard-Zyklus (mindestens 15 min Exposition bei 121 ° C) und speichern dann diese Stammlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln. Hinweis: Verwerfen Sie die ferric Citrat-Lösung, wenn ein Niederschlag offensichtlich wird.</li>
		<li>In einem Becherglas mit 1 L destilliertem, entionisiertem Wasser, fügen Sie die folgenden in der Reihenfolge unter Rühren: 1,0 mL das Spurenelement ergänzen Lösung, 0,1 g KH2PO4, 0,15 g MgSO4.7 H2O, 2,38 g HEPES, 0,34 g NaNO3 , 0,1 g Hefe-Extrakt, 3,0 g Soja Bohnen Pepton, 4,35 mL Kalium Lactat (60 % w/w Lösung) und 5 mL 10 mM FE Citrat-Stammlösung. Hinweis: Passen Sie die Mengen proportional ggf. eine kleinere Menge an Wachstumsmedium. Bereiten Sie eine N-2 -Station in der Lage, sprudelnden fünf Flaschen zur gleichen Zeit wie die in Schritt 1 dieses Protokolls 300 mL Medium. Achtung: Trace Mineral und FE-Citrat-Lager, die Lösungen müssen steril gehalten werden. Um Kontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie standard sterilen Technik beim Gebrauch (Flamme offenen Spitzen der Flaschen mit dem Bunsenbrenner) und sterilen Pipettenspitzen zur Abgabe. Lagern Sie Mineral-Lösung im Kühlschrank bei 4 ° c</li>
		<li>Stellen Sie nach der Zugabe von Chemikalien den pH-Wert auf 7,0 mit 1 M NaOH Lösung. Das frisch zubereitete Medium in 125 mL Serum-Flaschen zu verzichten. Gießen Sie 60 mL Medium in jeder Flasche.</li>
		<li>Blase N2 in das Medium für 30 min die gelösten O2entfernen, verbunden mit den kleinen Schlauch an die N-2 -Station in Schritt 1 beschrieben. Legen Sie Butyl-Gummistopfen auf jeder Flasche, lassen eine kleine Öffnung, damit das überschüssige Gas um die Flasche zu beenden zu können. Achtung: Schaum könnte während der sprudelnden mit N2. Passen Sie den Gasstrom zur Vermeidung von Schaumproduktion entsprechend an.</li>
		<li>Crimp versiegeln jede Flasche mit den vorbereiteten stopfen und ein Aluminium-Siegel. Die Aluminium-Dichtung sorgt dafür, dass die Flasche während des Restes des Protokolls versiegelt bleibt.</li>
		<li>Trennen Sie die Nadeln und den dünnen Schlauch von der N-2 -Station und ersetzen Sie sie durch saubere Nadeln (1 Zoll, ≤ 23 G). Einstellen Sie die Ventile der N2 Tank so, dass sanfte kontinuierliche Gas den Tank (ca. 50 mL/min verlässt). Hinweis: Nadeln größer als 23G können permanente unsealable Löcher in den stopfen lassen.</li>
		<li>Legen Sie eine der Nadeln in eine Flasche des Mediums durch den Gummistopfen an der N2 Tank angeschlossen. Sofort setzen Sie eine andere saubere Nadel in der gleichen Flasche. Wiederholen Sie diesen Schritt für die anderen Flaschen und lassen Sie N2 fließen für ca. 30 min die Luft in den Flaschen von N2ersetzen zu.</li>
		<li>Trennen Sie eine Flasche von der N-2 -Station durch Entfernen der entsprechenden Nadel. Warten Sie einige Sekunden, bis der Druck in der Flasche des Mediums auf den atmosphärischen Druck verringert und entfernen Sie die zweite Nadel. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle übrigen Flaschen. Achtung: O2 Wiedereintritt in die Flaschen Wachstumsmedium nach Schritt 2.1.4 verhindern, führen Sie Schritte 2.1.4 - 2.1.8 kurz hintereinander. Wenn alle Flaschen auf der N2 Station gleichzeitig verbunden werden können, führen Sie Schritte 2.1.4-2.1.8 für den ersten Satz von Flaschen und dann wiederholen Sie diese Schritte für die restlichen Flaschen.</li>
		<li>Autoklaven der Flaschen. Über Nacht auf Zimmertemperatur abkühlen lassen und anschließend bei Raumtemperatur lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der flüssigen Wachstumsmedium für AMB-1 und MS-1<ol>
<li>Bereiten Sie eine 10 mM Eisen quinate Lösung. Zuerst lösen Sie 0,19 g der quinic Säure in 100 mL destilliertem, entionisiertem Wasser, dann fügen Sie 0,27 g FeCl3.6H2O. unter Rühren auflösen, bis eine dunkle rote, klare Lösung entsteht. Autoklaven die Lösung unter Verwendung eines standard-Zyklus (mindestens 15 min Exposition bei 121 ° C). Hinweis: Bewahren Sie die ferric quinate Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln als eine sterile Stammlösung. Entsorgen Sie die Lösung, wenn ein Niederschlag deutlich wird.</li>
		<li>In einem Becherglas mit 1 L destilliertem, entionisiertem Wasser, fügen Sie die folgenden in der Reihenfolge unter Rühren: 10,0 mL Vitamin-Ergänzung-Lösung, 5,0 mL der Lösung Spur Mineralergänzung, 0,68 g KH2PO4, 0,848 g Natrium Succinat Diabas- Hexahydrat, 0,575 g di-Natrium-Tartrat-Dihydrat, 0,083 g Natrium Acetat Trihydrate, 0,45 mL 0,1 % wässrige Resazurin, 0,17 g NaNO3, 0,04 g Ascorbinsäure und 3,0 mL 10 mM FE quinate Stammlösung. Hinweis: Passen Sie die Mengen proportional ggf. eine kleinere Menge an Wachstumsmedium. Bereiten Sie eine N-2 -Station in der Lage, sprudelnden fünf Flaschen zur gleichen Zeit wie die in Schritt 1 dieses Protokolls 300 mL Medium. Achtung: Vitamin, Spurenelement und FE quinate Stammlösungen steril gehalten werden müssen. Um Kontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie sterile Standardtechnik und sterilen Pipettenspitzen beim Dosieren. Speichern Sie die Mineral und Vitamin-Lösungen im Kühlschrank bei 4 ° C.</li>
		<li>Stellen Sie nach der Zugabe von Chemikalien den pH-Wert auf 6,75 mit 1 M NaOH-Lösung.</li>
		<li>Beziehen sich auf Schritte 2.1.3-2.1.9 für den Rest des Protokolls.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der halbfeste Wachstumsmedium für MSR-1<ol>
<li>Bereiten Sie einen 0,5 M Phosphat-Puffer-Lösung pH 7,0 durch 3,362 g K2HPO4 und 4,178 g KH2PO4 in 100 mL destilliertem, entionisiertem Wasser auflösen. Überprüfen Sie, ob der pH-Wert 7,0 und passen Sie den pH-Wert leicht mit KH2PO4 oder NaOH bei Bedarf an. Speichern Sie die Lösung in einer verschlossenen Glasflasche (vorzugsweise aus Kunststoff zur Vermeidung von sauerstoffaustausch).</li>
		<li>100 mL einer 0,02 M Salzsäure Lösung vorzubereiten. Fügen Sie 0,2 g FeCl2.4H2O diese Projektmappe hinzu und unter Rühren Sie auflösen um ein 10 mM Eisen-chlorid-Lösung zu erhalten. Speichern Sie die Lösung in der Dunkelheit in einer verschlossenen Glasflasche.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 0,8 M Natriumbikarbonat Lösung durch 6,72 g Nahco33 in 100 mL destilliertem, entionisiertem Wasser auflösen. Speichern Sie die Lösung in einer verschlossenen Glasflasche.</li>
		<li>Autoklaven vorbereitet die Lösungen in Schritten 2.2.1 - 2.2.3 mit einem standard-Zyklus (mindestens 15 min Exposition bei 121 ° C). Speichern Sie sie als sterile Stammlösungen im Dunkeln.</li>
		<li>In einem Becherglas mit 1 L destilliertem, entionisiertem Wasser, fügen Sie die folgenden in der Reihenfolge unter Rühren: 5 mL der Lösung Spur Mineralergänzung, 0,2 mL 1 % ige wässrige Resazurin Lösung, 0,4 g NaCl, 0,3 g NH4Cl, 0,1 g MgSO4.7H2 O, 0,05 g CaCl2.2H2O, 1 g Natrium Succinat, 0,5 g Natriumacetat, 0,2 g Hefe zu extrahieren und 1,6 g Agar.</li>
		<li>Decken Sie den Becher mit Aluminiumfolie und Autoklaven die Lösung im Schritt 2.3.5 vorbereitet.</li>
		<li>Kurz vor dem Ende des Kreislaufs Autoklaven, bereiten Sie eine frische 4 % L-Cysteine· HCl· H2O Lösung durch Auflösen von 0,8 g L-cysteine· HCl· H2O in 20 mL destilliertem, entionisiertem Wasser. Neutralisieren Sie die Lösung mit pH 7.0 mit 5 M NaOH Lösung. Achtung: Es ist wichtig, dass die Cystein-Lösung frisch zubereitet ist, um Oxidation der Cystein zu vermeiden. Lagern Sie Mineral-Lösung im Kühlschrank bei 4 ° c</li>
		<li>Nach dem Autoklavieren der mittlere auf 50 – 60 ° C abkühlen lassen und den Becher unter die Flamme einen Bunsenbrenner zu bringen. Die Alufolie entfernen und schnell fügen Sie die folgenden in der Reihenfolge unter Rühren sanft: 0,5 mL der Lösung Vitamin, 2,8 mL sterile Phosphat Puffer Vorratslösung, 3 mL sterile Eisen chlorid Vorratslösung, 1,8 mL sterile Natrium Bicarbonat-Lager Lösung und 10 mL Filter sterilisiert Cystein-Lösung. Hinweis: Passen Sie die Mengen proportional ggf. eine kleinere Menge an Wachstumsmedium. Es ist in der Regel zweckmäßig, einen Stapel von 120 mL Medium vorzubereiten. Achtung: Alle Lösungen müssen für die zukünftige Verwendung steril bleiben. Führen Sie Schritt 2.3.8 mit sterilen Standardtechnik und sterilen Pipette Tipps beim Dosieren.</li>
		<li>Nachdem die Zugabe von Chemikalien, übertragen die warmen Medium in 16 mL steriles Röhrchen mit Schraubverschluss Hungate. Überführen Sie 12 mL des Mediums in jedem Röhrchen und verschließen Sie die Rohre. Achtung: Um Kontaminationen zu vermeiden, führen Sie Schritt 2.3.9 unter die Flamme von einem Bunsenbrenner. Führen Sie es, bevor die Agar erstarrt, während das Medium bei 40 ° C oder höher ist.</li>
		<li>Lassen Sie die Rohre ungestört für mehrere Stunden, bis die Agar erstarrt und die OAI deutlich wird, wie eine rosa bis farblos Schnittstelle, etwa 1 bis 3 cm unter der Oberfläche des Mediums zu materialisieren. Hinweis: Das Medium sollte langsam in das Rohr farblos drehen. Der Zeitaufwand für diesen Übergang ist variabel und hängt vom Umfang der O2 zunächst in das Medium gelöst.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Inokulation von MTB
Hinweis: Die Kulturen der Stämme AMB-1 MS-1 und MSR-1 erhalten Sie im Handel (Table of Materials).
Vorsicht: Führen Sie die folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen unter die Flamme von einem Bunsenbrenner.
<ol><li>Inokulation von Stämmen MSR-1, AMB-1 und MS-1 in flüssigem medium<ol>
<li>Eine leere 125 mL Serum Flasche mit Butyl-Gummistopfen und einer Aluminium-Crimp-Dichtung zu versiegeln. Legen Sie zwei Nadeln in der Flasche durch den Stopper, und schließen Sie eine Spritze vorbereitet wie in Schritt 1,7 bis einer von ihnen. Schließen Sie die Spritze in einen Zylinder von O2 durch den gleichen Typ von Schläuchen für die N-2 -Station verwendet.</li>
		<li>Lassen Sie O2 fließen durch die Flasche für ca. 30 min, um sicherzustellen, dass alle Luft in der Flasche durch O2ersetzt wird. Entfernen Sie beide Nadeln, zulassend einen leichten Überdruck in der Flasche und dann Autoklaven. Lassen Sie die Flasche vor Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Hinweis: Um Zeit zu sparen, führen Sie Schritte 3.1.1 und 3.1.2 während der mittleren Vorbereitung und Autoklaven die Flasche zusammen mit dem Medium oder der Stammlösungen.</li>
		<li>Sterilisieren Sie die Spitzen der Stopper mittlere Wasserflasche und die O-2 -Flasche durch die Anwendung ein paar Tröpfchen von 70 % Ethanol Lösung auf ihnen und Weitergabe durch die Flamme dem Bunsenbrenner.</li>
		<li>Mit eine sterile Spritze und Nadel, O2 Flasche 1 mL O2 entziehen und in die mittlere Wasserflasche zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass die Nadel fest auf die Spritze während dieses Schrittes passt, keine Luft in der Spritze zu vermeiden.</li>
		<li>Wenn das Inokulum aus einer anderen Kultur in einer Glasflasche angebaut, Sterilisieren Sie die Stopper der mittleren Wasserflasche und die älteren kulturflasche durch die Anwendung ein paar Tröpfchen von 70 % Ethanol Lösung auf ihnen und Weitergabe durch die Flamme dem Bunsenbrenner. Wenn das Inokulum aus einem Rohr von gefrorenen Kultur verwenden, lassen Sie es auf Zimmertemperatur Aufwärmen mit dem Rohr unter die Flamme von einem Bunsenbrenner versiegelt.</li>
		<li>Wenn das Inokulum aus einer anderen Kultur in einer Glasflasche gewachsen, inokulieren Sie 1 mL der älteren Kultur in das neue Medium. Wenn die Impfung aus einem gefrorenen bestand, impfen Sie nur 0,1 mL um die Glycerin oder Dimethyl Sulfoxid (DMSO) verwendet in den Gefrierprozess zu verdünnen. Verwenden Sie in beiden Fällen eine sterile Nadel und eine sterile Spritze.</li>
		<li>Die Kultur bei 32 ° C inkubieren und nach 4 bis 7 Tagen in frischem Medium zu impfen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inokulation von MSR-1 O2 gradient halbfesten Medium<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass das Rohr des frisches Medium eine wohldefinierte OAI, materialisiert durch eine rosa bis farblos Schnittstelle angezeigt wird.</li>
		<li>Wenn das Inokulum aus einer anderen O2 Konzentrationsgefälle halbfeste Kultur kommt, Ernten Sie die Bakterien durch pipettieren 50 µL der Kultur mit einer sterilen Pipettenspitze auf die Band, die von den Bakterien gelegt. Impfen Sie langsam diese Bakterien an die OAI in frisches Medium (Rosa/farblos-Schnittstelle), die Schnittstelle zu stören zu vermeiden. Wenn das Inokulum aus einer gefrorenen Kultur kommt, gehen Sie stattdessen auf die gleiche Weise mit 100 µL des Inokulums.</li>
		<li>Verschließen der Tube und lassen Sie die Bakterien, zwischen 25 ° C und 30 ° C wachsen. Übertragung in frischem Medium mit dem gleichen Verfahren vor dem Band der Bakterien erreicht die Oberfläche des Mediums.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Beobachtung der Bakterien
<ol><li>Sterilisieren Sie die Stopper der kulturflasche 70 % Ethanol Lösung oben drauf und die Flamme von einem Bunsenbrenner durchlaufen. Für halbfeste Medium Öffnen der Tube unter die Flamme von einem Bunsenbrenner. Verwenden Sie eine sterile Nadel und eine sterile Spritze, um die Bakterien zu extrahieren.</li>
	<li>Verwendung der hängenden drop Methode8 um sicherzustellen, dass die Bakterien magnetisch und bewegliche sind. Hinweis: Phasenkontrastmikroskopie gibt gute Ergebnisse aber nicht zwingend. Vergrößerungen von 10 X bis 60 X eignen.</li>
	<li>Nutzen Sie Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM), um die Zellstruktur und die magnetosomen im Detail8beobachten.</li>
</ol>

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Die O2 Konzentration Anforderungen der MTB machen sie nicht-triviale im Labor wachsen. Ein wichtiger Schritt des Protokolls für flüssige Medium ist die anfängliche Entfernung aller O2 vom Medium um die Endkonzentration zu kontrollieren, indem man einem bestimmten Volumen von O2, kurz vor der Impfung. Es hat sich gezeigt, dass MSR-1 wächst fast vollständig aeroben Bedingungen, jedoch der Magnetismus der Zellen wird drastisch reduziert. Die Ergebnisse aus der gleichen Studie zeigte, dass St...

Magnetotaktische Bakterien (MTB) repräsentieren ein breites Spektrum von Gram-negativen Prokaryoten in süß- und aquatischen Lebensräumen1allgegenwärtig. Diese Bakterien haben die Fähigkeit, magnetische Kristalle entweder Magnetit (Fe3O4) oder Greigite (Fe3S4), zu produzieren, die in den meisten Fällen zu Ketten im Inneren der Zellen zusammengesetzt sind. Diese besondere strukturmotiv ist aufgrund des Vorhandenseins mehrerer spezifischer Proteine Handeln sowohl im Zytoplasma der Bakterien und auf der Lipidmembran, die jeder Kristall2umgibt. Jeder einzelne Kristall und seine umgebenden Membran Vesikel nennt man eine magnetosomenkristalle und reicht in der Größe von etwa 30 bis 50 nm Magnetospirillum Arten3. Aufgrund der Kette Anordnung der magnetosomen besitzen diese Bakterien eine dauerhafte magnetische Dipolmoment, das macht sie passiv mit externen Magnetfeldern ausrichten. Daher, diese Bakterien aktiv schwimmen entlang der magnetischen Feldlinien, die als selbstfahrende Mikro-Kompasse vermutlich zu mehr effektiv die günstigsten Bedingungen suchen (zB., O2 -Konzentration) für Wachstum.
Eine interessante Eigenschaft von MTB ist ihre Fähigkeit zur Regulierung der Chemie und der Kristallographie magnetosomenkristalle Kristalle. Die meisten Stämme produzieren relativ hochreine Kristalle von Magnetit oder Greigite, obwohl einige Biomineralize beide Mineralien-4. In allen Fällen sind die Bakterien in der Lage, die Größe und die Form der magnetischen Einzeldomäne Kristalle genau zu kontrollieren. Dies erklärt, warum eine große Menge an Forschung unternommen wird, entwickeln ein besseres Verständnis der wie MTB dabei Biomineralisation durchführen. Verständnis dieses Prozesses können die Forscher zu Schneider-magnetischen Nanokristallen für viele gewerbliche und medizinische Anwendungen.
Eine wesentliche Behinderung umfangreiche Forschung auf dem MTB ist die Schwierigkeit, sie im Labor wachsen gewesen. Die meisten Arten, darunter die Stämme, die in dieser Arbeit verwendeten sind obligately mikroaerophil wenn mit O2 als ein terminal Elektron Akzeptor gewachsen. Dies erklärt, warum diese Bakterien in der Übergangszone zwischen oxischen und anoxischen Bedingungen (oxischen anoxischen Interface, OAI) am häufigsten anzutreffen sind. Dies zeigt deutlich, dass MTB haben präzise O2 Konzentration Anforderungen, die offensichtlich bei der Entwicklung von Wachstumsmedium für diese Organismen berücksichtigt werden muss. Darüber hinaus bedeutet die vorhandene Vielfalt der MTB, dass verschiedene Stämme, verschiedene Arten von chemischen Gradienten und Nährstoffe benötigen, um ein optimales Wachstum zu erreichen.
In dieser Arbeit beschreiben wir die Methoden für den Anbau von drei der am häufigsten untersuchten MTB: Magnetospirillum Magneticum (Stamm AMB-1), M. Magnetotacticum (MS-1) und M. Gryphiswaldense (MSR-1). Diese Arten phylogenetisch an der Alphaproteobakterien Klasse der Proteobakterien Stamm gehören, sind spiralförmige Morphologie und besitzen einen polaren Geissel an beiden Enden der Zelle. Wir bieten die Protokolle für den Anbau von MSR-1 Stamm in Flüssigkeit und O2 Konzentrationsgefälle halbfeste Medien, basierend auf bereits veröffentlichte mittlere Rezepte5,6. Außerdem präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für den Anbau von Sorten AMB-1 und MS-1 in veränderten magnetischen Spirillumm Wachstum Medium (MGSM)7.

<table><tbody><tr><td>AMB-1</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>ATCC 700264</td><td></td></tr><tr><td>MS-1</td><td>ATCC</td><td>ATCC 31632&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MSR-1</td><td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)</td><td>DSM 6361</td><td></td></tr><tr><td>Eisencitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3388-250G</td><td></td></tr><tr><td>Spurenelementzusatz</td><td>ATCC</td><td>MD-TMS</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7 H2O</td><td>EMD</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop Canada Inc</td><td>HEP001.250</td><td></td></tr><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5506-250G</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fischer scientific</td><td>DF210929</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Fischer scientific</td><td>DF0436-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Kalium-L-Lactat-Lösung (60%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60389-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-Chinasäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138622</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3.6H2O</td><td>Fischer scientific</td><td>I88-100</td><td></td></tr><tr><td>Vitaminpräparat</td><td>ATCC</td><td>MD-VS</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsuccinat-Hexahydrat</td><td>Fischer scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-L-Tartrat zweibasisches Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729-100G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat-Trihydrat</td><td>EMD</td><td>SX0255-1</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Difco</td><td>0704-13</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-25G</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Caledon</td><td>6620-1-65</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2 .4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44939-250G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>EMD</td><td>SX0320-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>EMD</td><td>1011450500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2 H2O</td><td>EMD</td><td>1023820500</td><td></td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic Canada Inc</td><td>FB0010</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine.HCl.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7880-100G</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mL Spritzen</td><td>Fischer scientific</td><td>B309659</td><td></td></tr><tr><td>25G&nbsp; x 1 Nadeln</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>125 mL Serumflaschen</td><td>Wheaton</td><td>223748</td><td></td></tr><tr><td>20 mm Aluminiumdichtungen</td><td>Wheaton</td><td>224223-01</td><td></td></tr><tr><td>20mm E-Z Crimpzange</td><td>Wheaton</td><td>W225303</td><td></td></tr><tr><td>Butylkautschuk Stopper</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>2048-11800</td><td></td></tr><tr><td>Hungate Rohre</td><td>Chemglass (VWR)</td><td>CLS-4208-01</td><td></td></tr><tr><td>Septumstopfen, 13mm, Hungate</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>2047-11600</td><td></td></tr><tr><td>Glaskulturröhrchen</td><td>Corning (VWR)</td><td>9826-16X</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure 36,5-38%, BioReagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>11,6 - 12 N</td></tr></tbody></table>

wachsende magnetotaktische bakterien der gattung magnetospirillum: stämme msr-1, amb-1 und ms-1

Growing Magnetotactic Bacteria of the Genus Magnetospirillum: Strains MSR-1, AMB-1 and MS-1

Magnetotaktische Bakterien sind Gramnegative, bewegliche, vor allem aquatische Prokaryoten allgegenwärtig in Süßwasser und marinen Habitaten. Sie zeichnen sich durch ihre Fähigkeit, Biomineralize magnetosomen, die magnetische nanometergroßen Kristalle von Magnetit (Fe3O4) oder Greigite (Fe3S4) umgeben von einer Lipidmembran Bilayer innerhalb ihrer Zytoplasma. Für die meisten bekannten Magnetotaktische Bakterien sind magnetosomen in Ketten in das Zytoplasma, dadurch konferieren eine dauerhafte magnetische Dipolmoment zu den Zellen und wodurch sie passiv mit externen Magnetfeldern ausrichten zusammengestellt. Aufgrund dieser Besonderheiten haben Magnetotaktische Bakterien ein großes Potenzial für gewerbliche und medizinische Anwendungen. Aber die meisten Arten sind mikroaerophil und Anforderungen sind in O2 Konzentration, erschweren sie routinemäßig als viele andere Bakterien wie Escherichia coliwachsen. Hier präsentieren wir ausführliche Protokolle für den Anbau von drei der am häufigsten untersuchten Stämme der Magnetotaktische Bakterien, alle gehören zu der Gattung Magnetospirillum. Diese Methoden ermöglichen präzise Steuerung der O2 Konzentration der Bakterien, um sicherzustellen, dass sie normal wachsen und magnetosomen synthetisieren zur Verfügung gestellt. Wachsende Magnetotaktische Bakterien für weitere Studien mithilfe dieser Verfahren erfordert keine der Experimentator, ein Experte in der Mikrobiologie. Die allgemeinen Methoden in diesem Artikel vorgestellten können auch verwendet werden, zu isolieren und Kultur anderen Magnetotaktische Bakterien, obwohl es wahrscheinlich ist, dass Wachstum Medien chemische Zusammensetzung geändert werden muss.

Erfolgreiche Vorbereitung der Wachstumsmedien kann wie folgt beurteilt werden. Am Ende des Prozesses, klare Lösungen (zB., frei von jedem Niederschlag) gesammelt werden (Dies gilt für flüssige Medien und O2 gradient halbfesten Medium). Ein Bild den erwarteten Aspekt des flüssigen Mediums MSR-1 anzeigen, bevor Inokulation in Abbildung 2agesehen werden kann. Eine erfolgreiche O2 Konzentrationsgefälle halbfesten Medium wird durch d...

Wir präsentieren ein Verfahren für den Anbau von mehrere Stämme von Magnetospirillum in zwei verschiedene Arten von Wachstumsmedium. Magnetospirillum Gryphiswaldense Stamm MSR-1 ist in Flüssigkeit und O2 Konzentrationsgefälle halbfeste Medien gewachsen, während M. Magneticum Belastung AMB-1 und M. Magnetotacticum Belastung MS-1 im flüssigen Medium gewachsen sind.

Wachsende Magnetotaktische Bakterien der Gattung Magnetospirillum: Stämme MSR-1, AMB-1 und MS-1

Magnetotactic bacteria are Gram-negative, motile, mainly aquatic prokaryotes ubiquitous in freshwater and marine habitats. They are characterized by their ...

Diese Methode ermöglicht den Anbau von drei verschiedenen Arten von magnetotaktischen Bakterien namens MSR-1, AMB-1 und MS-1. Alle Süßwasserarten, und alle aus der Gattung magnetospirillum. Es ist ein wesentlicher erster Schritt für jede Art von reproduzierbarer Forschung mit diesen Organismen.Magnetotaktische Bakterien haben einen sehr spezifischen Sauerstoffbedarf, weshalb sie ein magnetisches Navigationssystem entwickelt haben. Es ist daher sehr wichtig, die Menge an Sauerstoff zu kontrollieren, die ihnen zur Verfügung steht. All dieses Protokoll wurde für einige spezifische Stämme von Süßwassermagnetospirilla optimiert.Seine Details können optimiert werden, um den Sauerstoff- und Nährstoffbedarf anderer magnetotaktischer Bakterien zu decken. Installieren Sie sicher einen Stickstoff-Gastank in der Nähe einer Bank, auf der genügend Platz zum Aufstellen der Stickstoffstation vorhanden ist. Schließen Sie ein Stück Schlauch an den Tank an, der lang genug ist, um den Bereich zu erreichen, in dem die Station gebaut wird.Falls erforderlich, tragen Sie Teflonband am Ausgang des Tanks auf, um Leckagen zu vermeiden. Um eine Station zu bauen, die in der Lage ist, fünf Flaschen Medium gleichzeitig zu sprudeln, schneiden Sie vier Stück Schläuche von ungefähr fünf Zentimeter n Länge. Montieren Sie die Rohre in einer Linie mit drei 3-Wege-T-förmigen Kunststoffarmaturen.Verbinden Sie ein Ende dieser Leitung mit dem Schlauchstück am Ausgang des Stickstofftanks durch eine zusätzliche T-förmige Armatur. Fügen Sie am anderen Ende einen 90-Grad-Ellenbogenanbau hinzu. Verwenden Sie Klebeband, um die Struktur an einer horizontalen Metallstange zu befestigen, die ungefähr 30 Zentimeter über der Bank platziert ist.Verbinden Sie fünf Schlauchstücke von ca. 20 Zentimetern Länge mit den drei Ausgängen der installierten Armaturen. Entfernen Sie die Kolben von fünf Ein-Milliliter-Kunststoffspritzen, und schneiden Sie das größere Ende dieser Spritzen, wobei nur das abgestufte Teil beibehalten wird. Füllen Sie diese Spritzen mit Baumwolle, wobei Sie darauf achten, nicht zu fest zu verpacken.Legen Sie die Spritzen in die 20 Zentimeter langen vertikalen Schläuche ein. Schalten Sie das Gas ein, und verwenden Sie Seifenwasser, um sicherzustellen, dass es kein Leck gibt, wenn Stickstoff fließt. Entfernen Sie die Kappen von fünf 25-Meter-Nadeln und legen Sie diese Nadeln in 10-Zentimeter-Stücke von dünnen Schläuchen.Befestigen Sie die vorbereiteten Nadeln an den Spritzen der Stickstoffstation. Stellen Sie sicher, dass Stickstoff durch alle fünf Leitungen fließt, und halten Sie die Station in Bereitschaft. Bereiten Sie eine 10-Millimolar-Ferriccitrat-Lösung vor, indem Sie 0,245 Gramm Eisencitrat zu 100 Milliliter destilliertem deionisiertem Wasser hinzufügen.Erhitzen und rühren, bis eine orange klare Lösung erhalten ist. Autoklaven Sie die Lösung mit einem Standardzyklus von mindestens 15 Minuten Belichtungbeiszeit bei 121 Grad Celsius, bevor Sie die sterilisierte Lagerlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln lagern. Um fünf Flaschen flüssiges Wachstumsmedium für MSR-1 vorzubereiten, fügen Sie die in einem Textprotokoll aufgeführten Chemikalien zu einem Becher hinzu, der 300 Milliliter destilliertes deionisiertes Wasser enthält.Die Zugabe der sterilen Eisencitrat- und Minerallösungen muss unter der Flamme eines Bunsenbrenners mit sterilen Techniken erfolgen. Sterile Bedingungen sind unerlässlich, um eine Kontamination der Kultur durch andere Bakterienarten zu vermeiden. Nach Zugabe aller Chemikalien den pH-Wert mit einer mollaren Natriumhydroxidlösung auf 7,0 einstellen.Das frisch zubereitete Medium in 125-Milliliter-Serumflaschen geben und 60 Milliliter Medium in jede Flasche gießen. Blasen Sie Stickstoff 30 Minuten lang in das Medium, um den gelösten Sauerstoff mit den kleinen Schläuchen zu entfernen, die mit der Stickstoffstation verbunden sind. Legen Sie einen Butylkautschukstopfen auf jede Flasche und lassen Sie eine kleine Öffnung, damit das überschüssige Gas die Flasche verlassen kann.Nach 30 Minuten versiegeln Sie jede Flasche mit dem vorbereiteten Stopfen und einer Aluminiumdichtung. Die Aluminiumdichtung sorgt dafür, dass die Flasche während des restlichen Protokolls versiegelt bleibt. Trennen Sie die Nadeln und die dünnen Schläuche von der Stickstoffstation und ersetzen Sie sie durch saubere Nadeln.Stellen Sie die Ventile des Stickstofftanks so ein, dass ein sanfter, kontinuierlicher Gasfluss aus dem Tank austritt. Legen Sie nun eine der mit dem Stickstofftank verbundenen Nadeln durch den Gummistopfen in eine Flasche Medium ein. Legen Sie sofort eine weitere saubere Nadel in dieselbe Flasche ein.Wiederholen Sie diesen Schritt für die anderen Flaschen, und lassen Sie Stickstoff für etwa 30 Minuten fließen, um die Luft in den Flaschen durch Stickstoff zu ersetzen. Trennen Sie nach 30 Minuten eine Flasche von der Stickstoffstation, indem Sie die entsprechende Nadel entfernen. Warten Sie einige Sekunden, bis der Druck in der Flasche Medium auf atmosphärischen Druck abnimmt, und entfernen Sie die zweite Nadel.Wiederholen Sie diesen Schritt für alle verbleibenden Flaschen. Um 120 Milliliter halbfestes Wachstumsmedium für MSR-1 vorzubereiten, bedecken Sie den Becher mit Aluminiumfolie und autoklavieren Sie die im Textprotokoll beschriebene Lösung. Kurz vor dem Ende des Autoklavenzyklus eine frische 4%Cystein-Lösung vorbereiten und den pH-Wert mit einer fünfmollaren Natriumhydroxidlösung auf 7,0 einstellen, wie im Textprotokoll beschrieben.Nach dem Autoklavieren das Medium auf 50 bis 60 Grad Celsius abkühlen lassen und den Becher unter die Flamme eines Bunsenbrenners bringen. Entfernen Sie die Aluminiumfolie und fügen Sie schnell die im Textprotokoll aufgeführten Chemikalien mit sterilen Techniken unter sanftem Rühren hinzu. Fügen Sie 1,2 Milliliter Filter sterilisierte Cystein-Lösung.Nach Zugabe aller Chemikalien, übertragen Sie das warme Medium in 16 Milliliter sterile Schraubverschluss Hungate Rohre. 12 Milliliter des Mediums in jedes Rohr geben und die Rohre versiegeln. Um die Stämme MSR-1, AMB-1 und MS-1 in flüssigem Medium zu impfen, flamen Sie die Oberteile der Sauerstoff- und frischmedium Flaschen, indem Sie Ethanol auf die Stopfen auftragen und sie durch die Flamme eines Bunsenbrenners durchqueren.Mit einer sterilen Spritze und einer Nadel einen Milliliter Sauerstoff aus der Sauerstoffflasche extrahieren und in die frische Mittelflasche geben. Wenn Sie das Inokulum aus einer anderen Kultur verwenden, das in einer Glasflasche angebaut wird, flamen Sie beide Flaschen. Dann impfen Sie einen Milliliter der älteren Kultur in das frische Medium.Die Kultur bei 32 Grad Celsius bebrüten und nach vier bis sieben Tagen in ein frisches Medium einfließen lassen. Um MSR-1 im Sauerstoffgradienten zu impfen, halbfestes Medium, überprüfen Sie, ob das Rohr des frischen Mediums eine klar definierte OAI anzeigt, die durch eine rosa bis farblose Schnittstelle etwa ein bis drei Zentimeter unter der Oberfläche des Mediums materialisiert wird. Wenn das Inokulum aus einer anderen Sauerstoffkonzentration Gradient semisolid Kultur kommt, ernten Sie die Bakterien durch Ansaugung 50 Mikroliter der Kultur mit einer sterilen Pipettenspitze auf dem Band von den Bakterien gebildet platziert.Impfen Sie diese Bakterien am OAI langsam im frischen Medium, um eine Störung der Schnittstelle zu vermeiden. Versiegeln Sie die Röhre und lassen Sie die Bakterien zwischen 25 Grad Celsius und 30 Grad Celsius wachsen. Um sicherzustellen, dass die Bakterien sowohl magnetisch als auch modal sind, legen Sie einen Tropfen Kultur auf mikroskopische Abdeckung Schlupf.Drehen Sie den Deckel-Slip, und installieren Sie ihn auf einem O-Ring, der auf einer Glasrutsche ruht. Stellen Sie sicher, dass der Tropfen die untere Folie nicht berührt. Legen Sie den hängenden Tropfen unter das Mikroskop und konzentrieren Sie sich auf eine Kante des Tröpfchens.Platzieren Sie den Südpol eines Magneten in der Nähe dieser Kante, und beobachten Sie, wie die Bakterien in Richtung randschwimmen. Drehen Sie den Magneten, um sie in die entgegengesetzte Richtung schwimmen zu lassen. Hier sind die Flaschen mit flüssigen Medien vor der Impfung und nach dem Bakterienwachstum zu sehen.Trübung in der zweiten Flasche zeigt an, dass Bakterien wachsen. Dieser zweifache beschleunigte Film zeigt das erwartete Ergebnis eines Hängendrop-Experiments für eine modale und magnetische magnetotaktische Bakterienkultur. Die Bakterien schwammen zunächst an den Rand des Tröpfchens, wenn ein Magnetfeld aufgebracht wird.Wenn die Feldrichtung des Magneten umgekehrt ist, schwammen die Bakterien von der Kante weg, wo das Magnetfeld aufgebracht wird. Gezeigt werden hier Röhren von semifestem Medium vor der Impfung und nach bakteriellem Wachstum. Wie erwartet bildet sich an der oxisch-anoxischen Schnittstelle ein Bakterienband, das im Laufe der Zeit wandert, wenn Sauerstoff verbraucht wird und die Schnittstelle nach oben bewegt.Hier ist eine repräsentative Elektronenmikroskopie eines magnetischen Spirillums zu sehen. Die Flagella werden durch die schwarzen Pfeile angezeigt, während die roten Pfeile die Magnetosomen zeigen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, sich daran zu erinnern, dass magnetotaktische Bakterien sehr spezifische Sauerstoffgehaltsanforderungen haben, um sowohl richtig zu wachsen als auch Magnetoszuzin zu produzieren.Dieses Protokoll zeigt, wie der Sauerstoffgehalt in den Wachstumsmedien kontrolliert und überwacht wird, um die von diesen Organismen bevorzugten Mikrobedingungen zu erreichen. Nach dieser Methode können hohe Konzentrationen gesunder und hochmagnetischer Zellen erreicht werden. Auf diese Weise können Experimente durchgeführt werden, die große Mengen an Bakterien erfordern, wie magnetosome Extraktion, genomische und genetische Studien, oder Beobachtung der kollektiven Bewegung durch Mikroskopie.Die Möglichkeit, magnetotaktische Bakterien im Labor anzubauen, ist wirklich das, was es Wissenschaftlern ermöglicht hat, systematisch die faszinierenden biochemischen und physikalischen Eigenschaften dieser Organismen zu erforschen.

growing-magnetotactic-bacteria-genus-magnetospirillum-strains-msr-1

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mama ist eine einzigartige Magnetosom assoziierten Protein, das nachweislich in Magnetosomen Aktivierung beteiligt sein sollte. Hier präsentieren wir die Aufreinigungsprotokolls von Mama Deletionsmutante (MamAΔ41)...

Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41

Quelle: Le Nagard, L., et al. Wachsende magnetotaktische Bakterien der Gattung Magnetospirillum: Stämme MSR-1, AMB-1 und MS-1. J. Vis. Exp. (2018).Dieses Video zeigt, wie Magnetospirillum-Bakterien unter mikroaeroben Bedingungen sowohl mit flüssigen als auch mit halbfesten Medien kultiviert werden können. Es zeigt die Bildung einer sichtbaren Bakterienbande an der oxisch-anoxischen Grenzfläche und deren Aufwärtswanderung, wenn der Sauerstoff erschöpft ist. Das Video zeigt auch, wie man das...

Züchtung von Magnetospirillum-Bakterien und Bewertung ihres magnetotaktischen Verhaltens

Wir demonstrieren eine Methode, um magnetotaktischen Bakterien (MTB), die natürlichen Gewässern angewendet werden können sammeln. MTB isoliert und angereichert werden von Sedimentproben mit einem relativ einfachen Setup, das zu Nutze macht die Bakterien die natürlichen Magnetismus. Isolated MTB können anschließend im Detail sowohl mit Licht-und Elektronenmikroskopie untersucht werden.

Collection, Isolierung und Anreicherung von natürlich vorkommenden Magnetotaktische Bakterien aus der Umwelt

Matrixgestützte Laserdesorption/Ionisationszeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) und molekulare Techniken (16S rRNA-Gensequenzierung) ermöglichen die Identifizierung seltener bakterieller Krankheitserreger in der Routinediagnostik. Das Ziel dieses Protokolls liegt in der Kombination beider Techniken, die zu genaueren und zuverlässigeren Daten führt.

Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

Ein Protokoll für die Synthese und Kationisierung von Kobalt-dotiertem Magnetoferritin wird vorgestellt, sowie eine Methode zur schnellen Magnetisierung von Stammzellen mit kationisiertem Magnetoferritin.

Synthese von kationisiertem Magnetoferritin für ultraschnelle Magnetisierungs von Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, funktionale Nanosensoren für die Portable, kostengünstig, zu synthetisieren und schnelle Erkennung von gezielt pathogene Bakterien durch eine Kombination von magnetischen Entspannung und Fluoreszenz Emission Modalitäten.

Foodborne Krankheitserreger Screening mit Magneto-fluoreszierende Nanosensor: Schnellnachweis von E. Coli O157: H7

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