Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Protein-Interaktionsfeld zu beantworten, z. B. ob Protein direkt an ein kleines oder ein großes Molekül bindet. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es einfach und schnell ist, direkte Wechselwirkungen auf atomarer Ebene zu erkennen. Schalten Sie den Luftstrom mit dem Auswurfbefehl ej ein.

Dadurch wird die Probe vom Magneten nach oben gebracht. Platzieren Sie nun die Probe in einem Spinner auf dem Magneten in der Öffnung. Einfügen mit dem Befehl ij.

Warten Sie, bis sich die Probe im Inneren des Magneten absetzt, bevor Sie fortfahren. Erstellen Sie ein neues Dataset mit dem Befehl edc und laden Sie Standardproton NMR-Parameter, indem Sie das Experiment ZGPR auswählen. Geben Sie die Felder NAME, Experimentnummer und verarbeitete Datenordnernummern ein.

Wählen Sie das Lösungsmittel im Feld Set-Lösungsmittel aus und klicken Sie auf Getprosol ausführen, um Standard-Sondenkopf- und lösungsmittelabhängige Parameter zu lesen. Sperren Sie die Probe mit dem Befehl Lock an das deuterated Lösungsmittel und warten Sie, bis sie mit dem Sweep abgeschlossen ist und die Sperre erreicht wird. Korrigieren Sie die Resonanzfrequenz des Magneten, indem Sie die Probe mit dem automatischen Tuning-Befehl atma abstimmen.

Überwachen Sie die Wackelkurve, bis die automatische Abstimmung abgeschlossen ist. Shim das Magnetfeld mit Topshim. Shimming nimmt die Anpassung an das Magnetfeld vor.

Erzielen Sie Dieuniformität um die Probe herum. Es ist empfehlenswert, dies in Werten mit dem Befehl wsh zu speichern und sie mit rsh vor topshim zu lesen, wenn die gleichen oder ähnliche Beispiele verwendet werden. Passen Sie nun die Empfängerverstärkung mit dem befehl rga an, um das maximale Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen.

Platzieren Sie die Mitte des Spektrums auf dem Wasserresonanzversatz, und stellen Sie den 90-Grad-Protonenimpuls mit calibo1p1 auf hohe Leistung ein. Sammeln Sie das Protonenspektrum mit dem Befehl zero go zg und verarbeiten Sie es mit efp. Dazu gehören exponentielle Multiplikation, der freie Induktionszerfall mit Linienverbreiterung, Fourier-Transformation von FID und pk zur Anwendung der Phasenkorrektur.

Wenden Sie die automatische Phasenkorrektur apk und die automatische Baseline-Korrektur absn mit dem Polynom ohne Integrationsoption an. Erstellen Sie ein neues Dataset für das SOFAST HMBC-Experiment, indem Sie im Experiment SFHMQC3GPPH auswählen. Kopieren Sie die optimierten P1 und O1 aus dem Protonenspektrum und füllen Sie P1-abhängige Impulse mit dem Befehl getprosol 1H p1 plw1, wobei p1 der optimierte P1-Wert und plw1 die Leistungsstufe für P1 ist. Optimieren Sie nun die CNST54-Konstante, um den Offset für die chemische Verschiebung im Amid einzustellen.

Optimieren Sie auch CNST55, um die Bandbreite zu definieren, um die spektralen Bereiche von Interesse zu umfassen, so dass die Empfängerverstärkung optimiert werden kann. Um diese Parameter auszuwählen, extrahieren Sie die erste FID aus dem zweidimensionalen Spektrum und suchen Sie nach dem beobachteten Signal, um sie zu definieren. Darüber hinaus variieren Sie die Entspannungsverzögerung, die Anzahl der Scans und Dummy-Scans, um eine akzeptable Signalempfindlichkeit mit dem Befehl gs zu erhalten, der es go and scan ermöglicht, die Datenqualität in Echtzeit zu überwachen.

Notieren Sie schließlich die Spektren mit Zero Go zg. Legen Sie die Verarbeitungsparameter auf die Größe der direkten F2- und indirekten F1-Dimensionen des Spektrums fest, mit optionaler linearer Vorhersage in der indirekten Dimension. Wählen Sie QSINE als Fensterfunktion aus und geben Sie eine Sinusglockenverschiebung von zwei ein, um das zweidimensionale Spektrum zu verarbeiten.

Geben Sie den Befehl xfb ein, um die Daten in beide Richtungen mit Fensterfunktion und Fourier-Transformation zu verarbeiten. Verwenden Sie den Befehl apk2d, um die automatische Phasenkorrektur in beide Richtungen durchzuführen. Korrigieren Sie die Baseline mit der automatischen Baseline-Korrekturfunktion abs2 für 2D-Daten.

Dies wendet eine Polynomfunktion zwischen den in den Verarbeitungsparametern definierten ppm-Werten an und erzeugt ein 2D-Spektrum für die weitere Analyse. Wenn Sie eine serielle Verarbeitung zum Vergleich von Interaktionsdaten mit einem anderen Molekül planen, speichern Sie die Verarbeitungsparameter mit dem Befehl wpar und rufen Sie sie mit rpar ab. Geben Sie den Befehl pp ein, um den Prozess der Spitzenauswahl zu beginnen.

Definieren Sie den ppm-Bereich, die minimale Intensität und die maximale Anzahl von Spitzen basierend auf erwarteten Spitzen. Klicken Sie dann auf OK. Überprüfen Sie die Ergebnisse durch visuelle Inspektion. Führen Sie den Prozess bei Bedarf erneut aus, bis die Ergebnisse aufgrund der Spektrenqualität zufriedenstellend sind.

Generieren Sie eine Spitzenliste mit dem Befehl pp. Diese Spitzenliste enthält standardmäßig Datenhöhen- und Spitzenintensitätsinformationen. Die Peak-Liste kann in nachfolgende Spektren exportiert und von anderen Programmen gelesen werden.

Beobachten Sie nun das Protein HSQC-Spektren für Veränderungen der Spitzenintensitäten oder Bewegungen in chemischen Verschiebungen, die auf eine Wechselwirkung mit einem anderen Molekül hinweisen. Wenn das interagierende Molekül groß ist, erwarten Sie Eine Verringerung der Spitzenintensitäten zusammen mit dem Verschwinden einiger Spitzen. Importieren Sie die Spitzenliste in den nächsten Datensatz, indem Sie auf die Registerkarte Peaks klicken und importieren sie mit einem Rechtsklick im Peaks-Fenster auswählen.

Visualisieren Sie die Spitzen über dem Spektrum und verschieben Sie sie bei Bedarf in neue Positionen. Klicken Sie auf Reset-Intensitäten für eine vollständige Tabelle, um eine Spitzenliste für das Spektrum zu generieren, das Intensitäten enthält. Diese Spitzenliste überträgt die Positionsinformationen aus der gespeicherten Peak-Liste.

Exportieren Sie die Spitzenlisten aus verschiedenen Datasets zur Analyse in eine Kalkulationstabelle oder ein anderes mathematisches Programm, indem Sie die Exportfunktion auswählen. Berechnen Sie die Veränderung der Spitzenintensitäten mit der Funktionsspitzenintensität im komplexen Spektrum, der Spitzenintensität im Proteinspektrum für jeden Peak. Werte können durch Multiplikation mit 100 in prozentuale Änderung konvertiert werden.

Beachten Sie, dass Spitzenvolumen ebenfalls nützlich sind, obwohl Spitzenintensitäten für Spitzen, die nahe beieinander positioniert sind, leichter zu messen sind, wie dies normalerweise bei Proteinen mit einer hohen Dichte von relativ breiten Spitzen der Fall ist. Die N15HSQCs wurden für den Wildtyp E-PRD sowie den R1914E Mutanten in Gegenwart oder Abwesenheit von VimRod erworben. Das Spektrum der Wilden-Typ E-PRD zeigt die erwartete Anzahl von gut gelösten Spitzen, was auf ein richtig gefaltetes Protein hindeutet.

In Anwesenheit von VimRod zeigt das Spektrum eine umfangreiche Linienverbreiterung und das Verschwinden von Spitzen, was der Bindung zwischen E-PRD und VimRod entspricht. Zwischen dem Spektrum der R1914E Mutante allein und nach Zugabe von VimRod wird kaum eine Veränderung beobachtet, was auf einen Mangel an Bindung an diese mutierte E-PRD hindeutet. Hier wurden die E-PRD-Spitzenintensitäten in Gegenwart und Abwesenheit von VimRod verglichen und als relative Spitzenintensitäten dargestellt, um den Bereich der Spitzenerweiterung im E-PRD-Komplex anzuzeigen.

Um die Bindung von VimRod und E-PRD zu validieren und zu quantifizieren, wurde die MST-Analyse mit His6-VimRod, die mit fluoreszierendem RED-Tris-NTA-Farbstoff als Ziel gekennzeichnet ist, mit abnehmenden Konzentrationen des E-PRD-Ligands durchgeführt. Die Daten passten zu einem Standardmodell der einteiligen Ligandenbindung und ergaben einen KD von 25,7 plus oder minus 2,1 Mikromolaren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, identische Erfassungs- und Verarbeitungsbedingungen zu verwenden.

wird wegen des Zugangs zu Isotopen-markierten Proteinproben für die Sammlung von NMR-Spektren kämpfen. Die Implikationen dieser Technik reichen auf die Therapie von Krebs, Infektion oder neurodegenerativen Erkrankungen, weil sie die Bildung von Protein-Wechselwirkungen beinhalten, die in der Krankheit beeinträchtigt sind.