Name: Pflanzen Sie Wachstum und Agrobakterium-vermittelten Floral-Dip Transformation des Extremophyte Schrenkiella parvula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Agrobakterium-vermittelte Floral-Dip-Transformation von Schrenkiella parvula. Dieses Protokoll ermöglicht stabile transgene Linien für Studien zur Anpassung von Pflanzen an extreme Umgebungen.

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Diese Arbeit wurde durch den National Science Foundation Award MCB 1616827 unterstützt.

1. Pflanzenwachstum
<ol><li>
Samen Sterilisation (optional)
	<ol>
<li>Bereiten Sie 50 % Bleichmittel in bidestilliertem Wasser (DdH2O) mit 1 oder 2 Tropfen eines nichtionischen Waschmittels (siehe Tabelle der Materialien) in einem 50 mL-Tube. Invertieren Sie das Rohr mehrmals, um die Lösung zu mischen. Hinweis: Es empfiehlt sich, Samen Sterilisation in einem Laminar-Flow Kabinett mit einer UV sterilisierte Oberfläche für 15 min durchzuführen.</li>
		<li>Fügen Sie das Bleichmittel-Lösung auf ~ 100 – 200 S. Parvula Samen in einer 1,5 mL Tube. Mischen Sie gründlich und lassen Sie den Schlauch für 5 Minuten sitzen.</li>
		<li>Entfernen Sie das Bleichmittel aus dem Rohr zu, und fügen Sie 70 % Ethanol. Die Samen durch Pipettieren mehrmals waschen und dann die Ethanol-Lösung sofort entfernen.</li>
		<li>Waschen Sie die Samen in sterilisierten Wasser, überschüssige Bleichmittel und Ethanol zu entfernen, dann entfernen Sie das Wasser. Wiederholen Sie diesen Schritt 5 bis 6 Mal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Samen Schichtung
	<ol>
<li>Die Samen in sterilisierten Wasser tauchen und für 5 bis 7 Tage bei 4 ° c lagern Alternativ getrocknete sterilisierte Saat direkt auf nassem Boden und das Boden-Tablett für 5 bis 7 Tage bei 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Anbau von Pflanzen in Vorbereitung der transformation
	<ol>
<li>Füllen Sie der Boden mischen (siehe Tabelle der Materialien), 7 x 6 cm2 Töpfe, die Töpfe in Wasser einweichen und sprühen Sie Wasser von oben ein gleichmäßig nass Wachstumsmedium sicherzustellen. Fügen Sie 5 – Dünger Perlen (siehe Tabelle der Materialien), auf der Bodenoberfläche von jedem Pot. Hinweis: Soweit wir erfahren haben, wächst S. Parvula gut auf jede Erdmischung, wo A. Thaliana wachsen kann.</li>
		<li>Mit einem nassen Zahnstocher übertragen 20 ~ 25 Samen pro Topf auf der Bodenoberfläche. Hinweis: Eine bequeme Methode ist, legen Sie einen Stapel von 4 – 5 Samen in den vier Ecken und die Mitte des Topfes (Abbildung 1, Tag 15, linken).</li>
		<li>Decken Sie die Topf-Tablett mit eine klare Kuppel, die Samen während der Keimung unter hoher Luftfeuchtigkeit zu halten.</li>
		<li>Halten Sie die Pflanzentrays in einer Kammer Wachstum mit eine Lichtintensität auf 130 µmol m−2 s−1 Licht, 22 – 24 ° C Temperatur und 14 h pro Tag/10 h pro Nachtzyklus festgelegt. Entfernen Sie die Kuppeln ca. 7-10 Tage nach Keimung. Fügen Sie Wasser aus dem Boden der Schale, Boden befeuchtet gleichmäßig auf einem wünschenswerten Niveau zu halten.</li>
		<li>Merzen Sie zusätzliche Sämlinge und lassen Sie nur 4 – 5 gesunde Setzlinge pro Topf gut getrennt voneinander unterscheiden (Abbildung 1, Tag 15, rechts).</li>
		<li>Sanft alle zwei Tage gießen und düngen mit 0,2 x Hoagland Lösung16 einmal alle zwei Wochen. Hinweis: Die Bodenfeuchte auf einem gleichmäßigen Niveau zu halten ist der Schlüssel zu wachsenden S. Parvula konsequent und gesund.</li>
		<li>Weiter wachsen die Pflanzen für 8 – 10 Wochen bis mehrere Blütenstände 100 – 150 Blume Knospen pro Pflanze (Abbildung 1, Tag 60 – 80) produzieren. Am Tag geplant für die floral-förmige Basis Transformation (Schritt 4.5) entfernen Sie alle Reifen und den Entwicklungsländern Siliques aus den Pflanzen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Klonen das Gen/genomische Element von Interesse in einen Vektor Pflanzentransformation
<ol><li>Verstärken der Ziel-DNA-Fragment mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR)17 und isolieren das PCR-Produkt mit einer Gel-Extraktion kit (siehe Tabelle der Materialien) entsprechend der Kit-Protokoll oder eine andere geeignete Methode, DNA mit Agarosegel zu reinigen Elektrophorese17,18. Überprüfen Sie die Reihenfolge der isolierten PCR-Produkt durch Sanger-Sequenzierung19.</li>
	<li>Klon der gewünschten PCR-Produkt in den Klonen Vektor und Transformation der geklonte Konstrukt in kompetente E. Coli Zellen durch ein Topoisomerase-basierte Klonen kit (siehe Tabelle der Materialien) nach Herstellerangaben.</li>
	<li>50 µL Verarbeitungsprodukte auf Luria-Bertani20 (LB) Agar Bakterienwachstum Medien (Tabelle 1) mit geeigneten Antibiotika zu verbreiten z.B.., 50 µg / mL Spectinomycin (siehe Tabelle der Materialien), und bei 37 ° c inkubieren C über Nacht.</li>
	<li>Am nächsten Tag wählen Sie 5 – 10 einzelne Kolonien, in LB-Flüssigmedium mit geeigneten Antibiotika zu impfen und mit sanft schütteln über Nacht bei 37 ° C inkubieren.</li>
	<li>Isolieren Plasmide mit einem Plasmid-Isolierung kit (siehe Tabelle der Materialien) sowie durch Sanger-Sequenzierung19 zu prüfen, ob die Zielsequenz verstärkt in 2.1 ordnungsgemäß geklont wird.</li>
	<li>Übertragen der geklonte und verifizierte PCR-Produkt zu einem Ziel-Vektor für Pflanzentransformation kompatibel mit Rekombination basierende Klonen (siehe Tabelle der Materialien), mit einer Rekombinase-Enzym-Mix kit (siehe Tabelle der Materialien), im folgenden Anweisungen des Herstellers des Kit. Wiederholen Sie ab Schritt 2.3 Schritt 2.5 zu isolieren und Klone beherbergen richtige Plasmid Konstrukte zu überprüfen.</li>
</ol>3. Umwandlung der Vektor konstruieren für Pflanzentransformation in Agrobacterium tumefaciens
<ol><li>A. Tumefaciens Stamm GV3101:pMP90RK21, die eine Rifampicin-Resistenz-Gen für chromosomale Hintergrundauswahl birgt verwandeln Sie das Plasmid des Vektor-Konstrukts von 2,6. Verwenden Sie geeignete Antibiotika, z. B. Gentamycin oder Kanamycin (siehe Tabelle der Materialien), für die Auswahl der Anlage konstruieren Transformation (Ti-Plasmid). Ein kurzes Protokoll für A. Tumefaciens Transformation durch Elektroporation ist in Abschnitt 3.2 enthalten.</li>
	<li>
A. Tumefaciens Transformation durch Elektroporation
	<ol>
<li>A. Tumefaciens kompetente Zellen22 auf Eis auftauen. Mix 0,1 – 1 µg des Plasmids vorbereitet von 2,6, aufgelöst in 1 – 2 µL DdH2O, mit kompetenten Zellen auf Eis. Übertragen Sie die Mischung in eine Küvette Elektroporation (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Elektroporation auf die Mischung von Plasmiden und kompetente Zellen von 3.2.1, mit einer Electroporator durchführen (siehe Tabelle der Materialien) nach den Richtlinien des Herstellers. Hinweis: Reinigen Sie die Oberfläche der Küvette, vor Beginn der Elektroporation.</li>
		<li>Übertragen das Reaktionsgemisch aus der Küvette zu einem Microcentrifuge Schlauch, der enthält 1,5 mL des flüssigen LB und mischen Sie gut mit pipettieren und Inkubation für 1 h bei 28 ° C mit sanft schütteln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impfen die transformierten A. Tumefaciens aus Abschnitt 3.2 auf LB-Platten mit entsprechenden Auswahl Antibiotika (z. B. Kanamycin 25 µg / mL, Spectinomycin 50 µg / mL, Gentamycin 25 µg / mL und Rifampicin 50 µg / mL) und 3 Tage bei 28 ° C inkubieren.</li>
</ol>4. Agrobakterium-vermittelte Umwandlung von S. parvula
<ol><li>Impfen die Single verwandelt Kolonien von Platten in 10 mL LB flüssiger Medien mit Antibiotika (die gleichen wie in 3.3) in einem steril 50 mL konische Rohr (siehe Tabelle der Materialien). 24 h in einem schütteln Inkubator inkubieren (siehe Tabelle der Materialien) auf 250 u/min. bei 28 ° C.</li>
	<li>Übertragen Sie die bakterielle Lösung von 3.4.1 auf eine sterile 250 mL Flasche, fügen Sie 40 mL LB flüssiger Medien mit geeigneten Antibiotika hinzu und inkubieren Sie 12 h bis die Extinktion bei 600 nm Wellenlänge (OD600) etwa 2,0 erreicht.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie der A. Tumefaciens Cultureat 3.100 X g für 10 min. Entfernen des Überstands und wieder unterbrechen Sie die Bakterienkultur in 40 mL A. Tumefaciens eindringen Lösung (Tabelle 1).</li>
	<li>Verdünnen Sie die resuspendierte A. Tumefaciens eindringen Lösung für eine endgültige OD600 von 0,8. 50 mL verdünnten A. Tumefaciens 25 µL Tensid-Lösung (Tabelle 1) hinzufügen Lösung und Mix durch invertieren mehrmals.</li>
	<li>Tauchen Sie den Blütenstand der Pflanzen in der A. Tumefaciens Lösung 20 S. Verwendung einer frischen bakterielle Lösung nach dem Eintauchen Blütenstand aus sechs Töpfen im Abschnitt 4.4 vorbereitet. Stellen Sie sicher, dass alle Blumen in Kontakt mit der Lösung sind. Pipettieren bakterielle Lösungen direkt auf Blumen befindet sich im unteren Teil des Blütenstandes, wenn sie in die Lösung eingetaucht werden können nicht. Hinweis: Achten Sie für die Erstrunden-Transformation darauf, alle Reifen und den Entwicklungsländern Siliques mit einem scharfen Skalpell oder kleine Schere entfernen. Entfernen Sie Siliques nicht, wenn Verwandlung zum zweiten Mal durchführen.</li>
</ol>5. Post-Transformation Pflanzenpflege und die zweite Verwandlung
<ol><li>Legen Sie die Pflanzen Blumen getaucht horizontal in sauberen Schalen mit Kuppeln, abdecken der Pflanzen und in einem dunklen Wachstum-Zimmer für 1 – 2 Tagen. Hinweis: Halten die Blumen unter hoher Luftfeuchtigkeit ist wichtig in dieser Phase (Abbildung 1, Pflanzen nach der Transformation).</li>
	<li>Die Pflanzen in eine aufrechte Position zurück und übertragen Sie die Pflanzen auf ein Wachstum Zimmer mit 14 h pro Tag/10 h pro Nacht-Zyklus, 130 µmol m-2 s-1 Lichtintensität und 22 bis 24 ° C Temperatur.</li>
	<li>Überwachen Sie die eingetauchte Blütenstände in der Folgewoche. Wenn eine erhebliche Anzahl von Blumen (Abbildung 2) abbrechen, wiederholen Sie die florale Dip (Schritt 4) nach etwa 4 Wochen, oder wenn eine große Anzahl von Blumen neu entwickelt haben. Hinweis: Im Gegensatz zu der Vorbereitungsschritt für die erste Umwandlung (Schritt 1.3.7) entfernen Sie keine Vorerkrankungen oder Entwicklung von Siliques (Abbildung 2) vor dem zweiten Wahlgang der Transformation.</li>
	<li>Wachsen Sie die Pflanzen, bis die Samen reif und die Ernte Samen ~ 21 Wochen.</li>
	<li>Trockene Samen für 2 – 3 Wochen bei Raumtemperatur in einem luftdichten Behälter mit gefüllt mit Trockenmittel (siehe Tabelle der Materialien).</li>
</ol>6. Auswahl der positiven Transformanten
<ol><li>Pflanzen Sie die T1-Samen, wie für Wildtyp Samen in Schritten 1.2 bis 1.3 beschrieben.</li>
	<li>Wachsen Sie die Pflanzen, bis die ersten 2 Laubblätter, ca. 10 – 14 Tage nach der Keimung entwickeln.</li>
	<li>
Führen Sie die erste Auswahl für Herbizid-Resistenz (Abbildung 3A und 3 b) siehe unten.
	<ol>
<li>Verdünnen Sie das Herbizid Glufosinat-Ammonium (11,3 %) (oder BASTA) (Tabelle 1), 1:1,000 (V/V). Die Sämlinge sprühen Sie BASTA Lösung verdünnt auf und decken Sie die Pflanzen mit Kuppeln über Nacht.</li>
		<li>BASTA Spritzen 2 – 3 Mal wiederholen alle 5-7 Tage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Durchführen Sie die zweite Auswahl mit einem BASTA-Drop-Test wie unten beschrieben.
	<ol>
<li>Pflanzen, die nach 3 – 4 Mal mit BASTA Lösung besprüht überleben zu identifizieren. Wachsen Sie die Pflanzen, für weitere 2 – 3 Wochen bis 3 – 5 Blätter eine relativ große Fläche entwickeln.</li>
		<li>Wählen Sie die größte Reifen Blatt pro Pflanze, reiben Sie die Oberfläche des Blattes vorsichtig mit einem Finger die Wachsschicht entfernen, und geben Sie einen Tropfen der verdünnten Lösung BASTA (aus Schritt 6.3.1). Hinweis: Markieren Sie die Stelle des Blattes, indem eine Papier-Klebeband auf den nächsten Stamm mit BASTA Tropfen angewendet.</li>
		<li>Überwachen Sie die Blätter mit der BASTA-Tropfen auf Anzeichen von welken bis zu eine Woche lang angewendet. Wählen Sie die Pflanzen mit Blättern von BASTA-Tropfen nicht betroffen. Hinweis: Blätter von Pflanzen am meisten falsch-positiven beginnen zu welken innerhalb von zwei Tagen, während die Blätter von wahr-positive intakt sind, auch nach oben (Abb. 3C) die Tropfen BASTA Lösung trocknet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bestätigen Sie positive Transformanten mittels genomic PCR.
	<ol>
<li>Sammeln Sie 2 – 3 Blätter aus den überlebenden Pflanzen bei Schritt 6.4.5.</li>
		<li>Die Blätter mit CTAB Methode23 oder eine andere entsprechende DNA-Extraktion extrahieren Sie genomischen DNA.</li>
		<li>Durchführen Sie PCR mit extrahierten genomische DNA-Proben von Ziel-Pflanzen, Wildtyp Pflanzen (als Negativkontrollen) und das Plasmid-Konstrukt aus dem Schritt 3.1 (als Positivkontrolle). Verwenden Sie ein entsprechende paar PCR Primer spezifisch für das selektive Marker-gen, z. B., für BASTA-resistente Gene (Bar), TCAGCAGGTGGGTGTAGA (vorwärts) und GTCAACCACTACATCGAGACAA (rückwärts).<ol>
<li>Für die Beispiel-PCR-Primer auf das Bar -gen, verwenden die folgenden PCR-Bedingungen: der erste Denaturierung Schritt bei 98 ° C für 30 s; gefolgt von 30 Zyklen der Denaturierung bei 98 ° C für 30 s, Glühen bei 59 ° C für 30 s und Verlängerung bei 72 ° C für 30 s; und die letzte Erweiterung bei 72 ° C für 5 Minuten. Hinweis: Um die Einfügung der gesamten T-DNA zu gewährleisten, empfehlen wir Ihnen auch Durchführung von genomic PCR mit PCR-Primer von selektiver Marker-gen und ein weiterer PCR Primer spezifisch für die Zielsequenz auf der Anlage Transformationsvektor im Schritt geklont</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bestätigen Sie das Vorhandensein von der erwarteten Größe des verstärkten Bar PCR Produktes durch Agarose-Gel-Elektrophorese-17 für die Ziel-Proben (Abb. 4A) sowie durch Sequenzierung der isolierten PCR Produkt19 mit das gleiche Verfahren wie in Schritt 2.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der physiologische Zustand der Anlage beeinflusst maßgeblich die Effizienz der Umwandlung25. Die Verwendung von gesunde und kräftige Pflanzen für die Transformation ist eine wesentliche Voraussetzung für erfolgreiche Transformation in S. Parvula. Wasser oder leicht gestresste Pflanzen haben weniger Blüten, die im Vergleich zu den gesunden Pflanzen ideal für Transformation (Abbildung 1, Mittelkonsole). S. Parvula kann bei einer Lichtintensität wachsen...

In diesem Protokoll beschreiben wir das Wachstum und die Schaffung von stabilen transgenen Linien für das Extremophyte Modell Schrenkiella Parvula. Die Verfügbarkeit eines effizienten Transformation-Systems ist ein Markenzeichen von jedem vielseitige genetisches Modell. Pflanzen, die in extremen Umgebungen, bezeichnet als Extremophytes, liefern eine wichtige Ressource für das Verständnis Pflanze Anpassungen an Umweltbelastungen. Schrenkiella parvula (ehemals Thellungiella Parvula und Eutrema Parvulum) ist ein solches Extremophyte-Modell, mit der Erweiterung genomischer Ressourcen1,2,3,4,5. Jedoch wurden Umwandlung Protokolle nicht noch für S. Parvula in veröffentlichten Studien berichtet.
Das Genom von S. Parvula ist das erste veröffentlichte Extremophyte Genom in Brassicaceae (Senf-Kohl-Familie) und zeigt eine umfangreiche allgemeine Genom trägt mit dem nicht-Extremophyte Modell, Arabidopsis Thaliana1. So könnten Vergleichsstudien zwischen A. Thaliana und S. Parvula profitieren aus der Fülle der genetischen Studien auf A. Thaliana zu informativen Hypothesen über wie das Genom S. Parvula reguliert entwickelt und hat anders zur Bewältigung betont extremer Umwelt5,6,7. S. Parvula ist eines der am meisten salztoleranten Arten (basierend auf Boden NaCl LD50) unter bekannten wilden Verwandten von A. Thaliana8. Neben der NaCl-Toleranz S. Parvula überlebt und seines Lebenszyklus in Anwesenheit von mehreren Salzionen in hohen Konzentrationen giftig für die meisten Pflanzen7vervollständigt. In Reaktion auf die abiotischen betont in seinem natürlichen Lebensraum weit verbreitet hat es verschiedene Merkmale entwickelt, unter denen mehrere biochemische oder physiologische Ebene 8,9,10untersucht worden sind, 11.
Seit 2010 über 400 Peer-getestet-Publikationen, die als ein Zielarten S. Parvula verwendet oder im Vergleich mit anderen Pflanzengenomen verwendet. Jedoch konnte ein klare Engpass identifiziert werden, mit einem genaueren Blick der welche Art von Studien sind durchgeführt worden. Die meisten dieser Berichte die mögliche Verwendung von S. Parvula in zukünftigen Studien zu diskutieren oder in vergleichende genomische oder Phylogenomic Studien verwenden. Aufgrund des Fehlens eines Proof-of-Concept-Transformation-Protokolls eingerichtet für S. Parvula, es nicht in funktionelle Genomik Studien, trotz des Habens eines der höchsten Qualität Pflanzengenomen bisher verfügbaren verwendet wurde (> 5 Mb Contig N50) montiert und kommentiert in Chromosom-Ebene Pseudomolecules1.
Floral-Dip Transformationsmethode Agrobakterium-vermittelten geworden die meisten allgemein verwendeten Methode zum Erstellen von Trasngenic Linien in A. Thalianaund eine reproduzierbare System Transformation entwickelte sich ein kritischer Faktor für seinen Erfolg als eine genetischen Modell12,13. Nicht alle Brassicaceae Arten ist jedoch nachweislich erfolgreich umgewandelt werden mit der floral-Dip-Methode für A. Thalianaentwickelt. Speziell, wurde die Brassicaceae Lineage II-Arten, die S. Parvula gehören widerspenstigen bis floral-Dip nach Umwandlung Methoden14,15.
Die unbestimmten Blüte Wuchsform von S. Parvula, kombiniert mit seiner schmalen Blatt Morphologie machte es schwierig, die standard Agrobakterium-vermittelten floral-Dip Transformationsmethode zu verabschieden. In dieser Studie berichten wir über das geänderte Protokoll, die, das wir für reproduzierbare Transformation von S. Parvulaentwickelt haben.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-762</td><td>Bacto Agar Soltungsmittel, BD Diagnostics</td></tr><tr><td>B5 Vitamine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1019</td><td>Gamborg' s Vitaminlösung</td></tr><tr><td>Trockenmittel</td><td>W A Hammond Drierit, Xenia, OH</td><td>22005</td><td>Anzeige von DRIERIT 6 mesh</td></tr><tr><td>Zielvektor für die Pflanzenumwandlung</td><td>TAIR</td><td>Vektor:6531113857</td><td>pKGWFS7</td></tr><tr><td>Elektroporationsküvette</td><td>USA Scientific</td><td>9104-5050</td><td>Elektroporationsküvette, runder Deckel, 0,2 cm Spalt</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA</td><td>1652100</td><td>MicroPulser Elektroporator</td></tr><tr><td>Düngerperlen</td><td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td><td>N/A</td><td>Osmocote Smart-Release Pflanzennahrung&nbsp; Blume & </td></tr><tr><td>Extraktionskit für pflanzliches Gel</td><td>iNtRON Biotechnology, Boston, MA</td><td>17289</td><td>MEGAquick-spin DNA-Aufreinigungskit für Gesamtfragmente</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1914-5G</td><td>Gentamicinsulfat</td></tr><tr><td>Glufosinat-Ammonium (11,3%) Herbizid (BASTA)</td><td>Bayer Environmental Science, Montvale, NJ</td><td>N/A</td><td>FINALE Herbizid</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>200004-444</td><td>Kanamycin-Monosulfat</td></tr><tr><td>MES</td><td>Bioworld, Dublin, OH</td><td>41320024-2</td><td>MES, Freies saures</td></tr><tr><td>MS-Salz</td><td>MP Biomedicals, Santa Anna, Kalifornien</td><td>092621822</td><td>Hoaglands modifiziertes Basalsalzgemisch</td></tr><tr><td>N6-Benzylaminopurin (BA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>B3274</td><td>6-Benzylaminopurin-Lösung</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Alrich</td><td>S7653</td><td>Natriumchlorid</td></tr><tr><td>Nichtionisches Detergens</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>9005-64-5</td><td>TWEEN 20&nbsp;</td></tr><tr><td>Plasmid-Isolationskit</td><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>D4036</td><td>Zyppy Plasmid-Kits</td></tr><tr><td>Rekombinase-Enzym-Mix-Kit</td><td>Life Technology</td><td>11791-020</td><td>Gateway LR Clonase II Enzym-Mix</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>R3501-1G</td><td>Rifampicin, Pulver, 
&#8805; 97% (HPLC)</td></tr><tr><td>Schüttel-Inkubator</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SHKE4450</td><td>MaxQ 4450 Tisch-Orbitalschüttler</td></tr><tr><td>Erdmischung</td><td>Sun Gro</td><td>SUN239223328CFLP</td><td>Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>IC15206705</td><td></td></tr><tr><td>Sterile konische 50-ml-Röhrchen</td><td>USA Scientific, Ocala, FL</td><td>1500-1811</td><td>50 mL konische Schraubverschlussröhrchen, Copolymer, Racks, sterile</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>57-50-1</td><td>Saccharose, ACS</td></tr><tr><td>Tensidlösung</td><td>Lehle seeds, Round Rock, TX</td><td>VIS-02</td><td>Silwet L-77</td></tr><tr><td>Topoisomerase-basiertes Klonierungskit</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td>K240020</td><td>pENTR/D-TOPO Klonierungskit, mit One Shot TOP10 chemisch kompetent E. coli</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-282</td><td>BD Bacto Trypton, BD Biosciences</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-722&nbsp;</td><td>BD Bacto Hefe Extrakt, BD Biosciences</td></tr></tbody></table>

pflanzen sie wachstum und agrobakterium-vermittelten floral-dip transformation des extremophyte schrenkiella parvula

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella Parvula ist eine Extremophyte, die verschiedenen abiotischen Belastungen ausgesetzt, darunter mehrere Ionen-Toxizität betont angepasst. Trotz hoher Qualität genomischer Ressourcen zur Verfügung zu studieren, wie Pflanzen sich an ökologischen anpassen betont seinen Wert als ein Modell der funktionellen Genomik und Werkzeug hat durch das Fehlen eines Systems möglich Transformation beschränkt worden. Wir berichten in diesem Protokoll wie stabile transgenen S. Parvula erzeugt Linien mit einem Agrobakterium-vermittelten floral-Dip Verfahren. Wir modifiziert das Umwandlung Protokoll A. Thaliana , um einzigartige Merkmale von S. Parvula, wie eine unbestimmte blühenden Gewohnheit und eine hohe epikutikulären Wachsgehalt auf den Blättern zu berücksichtigen. Kurz, waren S. Parvula Samen bei 4 ° C für fünf Tage vor der Aussaat stratifiziert. Pflanzen wurden angebaut an eine Photoperiode 14 h Licht und dunkel 10 h und eine 130 µmol m-2s-1 Lichtintensität, bei 22 ° C bis 24 ° C. Acht bis neun Wochen alten Pflanzen mit mehreren Blütenständen wurden für die Transformation ausgewählt. Diese Blütenstände wurden in einer Infiltration-Lösung von Agrobacterium Tumefaciens GV3101 tragen das Plasmid pMP90RK getaucht. Wir führten zwei Runden der Blume mit einem Intervall von drei bis vier Wochen zur Steigerung der Effizienz der Umwandlung eintauchen. Die T1-Samen wurden gesammelt und getrocknet für vier Wochen in einem Behälter mit Trockenmittel, bevor Keimung zum Bildschirm für Kandidaten Linien umgewandelt. Widerstand gegen BASTA diente T1 Pflanzen auf den Bildschirm. Die BASTA-Lösung besprüht wir dreimal mit einem Abstand von drei Tagen ab zwei Wochen alten Pflanzen, Fehlalarme zu reduzieren. Ein BASTA Drop durchgeführt wurde auf die Überlebenden Einzelpflanzen um wahre positive Transformanten zu identifizieren. Die Transformationseffizienz war 0,033 %, 3 – 4 transgene Pflanzen pro 10.000 T1 Samen vermehrt nachgeben.

Wir entwickelt eine Umwandlung Protokoll, die Ernte T0 Samen innerhalb von 150 Tagen kann, mit einer floralen-Dip-Methode aus, die für A. Thalianamodifiziert. Abbildung 1 zeigt eine Zusammenfassung der Chronik und S. Parvula Pflanzen, die die optimale Bühne für die Ausführung der Transformation durch blumig-Dip darstellen. Wir 70 –80 S. Parvula Blumenpflanzen in mehrere Blütenstände bei 60 bis 80 Tage nach der Keimung als...

Agrobakterium-vermittelten Transformation mit einem floral-Dip-Methode kann erfolgreich eingesetzt werden, stabilere transgene Linien des Modells Extremophyte Schrenkiella Parvulaerstellen. Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll aus, die für Arabidopsis Thaliana, unter Berücksichtigung verschiedener Wachstum Gewohnheiten und physiologischen Eigenschaften der Extremophyte modifiziert.

Pflanzen Sie Wachstum und Agrobakterium-vermittelten Floral-Dip Transformation des Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Diese Methode, ein reproduzierbares Transformationsprotokoll für Schrenkiella parvula, kann helfen, Fragen auf dem Gebiet der pflanzenvergleichenden und funktionellen Genombildung zu beantworten, insbesondere Studien zur Untersuchung von Pflanzenanpassungen an raue Umgebungen. Diese Technik ermöglicht untersuchungen Routinefunktionen in Schrenkiella parvula an der Extremophyten an Multiionensalzspannungen angepasst. Es ermöglicht auch vergleichende Studien, die auch auf seine nahen Verwandten, die Mutter Aribidopsis Thaliana betrachtet.Der Vergleich von Schrenkiella Parvula mit Aribidopsis Thaliana kann Einblicke in Varianzen in der Genregulation und -funktion geben, die die einzigartige Anpassung von Schrenkiella parvula ermöglichen. Das Transformationsprotokoll für Arabidopsis Thaliana ist bereits etabliert. Die Methode ermöglicht nun vergleichende Studien mit transgenen Schrenkiella Parvula-Pflanzen.Im Allgemeinen Forscher neu zu dieser Methode wird wegen der blühenden Gewohnheit und der Blattmorphologie von Schrenkiella Parvula Pflanzen kämpfen, die effektive Transformation mit einem Flora Dip sowie die Auswahl von wahren Transformationsmitteln schwierig machen. Um zu beginnen, verwenden Sie einen nassen Zahnstocher, um etwa 20 bis 25 S.Parvula Samen auf nassen Boden zu übertragen. Dann schichten Sie die Samen bei vier Grad Celsius für fünf bis sieben Tage.Nach der Schichtung, geben Sie die Samen in die Wachstumskammer für sieben bis zehn Tage. Sobald alle Sämlinge gekeimt sind, lassen Sie nur einen Sämling in jeder der vier Ecken und in der Mitte der Töpfe. Wachsen Sie die Pflanzen für acht bis zehn Wochen in der Wachstumskammer, bis sie blühen.Wählen Sie am Tag der Transformation S.Parvula-Pflanzen gemäß dem Textprotokoll aus. Verwenden Sie Zangen und kleine Scheren, um alle bestäubten Blütenstände zu entfernen, die sich bereits zu Siliques entwickeln. Nachdem die Pflanzen fertig sind, bereiten Sie eine Agrobacterium-Infiltrationslösung vor.Danach tauchen Sie den S.Parvula Blütenstand in agrobacterium Infiltrationslösung für 20 Sekunden. Hier ist das früheste Stadium der Pflanzen, die für die Transformation verwendet werden können, solange bereits entwickelte Siliques vor der Transformation entfernt werden, können ältere Pflanzen mit mehr Blüten verwendet werden. Nach der Umwandlung, legen Blumen getaucht etenzten Pflanzen horizontal in saubere Schalen mit Kuppeln, um die Pflanzen zu bedecken.Dann legen Sie die Pflanzen für ein bis zwei Tage in einen dunklen Wachstumsraum. Bringen Sie die Pflanzen in eine aufrechte Position zurück und übertragen Sie sie in den Wachstumsraum. In der darauffolgenden Woche, überwachen Sie die getauchten Blütenstände.Zehn Tage nach dem ersten floralen Dip werden Die S.Parvula-Pflanzen immer wieder neue Blütenstände und Sikörnungen produzieren. Eine zweite Runde von floralen Dip kann durchgeführt werden, um die neu entstehenden Blütenstände weiter zu transformieren. Wachsen Sie die Pflanzen, bis die Samen reifen, und ernten Sie die Samen etwa 21 Wochen.Trocknen Sie die Samen für zwei bis drei Wochen bei Raumtemperatur in einem luftdichten Behälter mit Trockenmitteln gefüllt. Pflanzen Sie die T-ein-Samen gemäß dem Textprotokoll. Wachsen Sie die Pflanzen, bis sich die ersten zwei bis drei echten Blätter entwickeln.Um die erste Auswahl für Herbizidresistenz durchzuführen, verdünnen Sie Glufosinat-Ammoniumherbizid und sprühen Sie es auf die Sämlinge. Bedecken Sie die Sämlinge über Nacht mit den Kuppeln. Legen Sie die Schalen zurück in den Wachstumsraum, und entfernen Sie die Kuppel.Warten Sie, bis die meisten Sämlinge durch das Herbizid ausgewählt sind. Um mit der zweiten Auswahl zu beginnen, identifizieren Sie die Pflanzen, die überleben, nachdem sie drei- bis viermal mit der BASTA-Lösung besprüht wurden. Nach dem Anbau der Pflanzen für zwei bis drei weitere Wochen, wählen Sie das größte reife Blatt auf jeder Pflanze.Als nächstes reiben Sie die Oberfläche des Blattes vorsichtig mit einem Finger, um die Wachsschicht zu entfernen. Dann einen Tropfen der verdünnten BASTA-Lösung auf das Blatt legen. Überwachen Sie die mit der BASTA-Lösung behandelten Blätter bis zu einer Woche lang auf Anzeichen von Welken.Wählen Sie schließlich die Pflanzen mit Blättern, die von den BASTA-Tropfen nicht betroffen sind, zur weiteren Analyse aus. In diesem Protokoll wurde S.Parvula mit Agrobacterium mit einer floralen Dip-Methode transformiert. Eine Infektion mit Agrobacterium führte zur Abtreibung einiger Blumen.Die S.Parvula-Pflanzen produzierten jedoch nach dem ersten Blütentauchen weiterhin neue Blüten und konnten wieder verwandelt werden. Mit den BASTA-Sprüh- und Falltests können echte positive Transformationsmittel genau identifiziert werden. Die Anzahl der mit PCR-Bestätigung getesteten Proben kann reduziert werden.Während diese Methode der Transformation von Arabidopsis Thaliana ähnelt, ist es wichtig, sich an die Unterschiede im Wachstum und der Morphologie von Schrenkiella Parvula zu erinnern. Das Ändern des Protokolls, um diese Unterschiede widerzuspiegeln, ist für eine erfolgreiche Transformation von entscheidender Bedeutung. Diese Technik könnte Forschern helfen, die Evolution genomischer Variationen zu erforschen, die zu mehreren Salzspannungsanpassungen im Extremophytenmodell Schrenkiella Parvula führen.Kombination dieser Technik mit den Informationen über die Funktionen von Aradopsis Thaliana, einer weiteren Pflanze, die eng mit Schrenkiella Parvula verwandt ist. Die Forscher können die Unterschiede in der Regelung und Funktionen untersuchen, dass dies zwei unterschiedliche Strukturen zwischen diesen beiden Arten sind. Während des Transformationsprozesses ist es wichtig, die gesamte Agrobacterium-Infiltrationslösung in autoklavierbaren Behältern zu enthalten.Sterilisieren und entsorgen Sie alle Materialien, die mit Agrobacterium in Berührung kamen, einschließlich Handschuhe, Makropipettenspitzen und Papiertücher.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dieser Artikel veranschaulicht die floral-dip-Methode...

Floral-dip Transformation von Arabidopsis thaliana Zum Untersuchen PTSO2: β-Glucuronidase Reporter Gene Expression

Quelle: Lee, H. et. al., Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors, die während der Infektion von Bakterien abgegeben werden. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt eine Methode zur Überwachung der bakteriellen Infektion und der Verabreichung von Effektorproteinen in Pflanzenzellen unter Verwendung der Komplementation des grün fluoreszierenden Superordners (sfGFP) in Kombination mit konfokaler Mikroskopie. Der Ansatz ermöglicht eine präzise Visualisierung der...

Überwachung der bakteriellen Infektion und der Verabreichung von Effektorproteinen in Pflanzenzellen

In diesem Video demonstrieren wir die Erzeugung von transgenen Arabidopsis-Pflanzen, die durch Agrobacterium-vermittelte binäre bakterielle künstliche Chromosomen-basierte Gentransformation stabiles Transgen exprimieren.

Binäre bakterielle künstliche Chromosomenvektor-basierte Gentransformation in Arabidopsis-Pflanzen: Eine Technik zur Erzeugung transgener Pflanzen mit Single-Copy-Insertion

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Flachs Transformation unter Verwendung von Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation über Blumen-dip. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen und kostengünstig ist, aber ergibt eine höhere Transformationsrate als die derzeit verfügbaren Methoden für Flachs Transformation.

Floral-Dip Transformation von Flachs ( Linum usitatissimum), Um Transgene Progenies mit hoher Umwandlungsrate generieren

Mit einem pBIBAC-GW binären Vektor macht Erzeugung transgene Pflanzen mit intakten Single Copy Einfügungen, ein einfacher Vorgang. Hier präsentiert eine Reihe von Protokollen, die führen des Lesers durch den Prozess der Generierung von transgenen Pflanzen in Arabidopsis und Versuchsanlagen für Unversehrtheit und Anzahl der Einsätze zu kopieren.

Generierung von transgenen Pflanzen mit Single-Copy-Einschübe mit binären Vektor BIBAC-GW

Fluoreszierende Protein-basierte Ansätze, Effektoren abgesondert von Bakterien in Wirtszellen zu überwachen sind anspruchsvoll. Dies ist aufgrund der Inkompatibilität zwischen fluoreszierende Proteine und die Typ-III-Sekretion-System. Hier wird eine optimierte Split Superfolder GLP-System zur Visualisierung von Effektoren abgesondert von Bakterien in die Wirtszelle Pflanze verwendet.

Split-grün fluoreszierendes Protein System Effektoren geliefert von Bakterien während der Infektion zu visualisieren

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle, Kartoffelpflanzen zu verwandeln. Die Agrobacterium Tumefaciens Transformation führt zu einer kompletten transgenen Pflanze Agrobacterium Rhizogenes transgenen behaarte Wurzeln in einem Wildtyp-Shooting produziert, die selbst propagiert werden kann. Wir erkennen dann Promotoraktivität von GUS Färbung in den transformierten Wurzeln.

Agrobacterium Tumefaciens und Agrobacterium Rhizogenes-vermittelte Umwandlung der Kartoffel und die Promotoraktivität eines Suberin-Gens durch GUS Staining

Hier präsentieren wir einfach zu bedienende Protokolle zur Herstellung und Reinigung von Diterpenoid-Metaboliten durch die kombinatorische Expression biosynthetischer Enzyme in Escherichia coli oder Nicotiana benthamiana, gefolgt von chromatographischem Produkt reinigung. Die resultierenden Metaboliten eignen sich für verschiedene Studien, einschließlich molekularer Strukturcharakterisierung, Enzymfunktionsstudien und Bioaktivitätstests.

Ein anpassbarer Ansatz für die enzymatische Produktion und Reinigung von Diterpenoid Naturprodukten

Dieses Protokoll beschreibt die Nutzung der Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Transformation (AMT) zur Integration von Genen von Interesse in das Kerngenom der grünen Mikroalge Chlorella vulgaris, was zur Produktion stabiler Transformanten führt.

Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Gentechnik von Grünen Mikroalgen, Chlorella vulgaris

Wir präsentieren ein effizientes, optimiertes Protokoll für die Agrobacterium-vermittelte Transformation einer asexuellen amphibischen Brassicaceae-Art, Rorippa aquatica, ohne ressourcenintensive sterile Gewebekulturverfahren. Durch die Nutzung eines visuellen Transformationsmarkers und einer Triebregenerationspipeline wurden erfolgreich nahe klonale Transformanten erzeugt und somit zukünftige Studien zur Anpassung der Pflanzen an die Unterwasserumgebung vorangetrieben.

Effiziente, regenerationsbasierte Agrobakterien-vermittelte Transformation einer asexuellen amphibischen Brassicaceae-Art, Rorippa aquatica

Wir präsentieren ein einfaches, wirksames und reproduzierbares Protokoll für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Phytophthora palmivora, das auch auf P. capsici  anwendbar ist.

Eine vereinfachte Methode zur agrobakterie-vermittelten Transformation von Phytophthora palmivora

Erfahren Sie die Agrobakterium-vermittelte Floral-Dip-Transformation von Schrenkiella parvula. Dieses Protokoll ermöglicht stabile transgene Linien für Studien zur Anpassung von Pflanzen an extreme Umgebungen.

Pflanzen Sie Wachstum und Agrobakterium-vermittelten Floral-Dip Transformation des Extremophyte Schrenkiella parvula

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