Digitale Analyse der Immunostainierung von ZW10 Interacting Protein in menschlichen Lungengeweben

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der pathologischen und immunhistochemischen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass schneller genug und das produziert digitale Medien mit hoher Qualität. Beginnen Sie mit der Fixierung einer drei mal drei Zentimeter großen Kung-Gewebeprobe in 4% Paraformaldehyd für 24 Stunden bei Raumtemperatur.

Am nächsten Tag dehydrieren Sie das Gewebe in aufsteigenden Ethanol-Eintauchen bei Raumtemperatur, gefolgt von drei Eintauchen in 100%Xylol für 20 Minuten pro Behandlung. Nach dem letzten Xylol-Eintauchen das Gewebe 30 Minuten lang in 63 Grad Celsius Paraffin geben, gefolgt von einem zweiten 45-minütigen Eintauchen in frisches 63-Grad-Celsius-Paraffin, dann das Paraffin noch einmal für eine letzte einstündige Inkubation wechseln. Wenn das Paraffin abgekühlt ist, verwenden Sie ein Rotationsmikrotom, um fünf mikrometerdicke Abschnitte der paraffineingebetteten Gewebeprobe zu erfassen und die Abschnitte auf 20 Mikrogramm pro Milliliter Poly-L-Lysin-beschichteten Dias zu erfassen.

Zum Entwachsen die Dias für zwei Stunden in einen 65-Grad-Celsius-Ofen geben, anschließend 15 Minuten lang in Dimethylbenzol eintauchen und 15 Minuten in 100%Xylol einweichen und dann die Dias in einer absteigenden Ethanol-Tauchserie rehydrieren. Für Antigen-Reparatur, legen Sie die Dias in eine Antigen-Reparatur-Box und fügen Sie 300 Milliliter Zitronensäure Reparatur Flüssigkeit in die Box. Erhitzen Sie die Box in einer Mikrowelle mit hoher Leistung für zwei Minuten, gefolgt von Einer Erwärmung bei geringer Leistung, um das Kochen für sechs Minuten aufrecht zu erhalten.

Wenn die Dias auf Raumtemperatur abgekühlt sind, waschen Sie die Gewebeproben mit drei fünfminütigen 0,01 Molaren-PBS-Waschungen in einem Drehschüttler bei Raumtemperatur. Um die endogene Peroxidase zu beseitigen, inkubieren Sie die Dias mit 3% Wasserstoffperoxid in doppelt destilliertem Wasser für 30 Minuten in einer nassen Box bei Raumtemperatur. Waschen Sie am Ende der Inkubation die Dias wie gezeigt und stecken Sie jede unspezifische Bindung an jeden Abschnitt mit 100 Mikrolitern 10%Ziegenserum für 39 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Als nächstes beschriften Sie das Gewebe mit 100 Mikroliter Anti-ZWINT-Antikörper n/dia bei vier Grad Celsius über Nacht, gefolgt von drei Wäbungen in 0,01 Molaren PBS. Nach der letzten Wäsche die Dias 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit einem geeigneten Sekundärantikörper bebrüten, gefolgt von drei 0,01 Molaren-PBS-Waschungen. Nach der letzten Wäsche die Dias für 10 Minuten auf 300 Mikroliter frischen DAB geben, gefolgt von einer 10-Sekunden-Wäsche mit Leitungswasser bei Raumtemperatur.

Die Zähler färben das Gewebe mit Hämatoxylin-Färbungslösung für zwei Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von einem 15 Minuten waschen den Wasserhahn in Leitungswasser, dann dehydrieren Sie das Gewebe in aufsteigenden Ethanol-Eintauchen wieder, gefolgt von zwei 15-minütigen Eintauchen in Xylol bei Raumtemperatur. Nach dem letzten 100%Ethanol-Eintauchen die Abschnitte mit 15 Mikrolitern eines 5%Xylols in neutraler Kaugummilösung montieren und jede Gewebeprobe mit einem Deckglas bedecken. Für das automatische Volldia-Scannen der Abschnitte lassen Sie die Dias zunächst 12 Stunden lang bei Raumtemperatur trocknen, um die Gewebeproben zu enttrocknen.

Wählen Sie anschließend im automatischen Volldiascanner Brightfield manuell aus und geben Sie die manuelle Scan-Schnittstelle ein. Überarbeiten Sie den Namen der Folien, und wählen Sie einen Speicherpfad für die Bilder aus. Legen Sie den Scanbereich fest, und wählen Sie die Scanbeispiele mit der Option Benutzer-Schwellenwerte festlegen aus.

Der Schwellenwert liegt bei etwa 50 mit einem Expansionswert für die Scanfläche von 200 Mikrometern. Legen Sie den Scanfokuswert fest, wählen Sie den Modus Automatischer Fokus und Einzelner Layer aus, laden Sie die Folien dann auf den Arbeitsplatz und starten Sie den automatischen Scan. Wenn alle Folien gescannt wurden, speichern Sie die Bilder für eine spätere Analyse.

Um die Bilder der Lungengewebeabschnitte zu analysieren, öffnen Sie die histopathologische Bildanalysesoftware, und wählen Sie Lokalen Computer aus, um die Datei mit den Scandaten zu öffnen. Wählen Sie die entsprechende Zoomstufe aus, und verwenden Sie Die Farbe anpassen, um die Farbe auf den optimalen Kontrast festzulegen, dann die interessenden Bereiche für jedes Bild zu kreisen und zu benennen. Als nächstes wählen Sie unter Plugins QC aus. Der Szenario-Generator wird angezeigt.

Wählen Sie Dichte-Quant und passen Sie die Erkennungsleiste an. Passen Sie die Punktzahlen an, bis die Färbeintensität der eingekreisten Bereiche der der ursprünglichen Bilder ähnelt, und speichern und benennen Sie das Modell als neue Datei, wenden Sie dann das Modell auf andere Folien an und wählen Sie Ausgewählte Anmerkungen aus, damit die Software automatisch die APE-Punktzahl für die Interessenbereiche für jedes Bild berechnet. Das vollständige digitale Scannen von Lungengewebeabschnitten von Tumoren und angrenzenden Nicht-Tumorgeweben von nicht-kleinzelligen Lungenkrebsproben erzeugt digitale Bilder von hoher Qualität.

APE-Scores, die aus diesen Arten von Lungenkrebsproben berechnet werden, sind in der Regel signifikant höher als die für die angrenzenden Nicht-Krebsgewebe ermittelten. Darüber hinaus werden ZWINT-Expressionsniveaus in Plattenepithelkarzinomgewebeabschnitten häufig als signifikant höher als die in Abnokarzinom-Gewebeproben gemessenen Werte ermittelt. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, mit hoher Qualität der Tumor- oder Tumorbereiche während der Herstellung pathologischen Scannen vorzubereiten.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden der Mikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Weder die oder eine andere Methode für pathologisches Scannen. Nach dieser Technik ebnete der Weg für Forscher auf dem Gebiet des pathologischen Scannens, um die digitale Diagnostik im Forschungszweck zu erforschen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Masken sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.