Name: Eine neue einfache Methode zur Messung der Lipophilie (LogP) mit 19F-NMR-Spektroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Lernen Sie eine neue Methode zur Lipophilie-Messung fluorierter Verbindungen mit 19F-NMR-Spektroskopie. Diese einfache Technik erfordert keine exakte Massenbestimmung und ermöglicht präzise LogP-Werte in der medizinischen Chemie.

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Diese Forschung ist als Teil des EPSRC EP/K016938/1 und EP/P019943/1 (ZW, HRF) Zuschüsse und des Schiedsspruchs EPSRC/AstraZeneca Fall Konvertierung (BFJ) finanziert. Der University of Southampton ist für zusätzliche Unterstützung gedankt. Die EPSRC wird weiter für einen Kern Fähigkeit Zuschuss EP/K039466/1 gedankt.

(1) Partitionierung
<ol><li>Hinzufügen 4,4,4-Trifluorobutan-1-Ol (Verbindung X, ca. 6,0 mg) und 2,2,2-Trifluoroethanol (Referenz zusammengesetzte, ca. 3,0 mg) in ein 10 mL birnenförmige Kolben lösen sich in n- Oktanol (HPLC Grade, ca. 2 mL), und fügen Sie Wasser (HPLC-Klasse, ca. 2 mL). Hinweis: Dieses Experiment läuft in dreifacher Ausfertigung. Zusammengesetzte Löslichkeit in Wasser und n- Oktanol muss überprüft werden. Die Menge der Verbindung verwendet für Partition muss sorgfältig geprüft werden, um Übersättigung der Verbindung in jeder Schicht zu vermeiden. Das Massenverhältnis zwischen zusammengesetzten X- und Referenz, die zusammengesetzten Ref auch berücksichtigt werden muss, um das zu vermeiden sind die integrale Verhältnisse ein NMR Probe außerhalb eines 10/1 bis 1/10. Zum Beispiel, wenn es gibt einen Unterschied von < 2 LogP -Einheiten zwischen zusammengesetzten X und Ref, optimale Massenverhältnis kann versichern, dass Integration-Verhältnisse im Wasser und 1-Octanol NMR-Proben innerhalb eines Bereichs von 10/1 bis 1/10. Im Gegensatz dazu, wenn eine Integration-Verhältnis von 50/1 in einer Schicht vorliegt, werden eher relativ größere Fehler bei der Integration für die Peak mit niedriger Konzentration. Die Gleichung unten lässt sich optimal zusammengesetzten Massenverhältnis Vorhersagen: mX / mRef = {(cP X/PRef)-0,5 * (MX/ M-Ref) * [(1 + cPX) / (1 + PRef)]} / (NX / NRef) m, Masse; M, molekulare Masse; N Anzahl der F-Atome; P, Partition Koeffizienten; cP, berechnete Partition Koeffizienten.</li>
	<li>Legen Sie die Flaschen in einen temperierten Behälter über eine Stirplate, und verbinden Sie mit einem umlaufenden Kühlaggregat. Rühren Sie die Mischung biphasische bei 25 ° C für 2 h, unter Rühren Geschwindigkeit bei 600 u/min eingestellt.</li>
	<li>Equilibrate die Mischung bei 25 ° C über Nacht (ca. 16 h), erlauben für komplette Phasentrennung. Hinweis: In einigen Fällen kann eine Schaumbildung zwischen dem n- Oktanol und Wasser Grenze beobachtet werden. In diesem Fall war die Mischung in eine 4 mL Glasflasche übertragen und bis das Verschwinden des Schaums zentrifugiert. Die biphasische Mischung wurde dann wieder links nach equilibrate bei 25 ° C über Nacht.</li>
</ol>(2) NMR Probenvorbereitung
<ol><li>Befestigen Sie den Kolben auf einem Stativ mit einer Klemme.</li>
	<li>Entnehmen Sie eine Aliquote von ca. 0,70-0,85 mL Wasser und n- Oktanol Schichten, mit 1 mL Einwegspritzen aus Kunststoff mit langen Nadeln.<ol>
<li>Ziehen Sie für die Aufnahme des Wassers aliquoten ca. 0,02 mL Luft in die Spritze vor dem setzen der Nadelöhrs in die Mischung. Während der Bewegung die Nadel durch die oberen n- Oktanol Schicht in Wasserschicht, vorsichtig herausdrücken der Luft zu verhindern, dass n- Oktanol Lösung in die Nadel.</li>
		<li>Die lange Nadel aus dem Gemisch zu entfernen. Eine kleine Menge der Wasserprobe, verlassen ca. 0,6 mL Probe links in die Spritze zu verwerfen. Vorsichtig die Nadel mit einem trockenen Tuch abwischen, und ca. 0,5 mL Wasserprobe in ein sauberes Röhrchen NMR injizieren. Schließen Sie schnell die NMR-Röhrchen mit einer Kappe.</li>
		<li>Entfernen Sie für die n- Oktanol-Probe die lange Nadel aus der n- Oktanol Schicht. Eine kleine Menge von n- Oktanol Probe, so dass ca. 0,6 mL Probe links in die Spritze zu verwerfen. Vorsichtig wischen Sie die Nadel mit einem trockenen Tuch ab und injizieren Sie ca. 0,5 mL n- Oktanol Probe in ein sauberes Röhrchen NMR. Schließen Sie schnell die NMR-Röhrchen mit einer Kappe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überprüfen Sie beide n- Oktanol und Wasser-Proben für jede Verunreinigung (z. B.., kleine Tröpfchen von n- Oktanol Wasserprobe oder kleine Tröpfchen von Wasser in n- Oktanol Probe). Hinweis: Ist eine Kontamination, muss die Aliquote Probe wieder bereit aus dem zweiphasigen Gemisch. Da die Messung in dreifacher Ausfertigung erfolgt, ergeben sich sechs NMR Röhrchen.</li>
	<li>Hinzufügen jedes NMR-Röhrchen, 0,1 mL deuterierte Lösungsmittel NMR, die mit n- Oktanol und Wasser mischbar ist (zB., Aceton-d6) Signal Sperren während NMR Erwerb zu ermöglichen.</li>
	<li>Für Verbindungen mit niedrigen Siedepunkten (zB., < 120 ° C), versiegeln die NMR-Röhrchen mit einer Lötlampe und nach dem Abkühlen, invertieren die Röhre auf Lecks prüfen. Sorgfältig Experimente Invert versiegelt oder nicht versiegelte NMR Röhrchen 20 Mal für 19F NMR eine homogene Lösung zu erhalten.</li>
</ol>(3) NMR-Experimente
<ol><li>Mit NMR Parameter Standardeinstellungen ausgeführt (NS 64, D1-1 s, SW 300 ppm, O1P-100 ppm), 19F {1H} NMR-Experimente, chemische Verschiebungen von 4,4,4-Trifluorobutan-1-Ol (Verbindung X) und 2,2,2-Trifluoroethanol (Referenz-Verbindung) in beiden n zu identifizieren - Octanol und NMR Wasserproben.</li>
	<li>Messen Sie die Spin-Gitter-Relaxationszeit (T1) für diagnostische Fluor Kerne mithilfe einer Inversion-Recovery Sequenz22. Messen Sie die Höhe der entsprechenden Puls-Delay-Zeit (D1, als ≥ 5 * T1) aus den erhaltenen T1-Werte für eine genaue quantitative NMR-Integration. Hinweis: Dies ist sehr zeitaufwendig, aber ein D1 60 s für die Wasserprobe Phase und 30 s für die Octanol Phase Probe sind konservative Einstellungen, die sicher zu erfüllen, werden die D1 ≥ 5 * T1 Criterium.</li>
	<li>Führen Sie 19F {1H} NMR-Experimente wieder mit angepasst Parametereinstellungen wie folgt: ein) Verwendung D1 ≥ 5 * T1; (b) Zentrum der Frequenz versetzt Punkt (O1P) zwischen den beiden diagnostischen Fluor-Signalen, also beide Kerne ebenso begeistert werden können; (c) die spektrale Breite (SW) als 300 ppm eingestellt, aber verringern, wenn ein besseres SNR-Verhältnis bei Bedarf; (d) legen Sie die Anzahl der Transienten (NS) als 64 aber erhöhen Sie, wenn höhere SNR erforderlich ist. Hinweis: Nicht entkoppelt 19F NMR-Experimente können auch für die NMR-Datenerfassung verwendet werden. Proton-entkoppelt 19F NMR-Experimente werden jedoch bevorzugt hier, wie es die Fluor-Signale vereinfacht durch das Entfernen der Proton-Fluor-Kupplungen, die auch Signal-Rausch-Verhältnis erhöht. Wir verwenden Inverse-gated Entkopplung um ein entkoppeltes Spektrum ohne nOe (nuclear Overhauser Effekt) Erweiterungen23zu erhalten. Für die quantitative Integration ist ein Signal-Rausch-Verhältnis (≥300) erwünscht. 24
</li>
</ol>4. Datenverarbeitung
<ol><li>Verarbeiten Sie die gewonnenen Daten mit ACD/NMR Prozessor Academic Edition oder andere benutzerdefinierte NMR-Processing-Software.<ol>
<li>Öffnen Sie die NMR-Daten-Datei, und öffnen Sie den Ordner " Pdata ", gefolgt von Ordner 1. Löschen Sie 1r -Datei.</li>
		<li>Zurück zu die NMR-Daten-Datei und ziehen Sie die Fid -Datei in das Fenster der ACD/NMR-Prozessor.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche " WFunctions ", wählen Sie Exponential, LB-Wert als 2festgelegt und klicken Sie auf "OK" .</li>
		<li>Klicken Sie auf Null zu füllen , erhöhen Sie die Punkte zählen , 4 Mal von seiner Ursprünglichen Punkte zählen durch Klicken auf einen kleinen Knopf neben der Anzahl, und klicken Sie auf "OK" -Taste.</li>
		<li>Klicken Sie auf Fourier TR .</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche " Phase ", dann klicken Sie auf Maus pH , klicken Sie und halten Sie die linke Maustaste gedrückt, bewegen Sie die Maus nach vorne oder nach hinten bis die wichtigsten Gipfel des Spektrums richtig eingestellt ist.<ol>
<li>Klicken Sie und halten Sie die Rechte Maustaste gedrückt, bewegen Sie die Maus nach vorne oder nach hinten bis die anderen Peak(s) des Spektrums richtig eingestellt ist. Deaktivieren Sie dann die Schaltfläche " Maus Ph. ", in den spektralen Bereich mit Fluor Gipfeln vergrößern Sie, klicken Sie Fine-Tuning, führen Sie die Phasenkorrektur bei Bedarf wie oben beschrieben, bis alle Gipfel richtig eingestellt sind und klicken Sie auf das Häkchen Schaltfläche ".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Klicken Sie auf die Grundlinie , dann die Schaltfläche " Optionen ". Spektrum von durchschnittlich für automatische Modelle auswählen, stellen Sie die Anzahl der Punkte für die halbe Breite der Box (insbesondere für Spektrum mit niedrigen S/R-Verhältnis), klicken Sie auf "OK" | Auto, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche " ticken ".</li>
		<li>Klicken Sie auf Integration, integrieren Sie die diagnostische Fluor-Gipfel, und klicken Sie auf die Schaltfläche " ticken ". Hinweis: Wenn die integrale Kurve nicht parallel zur Grundlinie ist, klicken Sie auf Bias Korr , und stellen Sie die Neigung und die Neigung die Kurve parallel zur Grundlinie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>N- Octanol und NMR Wasserproben die Integration Verhältnisse einzuholen und in der LogP Berechnung Gleichung (Abbildung 1, GL. 4), zu der LogP -Wert von 4,4,4-Trifluorobutan-1-Ol (Verbindung X) nutzen.</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Protokoll in der Zeitung beschrieben ist eine einfache Methode für LogP Messung von fluorierten Verbindungen. Diese Methode gilt für fluorierte Verbindungen mit einem LogP -Wert von-3 bis 3. Für mehr hydrophil (logP <-3) oder lipophile Verbindungen (LogP > 3), diese Methode kann weiterhin verwendet werden, sondern erfordert viel NMR-Experiment länger als erweiterte Anzahl von transienten erforderlich sind, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten. Daher ist dies eine Einsc...

Lipophilie ist ein wichtige physikalisch-chemische Parameter von Wirkstoffmolekülen, der die Eigenschaften von Wirkstoffkandidaten in vielen Aspekten beeinflusst, einschließlich Wirkstofflöslichkeit, Bioverfügbarkeit und Toxizität1. Lipophilie wird als Logarithmus (LogP) des Verhältnisses der zusammengesetzten Konzentrationen nach Aufteilung zwischen n-Oktanol und Wasser gemessen. Optimale Lipophilie Bereiche sind vorgeschlagen worden, basierend auf statistischen Daten der oral verabreichte Medikamente, von denen die Lipinski "Regel 5 '' das berühmteste Beispiel2,3 ist. In der Tat hat Steuerung Lipophilie wesentlich zur Verbesserung der Aussicht auf eine Medikamenten-Kandidaten gezeigt. Erhöhung der Droge Bindungsaffinität von erhöhten Lipophilie wurde als eines der Hauptprobleme in Drug Discovery Projekte in den letzten Jahrzehnten festgestellt führt zu erhöhten Abrieb Preise3. Daher wurde vermutet, dass erfolgreiche Medikamentenentwicklung mit der molekularen Lipophilie von Wirkstoffkandidaten in optimalen Grenzen zu halten, während die Affinität Optimierung Prozess3,4verbunden ist. In diesem Zusammenhang wurden neue Konzepte (z. B. lipophilen Effizienz Indizes) eingeführte5,6.
Es ist daher von großer Bedeutung, Lipophilie während der Arzneimittelentwicklung genau zu messen. Außerdem ist die Verfügbarkeit von einfache Methoden für die Messung der Lipophilie gefragt als Grundlagenforschung zielt darauf ab, Lösungen für logP Modulation. Derzeit stehen zahlreiche etablierte Methoden Lipophilie Bestimmung1. Der standard "Shake-Kolben (SF)" Methode7und seine Variationen werden häufig eingesetzt, um LogP -Werte direkt zu messen, die in den meisten Fällen abhängig von UV-Vis Spektroskopie zur Quantifizierung. Der Hauptnachteil dieser klassischen SF-Methode ist die arbeitsintensive Natur. Darüber hinaus kann die Bildung von Emulsionen, speziell für hoch lipophilen Verbindungen8,9auftreten. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um solche Probleme, wie z. B. zu umgehen, indem Sie mittels Injektion-Flow-Analyse, Dialyse Schläuche etc.. 9,10. Allerdings ist keine dieser Methoden einfach oder leicht anwendbar in nicht spezialisierten Labors.
Es gibt auch viele indirekte Methoden zur Verfügung, wie z. B. potentiometrische Titration11, elektrophoretische Methoden12,13, RP-HPLC-basierte chromatographische Methoden, Masse-Massenspektrometrie-basierte Methoden14, usw.. Diese sind indirekte Methoden wie der LogP -Werte von Kalibrierkurven gewonnen werden. Unter diesen Verfahren hat die RP-HPLC-Methode verbreitet weil es benutzerfreundlich und zeitsparend ist. Dennoch seine Genauigkeit hängt die Ausbildung gesetzt, die zum Herstellen der Eichkurve verwendet, und die geschätzte Lipophilie richtet sich nach der Partition System verwendet13,15.
Es gibt eine Reihe von 1H NMR-basierte Methoden in der Literatur zur Bestimmung der Lipophilie beschrieben. Mo Et Al. entwickelte eine Methode zur Messung der LogP mit 1H NMR ohne deuterierte Lösungsmittel. Wasser und Oktanol als Partition Lösungsmittel, dienten als Referenzen für die Quantifizierung der gelöste Konzentration in jeder Phase16. Herth und Kollegen berichteten auch einen Ansatz, mit dem die Partition Experiment direkt in ein NMR-Röhrchen wo die NMR-Daten der unteren D2O wässrige Schicht gesammelt wurden vor und nach der Extraktion mit 1-Octanol aufgetreten, um die Verteilung zu erhalten Koeffizient17. Darüber hinaus ausgebeutet Soulsby Et Al. 1H NMR als Analysetool bestimmen die Amplitude der Signale mittels vollständige Reduktion Amplituden-Frequenz-Tabelle-Software. Das Verhältnis der Amplituden in beiden Schichten führte zu der gemessenen Partition Coefficient18. Diese Methoden sind relativ einfach zu verwenden, sondern erfordern häufig die Kalibrierung des selektiven Pulse und Leistungsstufen oder die Verwendung von gradient Pulse signal Selektivität zu gewährleisten geeignete Lösungsmittel Unterdrückung geprägt.
Berechneten LogP (ClogP) Werte für Verbindungen erhalten Sie ebenfalls. Verschiedene Berechnungsmethoden und kommerziell verfügbare Software stehen zur Verfügung. Diese verstopfenP -Werte sind in der pharmazeutischen Industrie gebräuchlich, bei der großen Anzahl von Wirkstoffmolekülen Bewertung. Große Fehler von ClogP -Werte sind jedoch nicht ungewöhnlich,19,20.
Die Anforderungen der UV-Aktivität für die Analyse der Konzentration und die Einrichtung von Kalibrierkurven für LogP Berechnung behindern Forschung Fortschritte auf diesem Gebiet. Dies gilt insbesondere für UV-aktive aliphatischen Verbindungen. Fluorierten aliphatischen Moieties geworden in den letzten Jahren zunehmend attraktiver für Wirkstoff-Design und ihr Einfluss auf die allgemeine Lipophilie der Verbindung ist ein Forschungsthema in unserer Gruppe21. Darüber hinaus ist 19F einen hochsensiblen NMR-aktiven Kern, 19F NMR ein nützliches Werkzeug für die Analyse von fluorierten Verbindungen machen. Es hat auch eine größere chemische Verschiebung Reichweite im Vergleich zu 1H. Daher lohnt es sich, eine einfache Methode für LogP -Ermittlung des UV-aktive fluorierten Verbindungen von 19F-NMR-Spektroskopie zu entwickeln. Daher ist das übergeordnete Ziel dieser Methode praktisch Lipophilie Bestimmung von fluorierten Verbindungen zu erreichen.
Das Grundprinzip unserer 19F NMR-basierte Methode ist einen Verbindung in die Partition Experiment (Abbildung 1)21fluorierten Verweis hinzufügen. Zwischen Wasser und n- Oktanol sind zusammengesetzte X- und Referenz zusammengesetzten (Ref) aufgeteilt. Nach Äquilibrierung, eine Aliquote aus jeder Phase ist ein NMR-Röhrchen berücksichtigt, und 19F NMR-Experimente sind auf beide NMR-Proben laufen. Die Intensität der Fluor-Peaks ist proportional zur Konzentration (C) und die Anzahl der Fluoratome (n) der Verbindungen zu verstärken. Integrale Verhältnisse zwischen zusammengesetzten X und Ref erhalten Sie für beide Phasen. Das Verhältnis in n- Oktanol Schicht ist definiert als ρoctund ρAq für Wasserschicht (GL. 1). Das Verhältnis von ρ Werten entspricht das Verhältnis der Partition Koeffizienten (P) der Verbindung X und Ref (GL. 2). Dies führt zu der letzten Gleichung (GL. 4) für LogP Messung der Verbindung X. Daher, um festzustellen, LogP -Wert von einem unbekannten Verbindung X, nur Integration Verhältnisse (ρoct und ρAq) in beide Schichten benötigt man an 19F NMR gemessen werden.

<table><tbody><tr><td>NMR (400 MHz) mit Bruker 5 mm SEF-Sonde</td><td>Bruker</td><td>n/a</td><td>AVIIIHD400</td></tr><tr><td>NMR (400 MHz) mit Bruker 5 mm SMART Sonde</td><td>Bruker</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>DrySyn Snowstorm Reaktor</td><td>Asynt</td><td>ADS13-S</td><td></td></tr><tr><td>Umlaufkühler</td><td>Asynt</td><td>n/a</td><td>Modell:Grant-LTC2</td></tr><tr><td>Magnetrührplatte</td><td>Asynt</td><td>ADS-HP-NT</td><td></td></tr><tr><td>ACD/NMR-Prozessorsoftware</td><td>ACD/Labs</td><td>n/a</td><td>ACD/NMR-Prozessor Academic Edition oder ACD/Spectrus-Prozessor 2015</td></tr></tbody></table>

eine neue einfache methode zur messung der lipophilie (logp) mit 19f-nmr-spektroskopie

A New Straightforward Method for Lipophilicity (logP) Measurement using 19F NMR Spectroscopy

Fluorierung ist ein wirksames Instrument zur Optimierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften von bioaktiven Substanzen geworden. Eines der Anwendungsgebiete von Fluor-Einführung ist die Lipophilie der Verbindung zu modulieren. In unserer Gruppe sind wir in der Studie über die Auswirkungen der Fluorierung auf Lipophilie der aliphatischen Fluorohydrins und fluorierten Kohlenhydrate interessiert. Diese sind nicht UV-aktiv, was zu einer anspruchsvollen Lipophilie Entschlossenheit. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode zur Messung der Lipophilie fluorierten Verbindungen von 19F-NMR-Spektroskopie. Diese Methode erfordert keine UV-Aktivität. Richtig gelöste Masse, Lösungsmittel und aliquoten Volumen sind auch nicht verpflichtet, gemessen werden. Mit dieser Methode haben wir die Lipophilicities einer großen Anzahl von fluorierten Alkanols und Kohlenhydraten gemessen.

Zwei Sätze von Daten, wie in Abbildung 2-21Experimente gezeigt werden. Mit 2,2,2-Trifluoroethanol als Referenz Verbindung, LogP -Werte wurden für 2-Fluoroethanol und 3,3,3,2,2-Pentafluoropropanol als-0.75 und +1.20, bzw. (Abbildung 2A). Anschließend wurde die Lipophilie des 2-Fluoroethanol wieder, aber mit 3,3,3,2,2-Pentafluoropropanol als Referenz (mit seiner vorherigen experimentell gemessenen L...

Eine neue und unkomplizierte Variante der Shake-Kolben-Methode wurde von 19F-NMR-Spektroskopie für die genaue Lipophilie Messung von fluorierten Verbindungen entwickelt.

Eine neue einfache Methode zur Messung der Lipophilie (LogP) mit 19F-NMR-Spektroskopie

Fluorination has become an effective tool to optimize physicochemical properties of bioactive compounds. One of the applications of fluorine introduction ...

Wir haben eine einfache Methode zur Lipophilitätsmessung von frenetischen Verbindungen mit Fluor NMR entwickelt, die acrid genug ist, um zu reproduzieren wir kleine Unterschiede in der Lipophilie messen. Diese Methode kann verwendet werden, um systematisch die Auswirkungen der Bildung von organischen Verbindungen auf die gelösten veränderungen der Lipophilität zu untersuchen, die in der allgemeinen medizinischen Chemie von Interesse ist. Vorteile dieser Methode sind, dass Verbindungen müssen nicht reaktiv sein, und sie müssen nicht völlig rein sein.Es besteht keine Notwendigkeit, genaue Masse oder Volumen zu messen, und es besteht keine Notwendigkeit, Kalibrierkurven zu erstellen. Es sollte eine geeignete Referenzverbindung gewählt werden, und eine Kreuzkontamination des Aliquot sollte während der Probenahmephase vermieden werden. In diesem Video zeigen wir ihnen die entsprechenden praktischen Fähigkeiten für Probenahme, NMR-Rohrversiegelung und den korrekten Einsatz von NMR-Software für die Datenverarbeitung.Fügen Sie 6,0 Milligramm Compound X und 3,0 Milligramm der Referenzverbindung zu einem 10 Milliliter birnenförmigen Kolben hinzu. Lösen Sie die Verbindungen in etwa zwei Milliliter HPLC-Grade n-Octanol auf und fügen Sie zwei Milliliter HPLC-Wasser hinzu. Legen Sie die Kolben in eine temperaturgeregelte Aufnahme über einer Rührplatte und verbinden Sie sie mit einem Umwälzkühler.Die biphasische Mischung bei 25 Grad Celsius zwei Stunden rühren, wobei die Rührgeschwindigkeit auf 600 RPM eingestellt ist. Gleichgewichte die Mischung bei 25 Grad Celsius über Nacht, um eine vollständige Phasentrennung zu ermöglichen. Befestigen Sie den Kolben mit einer Klemme an einem Retortenständer.Nehmen Sie ein Aliquot von etwa 0,70 bis 0,85 Milliliter aus Wasser- und n-Octanol-Schichten, indem Sie eine Milliliter Einweg-Plastikspritzen mit langen Nadeln verwenden. Für die Einnahme des Wassers aliquot, ziehen Sie etwa 0,02 Milliliter Luft in die Spritze, bevor Sie die Nadel in die Mischung. Während Sie die Nadel durch die obere n-Octanol-Schicht in die Wasserschicht bewegen, drücken Sie die Luft vorsichtig heraus, um zu verhindern, dass die n-Octanol-Lösung in die Nadel eindringt.Entfernen Sie die lange Nadel aus der Mischung. Entsorgen Sie eine kleine Menge Wasserprobe, so dass etwa 0,6 Milliliter der Probe in der Spritze verbleiben. Wischen Sie die Nadel vorsichtig mit trockenem Gewebe ab und injizieren Sie etwa 0,5 Milliliter der Wasserprobe in ein sauberes NMR-Rohr.Schließen Sie das NMR-Rohr schnell mit einer Kappe. Für die n-Octanol-Probe die lange Nadel aus der n-Octanol-Schicht entfernen. Entsorgen Sie eine kleine Menge n-Octanol-Probe, so dass etwa 0,6 Milliliter der Probe in der Spritze zurückbleiben.Nach sorgfältigem Abwischen der Nadel mit trockenem Gewebe, injizieren Sie etwa 0,5 Milliliter der n-Octanol-Probe in ein sauberes NMR-Rohr. Schließen Sie das NMR-Rohr schnell mit einer Kappe. Überprüfen Sie sowohl n-Octanol als auch Wasserproben visuell auf Verunreinigungen aus der anderen Phase.Zu jedem NMR-Rohr 0,1 Milliliter eines deuterated NMR-Lösungsmittels hinzufügen, das sowohl mit n-Octanol als auch mit Wasser mischbar ist, um die Signalsperre während der NMR-Erfassung zu ermöglichen. Bei Verbindungen mit niedrigen Siedepunkten die NMR-Rohre mit einer Blaslampe versiegeln und nach dem Abkühlen das Rohr invertieren, um Leckagen zu überprüfen. Um die versiegelten oder nicht versiegelten NMR-Rohre 20 Mal sorgfältig umzukehren, um eine homogene Lösung für F19-NMR-Experimente zu erhalten.Führen Sie proton entkoppelte Fluor-NMR-Experimente durch, um chemische Verschiebungen von Compound X und der Referenzverbindung sowohl in n-Octanol- als auch in Wasser-NMR-Proben zu identifizieren. Verwenden Sie die Im Textprotokoll aufgeführten NMR-Standardparametereinstellungen. Messen Sie die Spin-Gitter-Entspannungszeit (T1) für diagnostische Fluorkerne mithilfe einer Inversionsrückgewinnungssequenz.Messen Sie den Grad der geeigneten Pulsverzögerungszeit anhand der erhaltenen T1-Werte für eine genaue quantitative NMR-Integration. Führen Sie ein schnelles F19 H1-Spektrum aus, um die Anfangsparameter einzurichten. Messen Sie die 90-Grad-Pulsbreite, legen Sie dann den Parameter für das T1-Messexperiment fest, und führen Sie das T1-Messexperiment mit einer Inversionsrückgewinnungssequenz aus.Führen Sie erneut protonentkoppelte Fluor-NMR-Experimente mit angepassten Parametereinstellungen durch. Stellen Sie D1 ein und zentrieren Sie den Frequenzversatzpunkt zwischen den beiden diagnostischen Fluorsignalen, sodass beide Kerne gleichmäßig angeregt werden können. Legen Sie außerdem die Spektralbreite auf 300 PPM fest, und legen Sie die Anzahl der Transienten auf 64 fest.Passen Sie diese Werte an, wenn ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis erforderlich ist. Verarbeiten Sie die erhaltenen Daten mit ACD NMR Processor Academic Edition oder einer anderen benutzerdefinierten NMR-Verarbeitungssoftware. Öffnen Sie die NMR-Datendatei.Öffnen Sie dann den Ordner pdata, gefolgt vom Ordner 1. Löschen Sie die 1r-Datei. Kehren Sie zur NMR-Datendatei zurück, und ziehen Sie die FID-Datei in das ACD-NMR-Prozessorfenster.Klicken Sie auf die Fensterfunktionsschaltfläche, wählen Sie exponentielle, legen Sie den Linienerweiterungswert als zwei fest, und klicken Sie auf die Schaltfläche okay. Klicken Sie nun auf die Schaltfläche Nullfüllung, erhöhen Sie die Anzahl der Punkte auf das Vierfache der ursprünglichen Punkteanzahl, indem Sie auf eine kleine Schaltfläche neben der Zahl klicken, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Okay". Wählen Sie die Fourier-Transformationsschaltfläche aus.Klicken Sie als Nächstes auf die Phasenschaltfläche, und klicken Sie dann auf die Maus-Phasing-Schaltfläche. Klicken und halten Sie die linke Maustaste, und fahren Sie fort, die Maus vorwärts oder rückwärts zu bewegen, bis der Hauptgipfel des Spektrums ordnungsgemäß gestaffelt ist. Klicken und halten Sie nun die rechte Maustaste gedrückt und bewegen Sie die Maus vorwärts oder rückwärts, bis die anderen Spitzen des Spektrums ordnungsgemäß gestaffelt sind.Klicken Sie dann auf die Maus-Phasing-Taste und zoomen Sie mit den Fluorspitzen in den Spektralbereich. Klicken Sie auf Feinabstimmung, führen Sie die Phasenkorrektur bei Bedarf wie zuvor beschrieben durch, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Tick". Klicken Sie auf die Baseline-Schaltfläche und dann auf die Optionsschaltfläche.Wählen Sie die Spektrummittelung für automatische Modelle aus, passen Sie bei Bedarf die Anzahl der Punkte für die Halbe Breite des Feldes an. Klicken Sie auf okay, auto, und klicken Sie dann auf die Tick-Schaltfläche. Klicken Sie als Nächstes auf Integration, integrieren Sie die diagnostischen Fluorspitzen, und klicken Sie auf die Tick-Schaltfläche.Schließlich erhalten Sie die Integrationsverhältnisse aus n-Octanol- und Wasser-NMR-Proben und verwenden sie in der logP-Berechnungsgleichung, um den logP-Wert von Compound X zu erhalten. Anschließend wurde die Lipophilie von zwei Fluorethanolen erneut bestimmt, jedoch mit 3, 3, 3, 2, 2-Pentafluorpropanol als Referenz. Der gemessene logP-Wert betrug 0,76, wobei im Vergleich zu dem mit 2-2-2-Trifluorethanol als Referenz gemessenen Wert nur eine Differenz von 0,01 logP-Einheiten aufwies.Ebenso ist bei cis-2, 3-difluro-1, 4-Butan-Diol der Unterschied der gemessenen LogP-Werte unter Verwendung von zwei Fluorethanol und seinem Transisomer sehr gering. Dies zeigt eine gute Reproduzierbarkeit, und dass die Auswahl von Referenzverbindung keine Auswirkungen auf die logP-Messung hat. Weitere ausgewählte Beispiele werden hier gezeigt.Alle diese nicht-UV-aktiven allophatischen Verbindungen, von fluorierten Kohlenhydraten bis hin zu Fluorhydrinen, können mit dieser Methode leicht gemessen werden. Andere Proto-NMR-basierte Methoden können verwendet werden, wenn Ihre Verbindung kein Fluor enthält, und wenn die Verbindung UV-Chromofor enthält, dann kann die logP-Messung mit UV-Quantifizierung durchgeführt werden. Die Lipophilität einer breiten Palette von nicht-UV-aktiven Fluorhydrinen und deoxifluonierten Kohlenhydraten wurde gemessen.Die erhaltene Datenbibliothek wurde verwendet, um Trends und Regeln für die Auswirkungen der aliphatischen Fluorierung auf die Lipophilität zu bestimmen. Octanol und Wasser stellen minimale Sicherheitsrisiken dar. Natürlich sollten die Gefahren, die gemessen werden, und die Referenzverbindung immer berücksichtigt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

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Lernen Sie eine neue Methode zur Lipophilie-Messung fluorierter Verbindungen mit 19F-NMR-Spektroskopie. Diese einfache Technik erfordert keine exakte Massenbestimmung und ermöglicht präzise LogP-Werte in der medizinischen Chemie.

Eine neue einfache Methode zur Messung der Lipophilie (LogP) mit ¹⁹F-NMR-Spektroskopie

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