Name: Eine kontrollierte Mausmodell für neonatale Sepsis Biofilm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Lernen Sie die standardisierte Zäkalschlammmethode zur Induktion von neonataler Sepsis bei 7-tägigen Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht reproduzierbare polymikrobielle Infektionsmodelle mit definierten humanen Endpunkten.

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Besonderen Dank an Claire Harrison und der Animal Care Facility in British Columbia Kinder Krankenhaus Research Institute (BCCHR) für ihre Unterstützung in der tierische Arbeit, sowie Dr. Po-Yan Cheng für ihre Führung und Input auf tierische Überwachung und Wohlbefinden.

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+causes+of+child+mortality+in+2000-13%2C+with+projections+to+inform+post-2015+priorities%3A+an+updated+systematic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis.</a> The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).</li>
<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mortality+and+altered+immunity+in+neonatal+sepsis+produced+by+generalized+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis.</a> Shock. 28 (6), 675-683 (2007).</li>
<li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li>
<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+innate+immunity+predisposes+murine+neonates+to+poor+sepsis+outcome+but+is+reversed+by+TLR+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists.</a> Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).</li>
<li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CXC+ligand+10%2FCXC+receptor+3+signaling+in+the+murine+neonatal+response+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis.</a> Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).</li>
<li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+immunity+and+defects+in+the+neonatal+and+elderly+immune+response+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis.</a> Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).</li>
<li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+emergency+myelopoiesis+following+polymicrobial+sepsis+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates.</a> Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).</li>
<li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+emergency+myelopoiesis+and+survival+in+neonatal+sepsis+by+caspase-1%2F11+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation.</a> Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).</li>
<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+IL-17A+attenuates+neonatal+sepsis+mortality+induced+by+IL-18%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).</li>
<li>Fallon, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Program+Cell+Death+Receptor-1-Mediated+Invariant+Natural+Killer+T-Cell+Control+of+Peritoneal+Macrophage+Modulates+Survival+in+Neonatal+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1469(2017).</li>
<li>Young, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+after+induction+of+sepsis+by+cecal+slurry+in+PD-1+knockout+murine+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates.</a> Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).</li>
<li>Rincon, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+pretreatment+with+alum+protects+neonatal+mice+in+sepsis+through+myeloid+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation.</a> Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).</li>
<li>Starr, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+cecal+slurry+preparation+protocol+with+improved+long-term+reproducibility+for+animal+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis.</a> PLoS ONE. 9 (12), e115705(2014).</li>
<li>Hansen, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+in+milk+fat+globule-epidermal+growth+factor-factor+8+exacerbates+organ+injury+and+mortality+in+neonatal+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).</li>
<li>Fujioka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+heme+oxygenase-1+attenuates+the+severity+of+sepsis+in+a+non-surgical+preterm+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22SHOCK%22%5BJournal%5D)">Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model.</a> SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).</li>
<li>Al Asmari, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+quinacrine+against+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats.</a> BMC Nephrology. 18, PMC5273840(2017).</li>
<li>Geng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+gene+expression+profiles+and+signaling+pathways+in+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+depletion+ameliorates+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Experimental+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice.</a> Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).</li>
<li>Nara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluations+of+lipid+peroxidation+and+inflammation+in+short-term+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).</li>
<li>Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure%3A+determinants+and+characteristics+of+the+injury-induced+hyperinflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).</li>
<li>Olfert, E. D., Godson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+Endpoints+for+Infectious+Disease+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).</li>
<li>Canadian Council on Animal Care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+on%3A+choosing+an+appropriate+endpoint+in+experiments+using+animals+for+research%2C+teaching+and+testing%22">Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing</a>. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).</li>
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<li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+for+establishing+humane+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">A systematic approach for establishing humane endpoints.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).</li>
</ol>

Dr. James Wynn erhält Unterstützung von National Institute of Health (NIH) / Nationales Institut der allgemeinen medizinischen Wissenschaften (R01GM128452) und der NIH /Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) () R01HD089939).

Postnatale neugeborene Mäusen haben sehr begrenzte Mobilität und nicht, um sich gleich danach auf den Rücken gesetzt wird, auch wenn unangefochten. Von DOL 7, im Alter von Mäusen, die in diesem Modell in Frage gestellt eine Palette von Bewegung – von Rechte-Mobile bis hin zu FTR-Mobile verzeichneten unangefochten Mäuse mit einem wichtigen Unterschied, nämlich, dass eine unangefochtene Maus in diesem Alter nicht FTR-lethargisch Verhalten angezeigt. Nur Mäuse mit Biofilm Sepsis in Frage gestellt wurden, werden beobachtet FTR-träge; Diese Antwort kann eine Markierung der Schwere der Erkrankung. Der Cut-off von einem 90°-Winkel von horizontal für Hüftbewegung aufmerksam sein kann für die konsistente und genaue Zuordnung der lethargisch oder mobile Hüftbewegung bei Mäusen. Der Zeitrahmen von 4 s zu sehen, ob eine Maus kann sich rechts wurde ausgewählt, weil unangefochten Mäuse konsequent selbst innerhalb dieses Zeitrahmens rechts konnten. Wiederholte Messung der gleichen Maus konnte vermieden werden, während die Zeit, um sich richtig und die Messung der hip Mobilität beschränkte sich auf 4 s, um zu vermeiden, übermäßig anstrengend der Maus beeinflussen könnten sonst seine Fähigkeit zu essen und Wärme erhalten und könnte Auswirkungen auf seine Prognose, besser zu werden. Aufrichtenden selbst aus der linken und der rechten Seite beobachtet, und desto höher die Punktzahl wurde verwendet, um festzustellen, ob die Maus an eine humane Endpunkt war, weil einige Mäuse gefunden wurden, auf einer Seite anzuzeigenden FTR-Nonmobile noch eine höhere Mobilität auf der anderen Seite und b e schließlich wiederherstellen.
Das scoring-System verwendet, um Maus Gesundheit bewerten stützte sich auf die Anwendung des kategorischen Abschaltungen, was ein Spektrum der Bewegung ist und daher anfällig für individuelle Neigung sein könnte. Personal war zusammen ausgebildet, um sicherzustellen, dass jede Person die Mäuse erzielte das gleiche; jedoch bleibt wahrscheinlich ein Maß an Subjektivität zu Variation. Die Konsistenz des scoring wurde ausgewertet, indem er sieben Forscher, die nicht zuvor die Neugeborenen Maus Überwachung durchgeführt hatte lernen die Anforderungen in diesem Protokoll und Video dann unabhängig Verhaltensweisen zuordnen und bestimmen humane Endpunkt. Eine 97 % ige Genauigkeit beobachtet mit scoring auf 60 herausgefordert Mäuse, was darauf hindeutet, dass individuelle Voreingenommenheit keine wesentliche Rolle bei der behavioralen Aufgaben dieses Modells spielt durchgeführt. Die vorgestellte Verhaltens Überwachungsprotokoll basiert auf Beobachtungen von Tieren auf DOL 7 in Frage gestellt, doch Mäuse jünger als 6 Tage in einem unangefochten gesunden Zustand können nicht konsequent rechts selbst. So konnte die beschriebene humane Endpoint-Kriterien nicht direkt an jüngeren Mäusen angewendet werden. Wenn jüngere Mäuse in diesem experimentellen Modell verwendet werden oder wenn eine andere Herausforderung-Modell mit verschiedenen Krankheiten Kinetik angewendet wird, müssen geeignete humane Endpoint-Kriterien entwickelt und pilotiert um die Euthanasie von Mäusen zu vermeiden, das würde sonst, schließlich werden, wiederhergestellt werden. Das scoring-System zeigt eine robuste Methode zur Verbesserung der humane Endpoint-Klassifizierung, die mit der Prüfung und Bestätigung, potenziell zu anderen Modellen angewendet werden könnte.
Jede Zubereitung cecal Gülle oder die Verwendung von eine neue Maus-Belastung erforderlich, die Retitration der cecal Gülle Dosis zu verabreichen, um eine ähnliche tödliche Dosis zu erreichen. Jede Zubereitung wurde standardisiert durch das Auslesen von Interesse, nämlich überleben, anstatt die gleiche Keimzahl. Jede cecal Gülle Zubereitung tragfähige Bakterienkonzentration variiert leicht, möglicherweise aufgrund von Unterschieden in den Spender Kommensalen Bakterien oder aufgrund von Abweichungen in der Gewichtsklasse verließ die Zelle Sieb von den cecal Gülle Lager Postfiltration. Während der Titration cecal Gülle die ersten beiden Würfe wurden in zwei Gruppen aufgeteilt und jeweils die Hälfte des Wurfes wurden mit einem der zwei Dosen angefochten, so dass jeder der Dosen in zwei Würfen geprüft werden würde. Wenn die resultierende Überlebensrate nicht das erforderliche Niveau übereinstimmen, dann die Herausforderung-Dosis wurde entweder erhöht oder verringert durch 5 % - 10 % und das Experiment wiederholt. Mehrere Würfe wurden verwendet, um den Wurf zu Wurf Unterschiede ausmachen, das könnte dazu führen, dass Widerstand oder erhöhte Anfälligkeit zur Sepsis über einen Wurf. Es war wichtig, genau den cecal Gülle bestand mit jeder neuen Vorbereitung um sicherzustellen, dass die neue Titration cecal Gülle vergleichbar mit früheren cecal Gülle Vorbereitungen Titer. Perioden der überschüssige Lärm und Vibrationen, speziell während der Verdichtung von Asphalt und den Bau von einem nahe gelegenen Gebäude und Straße, wurden beobachtet, um Stress in der Dämme zu erhöhen. Dies korreliert mit erhöhten Raten von Kannibalisierung und beeinflusst die Sterblichkeit der überleben Experimente, sogar beeinflussen unangefochten Mäuse, die angibt, dass es unwesentliche Auswirkungen auf das neonatale überleben, die auch kontrolliert werden müssen.
Vorherige Methoden für cecal Gülle Stoffaufbereitung enthalten entweder die Verwendung von frischen cecal Gülle oder die Vorbereitung von gefrorenen cecal Gülle, mit einer Vielzahl von Methoden, einschließlich der Lagerung in Glycerin, die unweigerlich während der Challenge übertragen werden würde. Während die Verwendung von frischen cecal Gülle den Vorteil bietet, dass eine bakterielle Zusammensetzung am nächsten zum ursprünglichen cecal Inhalt, besteht die Gefahr von Abweichungen zwischen den einzelnen Spender Mäuse aufgrund der Variation von Kommensalen Bakterien. Während dies mithilfe cecal Spender vom selben Hersteller mit minimalem Zeitaufwand zwischen Ankunft und das Fortschreiten des Experiments minimiert wurde, könnte dies ein kostspielig Option für einige Labore und präsentiert einen anderen Zeitpunkt logistische Herausforderung mit Alter abgestimmt Mäuse verfügbar, wenn eine cecal Gülle zu Beginn experimentieren bei neugeborenen Mäusen, die 7 Tage alt waren. Eine alternative Methode zur Verwendung von frischen cecal Gülle wurde verwendet, wo mehrere Erwachsenen Spendern cecal Inhalt wurden zusammengefasst, Nukleinsäuretablette in D5W, bei-80 ° C ohne Glycerin, eingefroren und wieder aufgetaut einen aliquoten zu einem Zeitpunkt für Experimente. Die Nutzung von Erwachsenen Spender cecal Gülle, neonatale Sepsis zu studieren könnte potenziell transfer Arten von Bakterien in die cecal Gülle, die Neugeborene Maus nicht ausgesetzt worden ist, aber es ist eine Strategie, die für das Studium der Sepsis in den neugeborenen Mäusen ermöglicht und wurde zur Neugeborenen Maus Biologie in den letzten13,14,15zu studieren. Cecal Gülle wurde verdünnt in D5W Ernährung anzubieten die Bakterien ermöglichte die Einrichtung einer aktiven Infektion sobald die Bakterien injiziert wurden, und wurde getan, um die Verfügbarkeit von Nährstoffen in die Bauchhöhle während nekrotisierende imitieren Enterokolitis. Glycerin wurde nicht als Stabilisierungsmittel in eisigen Bakterien wegen der potenziellen negativen Nebenwirkungen, die sich aus Glycerin Injektion allein. Wenn Glycerin in der cecal Gülle Vorbereitung einbezogen worden, dann der potenzielle Schaden, dass Glycerin allein könnte auslösen würde müssen getestet werden durch die Einbeziehung einer nur Glycerin (fehlende cecal Gülle) Injektion bei Mäusen, denen erhöht hätten Maus Nutzung. Die Bakterien Lebensfähigkeit der cecal Gülle Bestände wurde nach dem Einfrieren des cecal Gülle Bestand ohne Glycerin getestet und erwies sich konstant, bei unveränderter Bakterien-Konzentration im separaten Aliquote die gleiche cecal Gülle-Vorbereitung bei-80 ° C über eine 6 gelagert werden Monats-Zeitraum. Dies deutet darauf hin, dass die Lagerung ohne Glycerin bei der Bereitstellung von einem konsequenten biologischen Ergebnis machbar ist. Die Verwendung von einer Masse vorbereitet gefroren cecal Gülle bestand erlaubt auch für den Einsatz von Mäusen gezüchtet im eigenen Haus, Kostensenkung und Verwendung von männlichen Mäusen, die sonst aus der Zucht überschüssige, wodurch Maus Verschwendung.
Die Identifikation des gescheiterten Herausforderungen bei Mäusen war wichtig, zu vermeiden, dem System zusätzliche Rauschen hinzufügen. Nach Durchlaufen einer intraperitonealen Injektion von cecal Gülle, wurden die Mäuse für das Vorhandensein einer Beule unter der Haut beobachtet, die eine fehlerhafte Injektion angegeben, die tatsächlich subkutane war. Mäuse für Lecks an der Injektionsstelle beobachtet wurden, sofort nach Entfernung der Nadel und nach der es ihnen ermöglicht, einen Schritt nach der Injektion, da Mäuse manchmal würde auslaufen (selten) erst nach dem Umzug der Extremität der Injektionsstelle durch einen Schritt. Das Vorhandensein einer Ausbuchtung oder Leck nach der Injektion führte die Maus aus der Analyse entfernt. Immerhin könnte diese in ein anderes Ergebnis aufgrund der falschen cecal Gülle injiziert, da eine Differenz von 5 % in Herausforderung Dosis beobachtet hat, um nachfolgende Überleben beeinflussen.
Cecal Gülle Herausforderung Experimenten oft erforderlichen unterschiedlichen Ziel letalen Dosen mit unterschiedlichen Dosen Gewicht angepasst. Aus diesem Grund können die Einspritzmengen von weniger als 20 µL bis 100 µL reichen. Die verhältnismäßig experimentellen Fehler in Verbindung mit Toten Nadel Volumenänderungen auch zusammen mit das Injektionsvolumen, Erhöhung der Schwierigkeit um verschiedene Dosen direkt miteinander zu vergleichen. Mit der einfachen Änderung der Standardisierung des Injektionsvolumen wird diese Quelle der Varianz des Experiments entfernt.
Die Neugeborenen Maus Verhaltens monitoring-System in diesem Protokoll verwendeten ist das erste seiner Art. Forscher auf ethische forschen mit Neugeborenen Mäusen bedacht sind oft konfrontiert mit dem herausfordernden Mangel an Ressourcen, um das Wohlbefinden des Tieres in diesem Alter zu bewerten. Die vorgestellte intuitive und konsequente monitoring-System beginnt diese Wissenslücke anzusprechen. Wichtig ist, diese Beweise orientierter Ansatz nicht nur erhöht die Qualität der gewonnenen experimentellen Daten jedoch zur gleichen Zeit, reduziert auch das Leiden der Versuchstiere.

Sepsis ist eine führende Ursache des menschlichen Neugeborenen ansteckende Todesfälle1. Weil Neugeborenes Sepsis schlecht verstanden wird, wurden in die Identifikation von gefährdeten Neugeborenen früh während der Krankheit und die Entwicklung von wirksamen Behandlungen oder Prophylaxen wenig Fortschritte erzielt. Dies erfordert den Einsatz von Tiermodellen der Sepsis, die Prozess und möglichen Interventionen besser zu verstehen. Des weiteren reagieren Erwachsenen Nagetiere unterschiedlich auf Sepsis mit statistisch signifikante Unterschiede in der Zahl der Bakterien zu verwalten, um die gleichen letale Dosis (LD) zu erhalten und die Unterschiede in der daraus resultierenden Wirtsantwort verglichen mit Neugeborenen2. So hat neonatale Sepsis beim Neugeborenen untersucht werden. Mehrere Erwachsene Sepsis-Modelle wurden in der Sepsis-Forschung verwendet. Dazu gehören eine intravenöse Herausforderung mit bestimmten Organismen, die bei erwachsenen Menschen Sepsis oder cecal Ligatur und Punktion (CLP) in Verbindung gebracht. CLP ist eine endogene Herausforderung Modell wo der Blinddarm ist chirurgisch isoliert ligiert und punktiert um Austritt von Darminhalt in das Peritoneum zu ermöglichen, führt schließlich zu einer systemischen Verbreitung der Mikroben und ihre Produkte3. Der chirurgische Eingriff herstellen CLP erforderlich ist jedoch tödlich für neugeborene Tiere; Daher muss eine alternative Methode die Biofilm Herausforderung CLP induzieren neonatale Sepsis zu imitieren. Das cecal Gülle-Modell für neonatale Biofilm Sepsis wurde entwickelt, um diesem Bedarf zu begegnen, wobei die cecal Inhalte von Tieren geerntet, in sterilen Dextrose 5 % in Wasser (D5W) ausgesetzt und intraperitoneal injizierten Neugeborene Mäuse2. Dies, da geworden ein zunehmend beliebtes Modell Sepsis bei Neugeborenen und erwachsenen Tieren zu studieren und hat erheblich erweiterte mechanistische Einblicke in die Krankheit Prozess4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.
Angesichts der zunehmenden Nutzung dieses Modells und der Forscher wollen Ergebnisse direkt über Publikationen zu vergleichen, gibt es eine Notwendigkeit für die technischen Aspekte gut beschrieben und standardisierte über Studien zu sein. Standardisierung bezieht sich auf drei Aspekte des Modells, nämlich i) die Vorbereitung der cecal Gülle bestand, (Ii) die Vorbereitung der Herausforderung Aliquote für die Injektion in den Versuchstieren und (Iii) die Definition des humanen Endpunkts wobei Tiere Nonsurvivors im Challenge-Experimente gelten. Insbesondere werden Methoden zur Vorbereitung des cecal Gülle bestand oft auf den ursprünglichen Artikel Einführung in das Modell2verwiesen. Eine kurze Zusammenfassung dieses Modells ist, dass cecal Inhalt von Erwachsenen Mäusen wurden geerntet, in sterilen D5W zu einer Konzentration von 80 mg/mL suspendiert und innerhalb von 2 h benutzt, um Versuchstiere zu injizieren. Dieses ursprüngliche Modell verwendet Mäuse im gleichen Alter, vom selben Hersteller Standort, die in ihren jeweiligen Forschungseinrichtungen für weniger als 2 Wochen vor der Ernte cecal Inhalt untergebracht waren. Die Verwendung von eigenen gezüchteten Mäusen beträchtlich obwohl reduzieren die Kosten von Regellieferant Lieferung und damit für die Verwendung von überschüssigen Mäuse einer breiteren Palette von Geschlecht und Alter, auch Spender, Spender Variabilität. Dies motiviert die Entwicklung einer alternativen Technik, wobei cecal Inhalt aus mehreren Mäusen zusammengeführt wurden, einen großen Vorrat vorbereiten, der dann regelmÄÑig und bei-80 ° C13gelagert war. Diese alternative Methode wurde von mehreren Gruppen-14,-15adaptiert. Diese Anpassung führte jedoch einige technische Varianten, sowohl in den Speichermedien verwendet (10 % oder 15 % Glycerin oder D5W allein) und in der Strategie der Filtration um Partikel zu entfernen (mehrstufige Filtration durch ein 860 µm und dann ein 190 µm Filter oder Einzelperson Filtrationen über 100 µm oder 70 µm Filter)13,14,15. Die Injektion von Glyzerin allein könnte potenziell schädigen, angesichts der Tatsache, dass 25 % - 50 % Glycerin Injektionen als Nagetier Modell einer Nierenschädigung16,17,18,19verwendet wurden, 20. Zur Vermeidung von unbeabsichtigten Nebenwirkungen von Glycerin ist die cecal Gülle Stoffaufbereitung für Mäuse in dieser Studie in D5W ohne Glycerin eingefroren, und Tests der bakteriellen Lebensfähigkeit aus dem Speicher bei-80 ° C durchgeführt. Die Filtration-Strategie in dieser Studie verwendet wird, einem Durchgang durch einen 70 µm-Filter, die nicht direkt mit den anderen Filtration Strategien aufgeführt verglichen hat.
Tödliche Gewicht angepasst Dosen injiziert cecal Gülle variieren von Anlage zu Anlage und soll hochinfizierende, um die gewünschte Letalität für einzelne Gruppen. Mit verschiedenen Herausforderung Dosen ändern die begleitende Herausforderung Volumes durch die Notwendigkeit. Jedoch wurde dieses methodischen Detail nicht vor berichtet. Darüber hinaus Strategien für standard-Verfahren, wie z. B. intraperitoneale Injektion sind selten auf innerhalb der Literatur erarbeitet, aber Einzeltechniken können beeinflussen, ob Neugeborene Mäuse lecken wenn Sie injiziert und die Endergebnisse auswirken.
Tierschutz, einschließlich einer Definition des humanen Endpunkt ist ein zentraler Aspekt dieses Modells und in jedem Modell von Infektionen und Entzündungen in Nagetieren21. 1998 veröffentlichte der Canadian Council auf Animal Care (CCAC) umfangreiche Richtlinien für humane Endpunkt Auswahl den humaneren Endpunkt zu definieren, da "alle tatsächlichen oder möglichen Schmerzen, Ängste oder Beschwerden sollten minimiert oder gemildert durch die Wahl der früheste Endpunkt ist kompatibel mit den wissenschaftlichen Zielen der Forschung"22. Andere auch Achtung, dass humane Endpoints feststehen muß auf wissenschaftliche Begründung nicht auf eine subjektive Interpretation des Tieres Staat allein21basiert. Zwar gibt es eine Fülle von Ressourcen für klinische, Verhaltens-, und Körper-Zeichen-basierte Zustandsvorschriften für humane Endpunkt, auch im Rahmen von Infektionen und Entzündungen speziell21,23,24, keines dieser , einschließlich der CCAC Richtlinien für humane Endpunkt22, Neugeborene Mäuse erwähnen. So sind Objektiv und wissenschaftlich begründeten humane Endpoints viel schwieriger für neugeborene Tiere angesichts ihrer begrenzten Verhalten Fähigkeiten und Mangel an Beweisen aus Kriterien wie Gewichtsverlust, die allgemein für Erwachsene verwendet wird Mäuse. Derzeit, die Kriterien für die humane Endpunkt verwendet für 5 bis 12 Tage alten neugeborenen Mäusen in der cecal Gülle Literatur alle wieder mit dem original zu verweisen, die das Modell2eingeführt. In diesem ursprünglichen Papier stützte sich die Definition des humanen Endpunkt für neugeborene Tiere auf zwei Kriterien; nämlich, war die Position der Maus außerhalb des Nestes (Streuung) und der Mangel an Milch Flecken gesehen zu Tod innerhalb von Stunden führen. Erschwerend ist bei der Zuordnung eines humanen Endpunkts, dass Milch Spots werden schwer zu erkennen in Mausstämme mit dunklen Fell, wie z. B. die verwendeten C57BL/6J Belastung nach der ersten Woche des Lebens, während kranke Tiere bis zum 14. Tag des Lebens (DOL) überwacht werden. Weitere, tote Tiere können Postchallenge gefunden werden, wenn diese Kriterien anwenden (eigene Beobachtung unveröffentlicht); so muss eine strengere Definition von humanen Endpunkt auf Versuchstiere leiden zu lindern und vermeiden Sterblichkeit in Situationen, wo das Ergebnis genau früher erkannt werden könnte.
Alle drei methodische Aspekte des Modells cecal Gülle werden in eine Betriebsanweisung Detaillierung der Vorbereitung der cecal Gülle bestand vorgestellt, eine Methode zum Einspritzen von Versuchstieren, die hält die Injektion Volumen konstant zwischen den einzelnen Dosen und reduziert das Risiko von Leckagen und eine Definition der humane Endpunkt für 7 bis 12 Tage alte Mäuse basiert auf einem System von behavioral Modeling. Verhaltensbezogene Informationen Maus Gesundheit Partituren aus über 240 Versuchstieren wurde gesammelt und gruppiert nach endgültigen überleben Ergebnis, demonstriert eine Beweis-driven Definition der humane Endpunkt. Das Leiden von Versuchstieren wird durch moribund neugeborenen Mäusen am frühesten möglichen Zeitpunkt zu identifizieren, während biologisch signifikanten Überlebensvorteil Ergebnisse abgeleitet werden können, durch die Beobachtung Schlüsselvariablen reduziert. Die visuelle Darstellung der cecal Gülle Vorbereitung und neonatale Mausverhalten dient als eine ausgezeichnete Quelle für jede Gruppe, die Sepsis oder Neugeborenen Herausforderung Modell Tiere zu studieren.

<table><tbody><tr><td>0,1 - 20 &mu; L Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>732-0799</td><td></td></tr><tr><td>1,8 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Costar</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1000 &mu; L Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>732-0801</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &mu; L Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>732-0800</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>FroggaBio</td><td>TB15-25</td><td></td></tr><tr><td>23G1 Nadeln</td><td>Becton Dickinson</td><td>305145</td><td>nur die Nadel, nicht die Spritze, die zum Anstecken von Maus an Styropor verwendet</td></tr><tr><td>wird 28G 0,5 mL Insulinspritze</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Kryofläschchen</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipette</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>6 - 10 Wochen alt C57BL/6J erwachsene Mäuse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>7 + Tag alt C57BL/6J neugeborene Mäuse</td><td>Im Haus gezüchtet</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Cell Sieb</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Defibriniertes Schafsblut</td><td>Dalynn</td><td>HS30-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose 5% Wasser (D5W)</td><td>Baxter</td><td>JB0080</td><td></td></tr><tr><td>Präparierzange</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 82027-386</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere, scharfe Spitze</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 82027-592</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere, scharfe/stumpfe Spitze</td><td>VWR</td><td>82027-594</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (HistoPrep 95% denaturierter Ethylalkohol)</td><td>Fisherbrand</td><td>HC11001GL</td><td>auf 70% mit doppelt destilliertem Wasser verdünnt</td></tr><tr><td>Ethanol-fester Marker; Labormarker</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td></td></tr><tr><td>EZ Anästhesie-Verdampfer</td><td>EZ Anesthesia</td><td>EZ-155</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500, Trockensterilisation für chirurgische Instrumente (Heißperlen-Sterilisator)</td><td>Braintree Scientific</td><td>GER 5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Fresenius Kabi</td><td>CP0406V2</td><td></td></tr><tr><td>Mikrospatel</td><td>Chemglass</td><td>CG-1983-12</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenhilfe</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic Pipette PR-1000</td><td>Rainin</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic Pipette PR-20</td><td>Rainin</td><td>17008650</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic Pipette PR-200</td><td>Rainin</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Sartorius</td><td>BL 150 S</td><td></td></tr><tr><td>Probenzange</td><td>VWR</td><td>82027-440 / 82027-442</td><td></td></tr><tr><td>Quadratische 1000 mL Vorratsflasche</td><td>Corning</td><td>431433</td><td></td></tr><tr><td>Styroporplatte</td><td>Beliebig</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Sure-Seal Maus/Ratte Euthanasiekammer</td><td>Euthanex</td><td>EZ-178</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soja Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22091-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>VX-200 Lab Vortex Mixer</td><td>Labnet International</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>wiegen Papier</td><td>Fisherbrand</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr></tbody></table>

eine kontrollierte mausmodell für neonatale sepsis biofilm

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Neonatale Sepsis bleibt eine globale Belastung. Präklinischen Modell Bildschirm wirksamen prophylaktischen oder therapeutischen Interventionen ist erforderlich. Neugeborenen Maus Biofilm Sepsis kann ausgelöst werden durch intraperitoneale Injektion von cecal Gülle in Tag des Lebens 7 Mäuse und Überwachung für die folgende Woche. Hier sind die einzelnen Schritte für die Umsetzung dieses Modells neonatale Sepsis erforderlich. Dazu gehört, so dass eine homogene cecal Gülle Lager, verdünnen es auf eine Portion Gewicht und Wurf eingestellt, einen Überblick über die Überwachungszeitplan und eine Definition der beobachteten Gesundheit Kategorien verwendet, um humane Endpoints definieren. Die Generierung einer homogenen cecal Gülle-Aktie von gepoolten Spendern ermöglicht die Verwaltung in viele Würfe im Laufe der Zeit reduzieren die Variation zwischen den Gebern und verhindern, dass potenziell toxischen Glycerin. Die Überwachungsstrategie verwendet ermöglicht die Antizipation des Überlebens Ergebnis und die Identifizierung von Mäusen, die später zum Tode, zulassend eine frühere Identifizierung des humanen Endpunkts Fortschritte machen würde. Zwei Hauptmerkmale Verhaltensstörungen werden verwendet, um Integritätsbewertungen, nämlich die Fähigkeit des neugeborenen Mäusen, selbst auf dem Rücken und dem Grad ihrer Mobilität richtig zu definieren. Diese Kriterien könnten potenziell auf Adresse humane Endpoints in anderen Studien mit Neugeborenen Krankheit bei Mäusen, angewandt werden, solange eine Pilotstudie durchgeführt, um die Genauigkeit zu bestätigen. Zusammenfassend stellt dieser Ansatz eine standardisierte Methode, um Modell Neugeborenen Sepsis bei Mäusen, während der Bereitstellung von Ressourcen zur Bewertung des Tierschutzes verwendet, um frühe humane Endpunkte für Behinderte Tiere zu definieren.

Cecal Gülle Lebensfähigkeit bei-80 ° C gelagert kann im Laufe der Zeit getestet werden durch seriell verdünnen und Plattieren Aliquote cecal Gülle bestand auf 5 % Schafe tryptic Soy Blutagar gefolgt von 24 Stunden nach der aeroben Inkubation bei 37 ° C. Nachfolgende Auszählung der kultivierbaren koloniebildenden Einheit (KBE) Inhalt einer cecal Gülle Zubereitung fand sich nicht, um über einen Zeitraum von 6 Monaten zu ändern, und die Lebensfähigkeit von längerer Lagerung bei-80 ° C (Abbildung 2) nicht betroffen war. Jeder Spender Maus führte im Durchschnitt genügend cecal Gülle, drei bis vier Würfe (Daten nicht gezeigt) herauszufordern.
Mäuse vor der Herausforderung, im DOL 7 cecal Gülle induzieren Biofilm Sepsis begannen die humaneren Endpunkt innerhalb von 12 h der Herausforderung zu erreichen und Biofilm Sepsis wurde meist von 48 h Postchallenge gelöst, wie in einer Kaplan-Meier-überleben-Kurve kombiniert aus beobachtet Daten von über 200 Behinderte Mäuse (Abbildung 1A). Die Letalität war abhängig von der Herausforderung Dosis verabreicht, mit einer 5 % Änderung der Herausforderung Dosierung führt ein ca. 15 % Unterschied in der Überlebensrate (Abbildung 1 b). Die Maus-Körpergewicht wurde bei jeder Nachprüfung gemessen. Gewichtsabnahme galt bei allen behinderten Tieren, wird nicht diskriminierenden zwischen Mäusen, die Überlebenden am Ende und diejenigen, die nicht während der ersten 24 h (Abbildung 1) postchallenge. Nach 24 h begann die meisten Überlebenden Tiere, ihr Gewicht wieder zu erlangen, während alle Nonsurvivors weiterhin Gewicht zu verlieren und ihre humane Endpunkt verschoben. Aber ein kleiner Anteil der Überlebenden Tiere, die behielt ihre aufrichtenden Reflex auch weiterhin Gewicht zu verlieren oder versäumt, Gewichtszunahme, bis zum Ende des Experiments, sogar weniger als 20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts innerhalb von 40 h der Herausforderung zu verlieren hatte. Da gab es eine Überschneidung der Gewichtsverlust zwischen Mäusen, die Überlebenden am Ende und diejenigen, die nicht tat, konnte die Änderung im Gewicht oder eine Schwelle der Gewichtsabnahme nicht als Kriterium für humane Endpunkt verwendet werden und gleichzeitig das Ziel der Aufteilung genau Überlebenden von Nonsurvivors.
Das Verhalten von Mäusen wurde überwacht, wie im Protokoll und in Tabelle 2dargelegt. Schnappschüsse von der Gesundheit, die Kategorien werden angezeigt (Abbildung 3A-C). Diese Fotos zeigen den verschiedenen gesundheitlichen Kategorien von Mäusen nicht gleich sich danach auf den Rücken gelegt und den Unterschied zwischen FTR-Mobile und FTR-lethargisch, zu skizzieren, das ist ein wichtiger Unterschied. Unangefochtene gesunde Mäusen in diesem Alter anzeigen nicht FTR-lethargisch Aktivität; Daher ist diese Kategorie Gesundheit ein Marker für Krankheit und eine Antwort auf die Herausforderung. Krank Mäuse FTR-lethargische Symptome (Abb. 3 b) und könnte regress gegenüber FTR-Nonmobile (Abbildung 3), wo die Oberschenkel parallel mit dem unteren Bein bleibt, ist mit wenig bis Null Hüfte schaukelte Bewegung, die eines der Kriterien für humane Endpunkt. Die Mäuse könnten auch erholen, erhöhte Hüftbewegung zu gewinnen und immer FTR-Mobile (Abb. 3A). Der aufrichtenden Reflex und Mobilität Partituren wurden für Links und rechts von jeder Maus bestimmt, und die höchste Punktzahl wurde eingesetzt, um festzustellen, ob die Maus einen humaneren Endpunkt erreicht hatte. Verhaltensbezogene Informationen wurde aus über 240 Tiere vor der Herausforderung, einer tödlichen Dosis (LD60) 60 cecal Gülle gesammelt, und 144 humane Endpunkte wurden beobachtet (Abbildung 3D-F und Tabelle 1). Diese Beweise orientierter Ansatz wurde verwendet, um zu definieren und verfeinern die humaneren Endpunkt über vier Krankheitsstadien, kategorisiert durch die Experimentatoren basierend auf beide Verhaltensunterschiede zwischen Überlebenden und Nonsurvivors und mit dem Bruch der humane Endpunkte erreicht in jedem Zeitraum. Während der frühen Experimente fanden sich FTR-Nonmobile-Mäuse, die kein Hüftbewegung hatte konsequent tot innerhalb von 4-6 h für dieses Verhalten zu beobachten. In der Sammlung von Informationen war ein FTR-Nonmobile Integritätswert als Kriterium für eine humane Endpunkt verwendet. Von 12-21 h Postchallenge während FTR-Nonmobile Mäuse euthanasiert wurden, Überlebenden und nonsurviving Tiere sehr ähnliche Verhaltensmuster angezeigt und könnte nicht in irgendeiner anderen Weise (Abbildung 3D) unterschieden werden. Vom 21-48 h Postchallenge die Mehrheit der Überlebenden Mäuse wieder ihre aufrichtenden Reflex, während weniger als 1 % der FTR Verhaltensweisen beobachtet wurden bei Tieren, die würde überleben das Experiment (Abbildung 3E). Mäuse, die sich von beiden Seiten rechts wurde somit ein zusätzliches Kriterium für humane Endpunkt während dieser Zeit. Zwischen 12 und 20 h Postchallenge 12,5 % an der Gesamtzahl der humane Endpoints, im Vergleich zu 80,5 % zwischen 20 und 48 h und 7 % nach 48 h (Tabelle 1) beobachtet. Ein Unterscheidungsmerkmal zwischen Mäusen, die Überlebenden landeten und das verschlechterte sich schließlich auf eine humane Endpunkt war der Verlust der aufrichtenden Reflex, unabhängig von hip Mobilität (Abbildung 3F). In der Tat konnte insgesamt 121 Mäuse zwischen 20 und 48 h nach der Herausforderung, nach rechts sich von beiden Seiten mit 116 dieser Mäuse schließlich voran an eine humane Endpunkt (das entspricht eine 96 % Genauigkeit bei der Ermittlung von Mäusen, die nicht wiederhergestellt werden würde). Über 48 h nach der Herausforderung waren 11 Mäusen beobachtet, zum Scheitern verurteilt, sich von beiden Seiten und 10 von diesen progressiven um eine humane Endpunkt (eine 91 % Genauigkeit) gleich. Über 20 h nach der Herausforderung sagt die Anzahl der Mäuse, die für beide Seiten den aufrichtenden Reflex verloren das endgültige Ergebnis mit einer Genauigkeit von mehr als 90 %; Daher hat dies hinzugefügt, um die humane Endpunkt Kriterien, nonrecovering Mäuse früher zu identifizieren und zu reduzieren Maus leiden (Tabelle 1).
Die Häufigkeit, dass Mäuse Überwachung brauchen ändert sich im Laufe der Zeit durch verschiedene Sätze von Tod Postchallenge, und sind in Tabelle 1zusammengefasst. Eine Maus galt bei seiner humanen Endpunkt an jedem beliebigen Punkt wenn es versäumt, sich richtig angezeigt nicht mobile Hüftbewegung auf beiden Seiten, oder wenn die Maus aus dem Nest, verstreut war konnte sich rechts und lethargisch Hüftbewegung. Mäuse mit eine der folgenden Bedingungen nicht zu erwarten waren, dass man wieder die Streu und innerhalb von 4-6 h Beginn 20 h nach der Herausforderung zu FTR-Nonmobile eingehalten worden, wurde ein neue humane Endpunkt hinzugefügt, weil die präsentierte Informationen, dass die überwiegende zeigt Mehrheit der Mäuse, die FTR von beiden Seiten landet Krankheit zu erliegen.
Videos, Tabellen und Ressourcen präsentiert in dieser Handschrift sind eine effektive Lehrmaterial für die korrekte Zuordnung der behavioral herausgefordert Mäuse. Sieben Experimentatoren wurden gebeten, das Training Video und lesen das Protokoll und die Tische vor 60 Behinderte Tiere Verhalten zuweisen. Die Identifikation des humanen Endpunkt-Zuordnung war präzise sowohl für Unterscheidung FTR-Nonmobile-Mäuse von Mäusen, die die andere Verhaltensweisen (Abb. 4A) angezeigt und FTR Mäuse von Mäusen, die sich gerade innerhalb der zulässigen Zeitrahmens (konnten Abbildung 4 b).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig1.jpg"> Abbildung 1 : Kaplan-Meier überleben Kurve cecal Gülle Dosistitration und Gewichtsveränderung nach cecal Gülle Foulspiel. (A) überleben Ergebnis der neonatalen C57BL/6J Mäuse mit einer intraperitonealen cecal Gülle-Injektion bei DOL 7 in Frage gestellt. Die Daten für diese Figur verbanden sich aus unabhängigen Experimenten mit mehreren Herausforderung, die Dosen, von 0,7 bis 1,3 mg cecal Gülle pro Gramm Körpergewicht auf diesen Mäusen verabreicht wurde. (B) neugeborenen Mäusen herausgefordert mit 0,80 bis 0,95 mg pro Gramm Körpergewicht cecal Gülle aus einem cecal Gülle Präparat zeigt eine dosisabhängige Beziehung zwischen der Menge an cecal Gülle gegeben und den Prozentsatz des Überlebens. ()C) den Prozentsatz der Änderung im Vergleich zu der Herausforderung Gewicht mit der gepunkteten Linie bezeichnet eine 20 % Gewichtsverlust aus der Zeit der Herausforderung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig2.jpg"> Abbildung 2 : KBE-Konzentration im cecal Gülle bestand bei-80 ° C gelagert wird nicht über einen Zeitraum von 6 Monaten geändert. Der Effekt des Alters cecal Gülle auf CFU Konzentration wurde getestet mit linearen Regression. Jeder Punkt entspricht einem aliquoten der gleichen cecal Gülle Zubereitung, seriell verdünnt und über einen Zeitraum von 6 Monaten überzogen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig3.jpg"> Abbildung 3 : Hüft-Mobilität Kategorien von Mäusen, die nicht selbst direkt und tierische Verhaltensweisen zu verschiedenen Zeitpunkten Postchallenge. Mäuse, die mit Sepsis, angefochten worden, wenn Sie auf dem Rücken platziert zeigt Anzeichen von Morbidität, die gemessen werden kann durch den Grad der Hüftbewegung. (A) A scheitern nach rechts (FTR)-Mobile Maus zeigt hip Schaukelbewegung ihre Oberschenkel von mehr als 90 °-Winkel von der horizontalen. (B) ein FTR-lethargisch Maus zeigt Hüfte schaukelte Bewegung aber nicht mehr als 90 °-Winkel von horizontal zu jedem Zeitpunkt während der 4 s der Überwachung. (C) einige FTR-Nonmobile Mäuse verlängert das Bein am Knie biegen aber zeigt sehr wenig (weniger als 10 ° Winkel) auf Null Hüfte schaukelte Bewegung und die Beine bleiben parallel zueinander. (D) tierische Verhaltensweisen 12-21 h Postchallenge zeigen, dass nur FTR-Nonmobile Verhaltensweisen Überlebenden von Nonsurvivors zu trennen. (E) vom 21. bis 48 h Postchallenge, nur 4 von 592 beobachteten FTR Verhaltensweisen (0,67 %) gehören für die Überlebenden, so dass der aufrichtenden Reflex auf das endgültige Ergebnis Vorhersagen und als ein neues Kriterium für humane Endpunkt verwendet werden. (F) über 48 h Postinfection, 6 von 131 Mäuse (4,55 %), die einen aufrichtenden Reflex hatte fuhr fort, die FTR-Gruppe gehören und durch das Ende des Experiments, rechtfertigen dauerhafte Überwachung im Laufe der Genesung geopfert wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig4.jpg"> Abbildung 4 : Lehr-Ressourcen führen, genaue Verhaltens Einstufung von unabhängigen Experimentatoren. Experimentatoren trainiert von Viedeo begleiten dieses Protokolls Videos von 60 neugeborenen Mäusen in verschiedenen gesundheitlichen Gruppen kategorisiert. (A) die Fähigkeit, einen humaneren Endpunkt zu unterscheiden war entschlossen und durchschnittlich 97 % der Verhaltensweisen war genau kategorisiert als FTR-Nonmobile oder nicht, während nur 1 % der FTR-Nonmobile Mäuse identifiziert wurden. Zwei Prozent der Mäuse wurden fälschlicherweise als FTR-Nonmobile identifiziert. (B) die Identifizierung des zweiten humane Endpunkts Criterium korrekt zu unterscheiden zwischen FTR Mäuse oder diejenigen, die die Fähigkeit, sich innerhalb von 4 rechts s wird auf dem Rücken platziert in 97 % der Besetzungen, während nur korrekt zugewiesen wurde 0,96 % der Mäuse wurden falsch zugeordnet, als sich aufrichtenden und 2 % der Mäuse wurden fälschlicherweise als FTR zugeordnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stadium der Erkrankung</td>
			<td>A: hohe Morbidität, keine Mortalität</td>
			<td>B: hohe Morbidität, geringe Mortalität</td>
			<td>C: hohe Morbidität, hohe Sterblichkeit</td>
			<td>D: niedrige Morbidität, niedrige Mortalität</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stunden post-Herausforderung</td>
			<td>0−12</td>
			<td>12−20</td>
			<td>20−48</td>
			<td>&gt; 48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monitoring Häufigkeit</td>
			<td>2 h Post Herausforderung</td>
			<td>alle 4−6 h</td>
			<td>Alle 4−6 h, 8 h, unbeaufsichtigt über Nacht</td>
			<td>1−2 Mal mehr täglich, bei Bedarf</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anteil der gesamten humane Endpunkte beobachtet</td>
			<td>0/144</td>
			<td>18/144</td>
			<td>116/144</td>
			<td>10/144</td>
		</tr>
<tr>
<td>Prozentsatz der humane Endpunkte beobachtet</td>
			<td>0 %</td>
			<td>12,5 %</td>
			<td>80,5 %</td>
			<td>7 %</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Humane Endpoint-Kriterien</td>
			<td colspan="2">1. FTR−Nonmobile auf beiden Seiten</td>
			<td colspan="2">1. FTR−Nonmobile auf beiden Seiten</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">(2) verstreut vom Nest und ist FTR−Lethargic</td>
			<td colspan="2">(2) verstreut vom Nest und ist FTR−Lethargic</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">(3) FTR links oder rechts (mit einem Ergebnis der Mobilität)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Häufigkeit der Überwachung und humane Endpoint-Kriterien in den verschiedenen Stadien der Krankheit. Monitoring Häufigkeit, humane Endpunkte beobachtet, den Prozentsatz der humane Endpoints und humane Endpunkt Kriterien während der verschiedenen Stadien der Krankheit.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Aufrichtenden Reflex</td>
			<td>Mobilität</td>
			<td>Frist nach rechts nach Ihrem Eingang auf Rückseite</td>
			<td>Zeitliche Begrenzung für Maßnahme Betrag der Bewegung (mobile / lethargisch / nicht Mobile)</td>
			<td>Mobilität-Bewertungskriterien</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Rechte</td>
			<td>Mobile</td>
			<td rowspan="6">4 s</td>
			<td rowspan="3">Eine zusätzliche 8 s</td>
			<td>Die Maus nimmt mehrere Schritte hintereinander, Vorwärtsbewegung, Aufrechterhaltung und erkundet die Umgebung. Welpen umfallen nicht.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lethargisch</td>
			<td>Die Maus kann einen Schritt aber stoppen und anhalten vor der Einnahme von anderen. Welpe kann Umfallen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nonmobile</td>
			<td>Die Maus nimmt keine Schritte nach sich aufrichtenden. Welpe kann Umfallen.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Scheitern nach rechts</td>
			<td>Mobilen Hüften</td>
			<td rowspan="3">Die gleichen 4 s zur Messung der aufrichtenden Reflex</td>
			<td>Hat energetische Hüftbewegung mit dem oberen Bein drehen über 90° von der horizontalen mindestens einmal innerhalb von 4 s.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lethargisch Hüften</td>
			<td>Hüftbewegung bis zu aber nicht über 90° von der horizontalen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicht mobile Hüften</td>
			<td>Gliedmaßen durch die Verlängerung und zurückziehen bewegen können aber die Hüfte dreht sich nicht. Welpe sieht sehr krank.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Überwachung von Tabelle und Kriterien bei der Bestimmung der Integritätsstatus von Mäusen. Die zur Verfügung gestellten Kriterien dienten, Gesundheit Kategoriegruppen Mäuse zu definieren und zu individuellen Abweichungen bei der Zuordnung von Integritätsbewertungen zu verringern.

Dieses Protokoll bietet die notwendigen Schritte zu etablieren und neonatale Sepsis bei 7 Tage alten Mäusen zu bewerten.

Eine kontrollierte Mausmodell für neonatale Sepsis Biofilm

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

Das Cecal-Slurry-Modell für polymikrobielle Sepsis ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um einzigartige neonatale Pathophysiologie zu sezieren. Es kann variabel sein, und humane Endpunkte sind nicht gut beschrieben. Hier stellen wir Ihnen unser hochstandardisiertes Verfahren zur Herstellung einer Cecal-Schlämme vor und injizieren Versuchstiere.Darüber hinaus verwenden wir einen datengesteuerten Ansatz, um moribunde Welpen zu einem frühestmöglichen Zeitpunkt zu identifizieren. Beginnen wir mit der Zubereitung eines gefrorenen Cecal-Slurry-Lagerbestands. Dies geschieht durch Das Pooling von Cecal Concent von mindestens fünf erwachsenen Mäusen, Das Aussetzen in sterilem Dextrosewasser und die Lagerung bei minus 80 für die spätere Verwendung.Sie können Männchen oder Weibchen verwenden, aber das Geschlecht, alter und Hintergrund von Mäusen für Ihre Experimente sollten konstant gehalten werden. Lassen Sie uns zunächst unsere Werkzeuge für die Zerlegung vorbereiten. Dazu gehören eine Schere und Zange für die Haut und ein zweites Set für die inneren Organe.Schalten Sie den Heißperlensterilisator mindestens 30 Minuten vor Gebrauch ein. Tauchen Sie die Werkzeuge in 70% Ethanol und tauchen Sie sie dann in den heißen Perlensterilisator für mindestens eine Minute. Sprühen Sie eine Matte mit Papiertüchern mit 70% Ethanol, dann entfernen Sie die Werkzeuge aus dem Sterilisator, ohne den sterilisierten Teil des Werkzeugs auf die nicht-sterilen Griffe anderer Werkzeuge zu berühren.Legen Sie sie auf das Papiertuch, um abzukühlen. Sezieren Sie die Mäuse in einem biologischen Sicherheitsschrank. Pin die Beine der Maus auf einem Styropor-Board mit 23 Gauge Nadeln, so dass die Maus ist Bauch nach oben.Den Bauch mit 70% Ethanol besprühen. Mit sterilen Zangen und Scheren, durch die Haut schneiden, lösen Sie die Haut aus dem Peritonealfutter mit der Schere, und schneiden Sie einen rechteckigen Bereich von der Leistengegend bis zum Brustbein und von links nach rechts. Entfernen Sie alle Felle um das Peritoneum.Wechseln Sie zu einem neuen Paar steriler Werkzeuge, um das Peritoneum zu durchschneiden, wodurch auch eine rechteckige Öffnung entsteht. Identifizieren Sie das Cecum, das von der linken zur rechten Seite über den Körper verlaufen sollte. Unterbrechen Sie Bindegewebe, um die Cecum-Zweige aus dem Darm zu identifizieren und schneiden Sie das Cecum aus dem Darm.Legen Sie es auf ein sterilisiertes Blatt Wägepapier. Mit sterilen Werkzeugen, durchschneiden sie beide Enden des Cecums. Halten Sie die Mitte des Cecums mit Zangen und verwenden Sie einen flachen Metallspachtel, um den Cecal-Inhalt mit einer rollenden Bewegung sanft aus den Enden zu schieben.Sammeln Sie den Inhalt und legen Sie sie in einem vorgewogenen 15 Milliliter Zentrifugenrohr. Pool Cecal Inhalt von maximal fünf Mäusen in die gleiche Röhre. Gewichten Sie die Röhre erneut, sobald alle Inhalte hinzugefügt wurden.Um das Volumen des Dextrose-Wassers zu berechnen, um den Cecal-Gehalt in jedem Rohr hinzuzufügen, dividieren Sie das Gewicht des Cecal-Gehalts in der Röhre durch Ihre gewünschte Konzentration in Milligramm pro Milliliter. Halten Sie ein Aliquot von Dextrose-Wasser auf Eis für die Wiederaufhängung von Cecal-Gehalt. Fügen Sie die benötigte Menge Dextrosewasser in das 15 Milliliter Zentrifugenrohr mit Cecal-Inhalt.Wirbeln Sie das Rohr vertikal und horizontal für etwa 30 Sekunden. Beobachten Sie das Vorhandensein von Partikeln über ein paar Millimeter Im Durchmesser, und wenn vorhanden, weiter Wirbeln, bis alle Partikel sichtbar verschwunden ist. Legen Sie ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr auf Eis, um das Filtrat zu sammeln und ein steriles 70-Mikrometer-Zellsieb darüber zu installieren.Vier Milliliter resuspendierte Gülle aus einem 15-Milliliter-Rohr über das Zellsieb und in das Sammelrohr pfeifen. Den Partikel wieder aufhängen, indem sie zwei- bis dreimal nach oben und unten pfeifen. Extrudieren Sie Blasen, um die Filtergeschwindigkeit zu erhöhen, während Sie den Inhalt mit der Pipettenspitze rühren, bis keine Flüssigkeit mehr gefiltert wird.Dies sollte etwa 30 Sekunden dauern. Ändern Sie Die Zellensiebe zwischen jedem Rohr der Cecal-Schlämme, aber bündeln Sie alle Inhalte in der gleichen 50 Milliliter Sammelröhre. Wenn Ihr Lager 40 Milliliter überschreitet, dann wirbeln Sie ihn für 15 Sekunden, und legen Sie 20 Milliliter in ein neues Zentrifugenrohr.Teilen Sie die Gülle in kryogene Fläschchen mit jeweils 500 Mikroliter-Aliquots auf. Wirbel die Gülle zwischen allen drei Durchstechflaschen. Halten Sie den Master-Bestand in Fläschchen auf Eis.Durch die Lagerung von Aliquots bei minus 80 ändert sich die aeroben Koloniebildung in einer Cecal-Güllezubereitung über einen Zeitraum von sechs Monaten nicht. Nun, da die Cecal-Schlämme vorbereitet ist, können wir sie verwenden, um einen Wurf von sieben bis acht Tage alten Mäusen mit einer gewichtsbereinigten Dosis Cecal-Schlämme herauszufordern. Die Letalität der Gülle ist dosisabhängig.Sie müssen die gewünschte tödliche Dosis in Ihrer Anlage für jeden neuen Bestand mit einer neuen Dosistitration bestimmen. Pro Wurf wird eine Cecal-Gülleinjektion aliquot hergestellt. Wir normalisieren das Inokulum auf ein Volumen von 100 Mikrolitern und runden uns auf die nächsten 10 Mikroliter für jedes Tier im Wurf ab.Die Vorbereitung der Herausforderung aliquot erfordert drei Berechnungen, das Volumen des Güllebestands erforderlich, zusätzliche Menge an Dextrose Wasser, und das abgerundete Volumen für jeden Welpen in der Wurf. Einzelheiten zur Durchführung der einzelnen Berechnungen finden Sie in Abschnitt 3 des Protokolls. Die Durchführung dieser Berechnungen von Hand für jedes Experiment kann zeitaufwändig sein und zu experimentellen Fehlern beitragen, so dass eine Tabelle zusammen mit dem Protokoll heruntergeladen werden kann, in dem Sie Ihre Lagerkonzentration, die gewünschte Dosis und das Gewicht Ihres Wurfs eingeben, und die Menge an Gülle, das Volumen des Dextrosewassers und das tatsächliche Volumen pro Welpen automatisch zurückgegeben wird.Sie können dieses Blatt drucken und mitnehmen, wenn Sie bereit sind, Ihre Tiere herauszufordern. Bereiten Sie die Injektion aliquot in einem biologischen Sicherheitsschrank vor und halten Sie sie auf Eis. Mischen Sie vor dem Beladen der Spritze das Mikrozentrifugenrohr, indem Sie 20 Mal flicken.Welpen werden mit einer 28 Gauge Insulinspritze herausgefordert. Vor der Gülleherstellung das Aliquot mischen, indem man 300 bis 500 Mikroliter der Herausforderung aliquot in und aus dem Mikrozentrifugenrohr inspiriert und ausgestoßen. Dann erstellen Sie etwa 150 Mikroliter der Herausforderung aliquot.Dies sollte größer sein als das Injektionsvolumen für jeden sieben bis acht Tage alten Welpen. Flick an der Spritze, um Blasen aus dem Kolben zu lösen und ziehen Sie leicht auf der Spritze zurück, um Luftblasen zu vertreiben. Berühren Sie dabei nicht die Nadel oder die Kolbenwelle.Geben Sie die überschüssige Cecal-Schlämme wieder in das Mikrozentrifugenrohr, bis die berechnete Menge an Cecal-Schlämme für die Maus in die Spritze geladen wird. Cecal Gülle wird mit einer intraperitonealen Injektion verabreicht. Führen Sie dies gemäß dem Protokoll in Ihrer Tierpflegeeinrichtung durch.Um Leckagen zu minimieren, neigen Sie den Welpen nach unten und setzen Sie die Nadel zwischen das Bein und die Genitalien ein, wobei die Nadel flach und subkutan bleibt. Nach dem Einsetzen der Nadel etwa einen Zentimeter, drücken Sie nach unten und nach vorne, bis Sie spüren, dass die Nadel das Peritoneum punktiert, dann langsam den Kolben drücken. Ziehen Sie vorsichtig die Nadel nach dem gleichen Weg zurück, in dem Sie gegangen sind, und entspannen Sie Ihren Mittelfinger dabei.Beachten Sie alle Lecks in Ihrem Labor-Notebook und erwägen Sie, Tiere mit erheblichen Lecks aus Ihrem Endergebnis zu unterlassen. In diesem Abschnitt werden wir die verschiedenen Gesundheitsniveaus skizzieren, die wir bei Mäusen beobachten, die mit polymikrobieller Sepsis und ihrem entsprechenden humanen Endpunkt herausgefordert werden. Für alle Eingriffe mit Neonatalmäusen übertragen wir das Einstreumaterial in einen neuen Käfig.Dies überträgt den Geruch der Dame auf Ihre Handschuhe und reduziert die Belastung der Dame durch wiederholtes Betreten ihres Käfigs. Wir machen ein zweites Nest im neuen Käfig, um die überwachten Welpen bis zum Ende des Verfahrens oder Überwachung zu halten, wenn der gesamte Wurf bereit ist, in den Käfig der Dame zurückgebracht zu werden. Legen Sie eine Maus auf den Rücken und überwachen Sie die Möglichkeit, innerhalb von vier Sekunden nach rechts zu fahren.Wenn es richtig ist, warten Sie acht weitere Sekunden, um den Grad der Mobilität zu bestimmen. Eine unangefochtene oder sich erholende Maus ist am häufigsten in der Lage, ihre Umgebung zu verbessern und zu erkunden, indem sie mehrere Schritte hintereinander unternimmt. Gruppieren Sie Mäuse neu, die in der Lage sind, sich selbst zu rechtzumachen und ein paar Schritte zu unternehmen, um ihre Umgebung als rechtelethargische zu erkunden.Diese Mäuse können umfallen, während sie einen Schritt machen und auf ihren Füßen wackelig aussehen. Eine Maus, die nicht in der Lage ist zu recht und hat Hüftbewegung, die 90 Grad von horizontal enden wir gruppieren als nicht rechts-mobil. Diese Maus wird schließlich richtig, kann aber nicht innerhalb von vier Sekunden.Aufgrund seiner Hüftbewegungen wird er als nicht rechtsmobil gruppiert. Welpen, die nicht richtig sein konnten und Hüftbewegungen unter 90 Grad von der Horizontalen haben, werden als nicht rechtslethargisch gruppiert. Dies ist ein weiteres Beispiel für eine Maus, deren Hüften 90 Grad von der Horizontalen nicht überschreiten und als nicht rechts-lethargisch gruppiert sind.Ein nicht-nicht-mobiler Pup hat Beine, die schütteln oder vibrieren können, aber keine Hüftbewegung haben. Gliedmaßen können sich ausdehnen und zurückziehen, haben aber keine seitliche Bewegung. Der Pup ist sichtbar krank und hat den humanen Endpunkt erreicht.Dies ist ein weiteres Beispiel für ein Fail-to-Right-non-mobile-Pup. Seine Hüften schütteln nicht von links nach rechts, aber seine Pfoten vibrieren. Beim Umgang mit dem Käfig der Dame können Welpen aus dem Nest gezogen werden, wenn die Pflegedame läuft.Wir ersetzen diese und suchen dann nach anderen verstreuten Welpen, die von ihren Nestgefährten entfernt sind. Wenn diese verstreuten Welpen nicht rechts-lethargisch sind, befinden sie sich an einem humanen Endpunkt. Hier ist eine Kaplan-Meier-Überlebenskurve unseres Sepsis-Modells.Die Überwachungszeitpunkte finden Sie im beigefügten SOP. An jedem Punkt entlang der Überlebenskurve, wenn festgestellt wird, dass eine Maus nicht rechts-nicht-mobil ist, ist sie an ihrem humanen Endpunkt und eingeschläfert. Zwischen 12 und 21 Stunden nach der Herausforderung werden Mäuse krank erscheinen und etwa die Hälfte der Mäuse wird auf der einen Seite nach rechts sein können, während die andere Hälfte auf einer ihrer Seiten nicht richtig ist.Dies ist der Zeitrahmen, in dem die Mäuse beginnen, im Gesundheitsscore abzuschweifen und den humanen Endpunkt des Fail-to-Right-Nonmobilzuschlagens zu erreichen. Dies sind repräsentative Ergebnisse von Gesundheitsergebnissen, die in diesem Zeitraum beobachtet wurden. Die Überlebenden- und Nicht-Überlebendengruppen können zu diesem Zeitpunkt nicht anhand ihrer Gesundheitsergebnisse unterschieden werden.In diesem Krankheitsstadium, 21 bis 48 Stunden nach der Herausforderung, beobachten wir den höchsten Anteil an humanen Endpunkten. Wir haben auch festgestellt, dass die überwiegende Mehrheit aller Mäuse, die nicht in der Lage sind, sich auf beiden Seiten zu recht zu erholen, sich nicht von krankheiten erholen wird, was daher zu einem neuen Kriterium für einen humanen Endpunkt wird, zusätzlich zu den nicht-rechts-nichtbeweglichen Kriterien. Die beobachteten Gesundheitswerte in diesem Krankheitsstadium führten zu einer Trennung von Überlebenden und Nicht-Überlebenden.Die überwiegende Mehrheit der Mäuse, die nicht in der Lage waren, auf beiden Seiten richtig zu recht zu bekommen, erholte sich nicht von der Krankheit. Diese Daten unterstützen, dass ein neues Kriterium für einen humanen Endpunkt ab 21 Stunden nach der Herausforderung darin bestehen sollte, Mäuse einzuschläfern, die auf beiden Seiten nicht richtig sind. Über 48 Stunden nach der Herausforderung werden viele Mäuse beginnen, mehr Aktivität und einen besseren Rechtsetzungsreflex zu zeigen.Auch wenn der Anteil der humanen Endpunkte in diesem Zeitraum geringer ist, können die Mäuse immer noch abschweifen und kränker werden, und sie müssen immer noch auf humane Endpunkte überwacht werden. Während dieses Zeitraums hatten einige der Mäuse, die schließlich als Nicht-Überlebende gruppiert wurden, an einem Punkt eine erhöhte Aktivität gezeigt, aber später schlechter emittiert und einen humanen Endpunkt erreicht. Dies erfordert eine kontinuierliche Überwachung kranker Tiere mit zunehmender Häufigkeit, wenn sie beginnen, schlechtere gesundheitliche Ergebnisse zu zeigen.Unabhängige Experimentatoren, die keine persönlich geschulte Ausbildung erhalten haben und die nur dieses Lehrvideo beobachten, wurden in ihrer Fähigkeit getestet, die gleiche Punktzahl wie die Ermittler mit aufgezeichneten Testvideos zuzuweisen. Dieses Lehrvideo führt zu einer genauen Verhaltensklassifizierung. Die Fähigkeit, rechtsunbeweglichen neonatalen Mäusen, die ein Maß für einen humanen Endpunkt sind, die richtige Punktzahl zuzuweisen, wurde von 60 neonatalen Mäusen bestimmt, und durchschnittlich 97% der Verhaltensweisen wurden genau unterschieden, wobei nur 3% falsch identifiziert wurden.Als nächstes wurde die Fähigkeit getestet, neonatale Mäuse zu unterscheiden, die nicht richtig waren oder innerhalb von vier Sekunden richtig waren. Dies ist ein weiteres Maß für einen humanen Endpunkt und wurde bei 97% der neonatalen Mäuse genau zugewiesen, während 3% der Welpen fälschlicherweise als Rechte zugeordnet wurden. Hier sind repräsentative Ergebnisse für die prozentuale Gewichtsänderung von Mäusen im Vergleich zu ihrer Zeit der Herausforderung.Die durchschnittliche Gewichtsänderung zwischen Überlebenden und Nicht-Überlebenden begann sich nach der Challenge 24 Stunden lang zu trennen, aber es gibt eine Menge Überschneidungen zwischen den Gruppen. Es gab einige Überlebende, die mehr als 20% Gewicht verloren, aber immer noch von der Krankheit erholt. Die Gewichtsänderung war nicht so effizient bei der Vorhersage des Ergebnisses im Vergleich zu den Unterschieden in den Gesundheitsbewertungen, weshalb sie nicht als Kriterium für die Bestimmung verwendet wird, ob Mäuse an einem humanen Endpunkt sind.Abschließend möchte ich sagen, dass Sie nun in der Lage sein sollten, einen Vorrat an gefrorener Kalkschlämme zuzubereiten, die gewichtsbereinigte Dosis zu berechnen. Und injizieren und überwachen Neugeborene Mäuse für humane Endpunkte. Wir hoffen, dass dies eine wertvolle Ressource für Ihre Mausforschung sein wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Seman, B. G. et al. Ein neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis. J. Vis. Exp. (2020)Das Video demonstriert ein neonatales Mausmodell zur Untersuchung systemischer Infektionen mit gekapselten biolumineszenten Bakterien. Neugeborene Welpen werden mit hoch- oder niedrigdosierten bakteriellen Suspensionen injiziert und zur Nachsorge zu ihrer Mutter zurückgegeben. Die gekapselten Bakterien entgehen der frühen Immundetektion, breiten sich systemisch aus und werden...

Modellierung von Infektionen bei neonatalen Mäusen mit gekapselten biolumineszenten Bakterien

Hier wird ein Verfahren für die Festlegung der systemischen Infektion in der neonatalen Ratten mit Kulturen von Escherichia coli K1 beschrieben. Diese nichtinvasive Vorgehensweise erlaubt Besiedlung des Magen-Darm-Trakt, die Translokation des Erregers in den systemischen Kreislauf, und das Eindringen des zentralen Nervensystems in den Plexus choroideus.

Nichtinvasive Modell Neuropathogenic Escherichia coli Infektion in der neonatalen Ratten

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung einer reproduzierbaren Rückenmarkskompressionsverletzung (SCI) bei der neugeborenen Maus. Das Modell bietet eine vorteilhafte Plattform für die Untersuchung von Mechanismen adaptiver Plastizität, die der spontanen funktionellen Erholung zugrunde liegen.

Ein Neonatal Maus Spinal Cord Injury Kompression Modell

Diese Studie beschreibt den Prozess der Gavaging genauen Mengen von Probiotika mit Neugeborenen Mäusen. Der Versuchsaufbau wurde optimiert, um gehören aber nicht beschränkt auf probiotische Dosierung, Methoden der Verwaltung und Quantifizierung der Bakterien im Darm.

Probiotische Studien an neugeborenen Mäusen mit Magensonde

Wir entwickelten ein Modell der Chorioamnionitis, um die fetale Exposition gegenüber mütterlichen Entzündungen (FEMI) ohne Komplikationen lebender Organismen zu simulieren, um die Auswirkungen von FEMI auf die Entwicklung des Darmtraktes der Nachkommen zu untersuchen. Dies ermöglicht die Untersuchung der mechanistischen Ursachen für die Entwicklung von Darmverletzungen nach Chorioamnionitis.

Ein murines Modell der fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung, um die Auswirkungen der akuten Chorioamnionitis auf die Darmentwicklung von Neugeborenen zu untersuchen

Die Infektion von neonatalen Mäusen mit biolumineszierendem E. coli O1:K1:H7 führt zu einer septischen Infektion mit signifikanter Lungenentzündung und Lungenpathologie. Hier beschreiben wir Verfahren zur Modellierung und weiteren Untersuchung der neonatalen Sepsis unter Verwendung von längsinaler intravitaler Bildgebung parallel zur Aufzählung systemischer bakterieller Belastungen, entzündlicher Profilierung und Lungenhistopathologie.

Ein neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis

Nekrotisierende Enterokolitis (NEC) ist die schwerste gastrointestinale (GI) Erkrankung, die häufig bei Frühgeborenen auftritt, insbesondere bei Säuglingen mit sehr niedrigem Geburtsgewicht, mit hoher Mortalität und unklarer Pathogenese. Die Ursache von NEC kann mit entzündlichen Anomalien des Immunregulationssystems zusammenhängen. Ein NEC-Tiermodell ist ein unverzichtbares Werkzeug für die Immunforschung von NEC-Erkrankungen. NEC-Tiermodelle verwenden normalerweise C57BL/6J-Neugeborenenmäuse;...

Ein neonatales BALB/c-Mausmodell der nekrotisierenden Enterokolitis

Frühgeburten (Entbindung &lt; 37. Woche) sind ein dringendes globales Gesundheitsproblem mit suboptimalen Präventions- und Behandlungsmöglichkeiten. Wir stellen ein Mausmodell der aufsteigenden vaginalen bakteriellen Infektion induzierten Frühgeburt vor und skizzieren, wie die daraus resultierende neonatale Morbidität und Mortalität analysiert werden kann.

Modellierung von aufsteigenden vaginalen Infektionen, Frühgeburten und neonataler Morbidität bei Mäusen

Dieses Protokoll skizziert ein neonatales Mausmodell der nekrotisierenden Enterokolitis (NEC) und die anschließende Isolierung von Immunzellen der Lamina propria aus dem neonatalen Dünndarm der Maus.

Ein neonatales Mausmodell der nekrotisierenden Enterokolitis und der Isolierung von Lamina propria für die Erstellung von Immunzellprofilen

Das Colon ascendens Stent Peritonitis (CASP) ist ein hoch standardisiertes Modell für polymikrobiellen abdominalen Sepsis bei Nagetieren. Dieser Artikel beschreibt das chirurgische Verfahren der CASP. Die CASP Modell und seine Varianten ermöglichen die systematische Untersuchung verschiedener Probleme rund um das Thema Sepsis.

Colon ascendens Stent Peritonitis (CASP) - ein standardisiertes Modell für polymikrobiellen Abdominal Sepsis

Lernen Sie die standardisierte Zäkalschlammmethode zur Induktion von neonataler Sepsis bei 7-tägigen Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht reproduzierbare polymikrobielle Infektionsmodelle mit definierten humanen Endpunkten.

Eine kontrollierte Mausmodell für neonatale Sepsis Biofilm

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