Name: Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Lernen Sie die CARIC-Methode zur Erfassung von RNA-bindenden Proteinen in HeLa-Zellen mittels Click-Chemie. Dieses Protokoll ermöglicht die umfassende Analyse von Protein-RNA-Interaktionen und posttranskriptioneller Genregulation.

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Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation von China Zuschüsse 91753206, 21425204, und 21521003 und von nationalen Key Forschungs- und Entwicklungsprojekt 2016YFA0501500 unterstützt.

<ol><li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
<li>Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+Mendelian+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in Mendelian disease.</a> Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).</li>
<li>Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+neurodegeneration%3A+Seq+and+you+shall+receive%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive.</a> Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).</li>
<li>Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+proteins+that+bind+to+specific+RNAs+-+focus+on+simple+repeat+expansion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases.</a> Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).</li>
<li>Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brave+new+world+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A brave new world of RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).</li>
<li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+RNA-binding+domains+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells.</a> Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li>
<li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li>
<li>Liepelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+RNA-binding+proteins+in+macrophages+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiomyocyte+RNA-binding+proteome%3A+Links+to+intermediary+metabolism+and+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease.</a> Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).</li>
<li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nsmb/journal/v20/n1/abs/nsmb.2468.html">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).</li>
<li>Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mRNA-binding+proteomes+in+eukaryotic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).</li>
<li>Despic, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA-protein+interactions+underlie+the+zebrafish+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition.</a> Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).</li>
<li>Wessels, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+early+fly+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the early fly embryo.</a> Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).</li>
<li>Sysoev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+changes+of+the+RNA-bound+proteome+during+the+maternal-to-zygotic+transition+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila.</a> Nature Communications. 7, 12128(2016).</li>
<li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+determination+of+the+mRNA-binding+proteome+of+Arabidopsis+etiolated+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings.</a> Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).</li>
<li>Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana.</a> Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+crosslinked+mRNA-binding+proteins+captured+from+leaf+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts.</a> Plant Methods. 12, 42-53 (2016).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+of+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 17, 147-164 (2016).</li>
<li>Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulatory+networks+in+Trypanosoma+brucei%3A+insights+into+the+role+of+the+mRNA-binding+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome.</a> Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).</li>
<li>Nandan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+mRNA-binding+proteins+of+Leishmania+donovani+by+interactome+capture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture.</a> PLoS ONE. 12 (1), e0170068(2017).</li>
<li>Jankowsky, E., Harris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+nonspecificity+in+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).</li>
<li>Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+discovery+of+coding+and+noncoding+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).</li>
<li>Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reporters+for+monitoring+RNA+synthesis+and+poly%28A%29+tail+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).</li>
<li>Curanovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+stimulus-induced+polyadenylation+in+cells+using+a+poly%28A%29+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap.</a> Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).</li>
<li>Zheng, Y. X., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+an+alkyne-modified+ATP+analog+for+enzymatic+incorporation+into+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).</li>
<li>Nainar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+incorporation+of+azide+functionality+into+cellular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA.</a> ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).</li>
<li>Bao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+interactome+of+newly+transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Capturing the interactome of newly transcribed RNA.</a> Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).</li>
<li>Holmqvist, E., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. , Published online (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Aufrechterhaltung der Messe RNA-Integrität ist einer der Schlüssel zum erfolgreichen CARIC Experimente. Mit entsprechenden Liganden Cu(I) und sorgfältige Bedienung kann RNA-Abbau deutlich reduziert werden, obwohl Teilabbau beobachtet wurde. Die Ersatz-Verhältnisse der EU und 4SU in experimentellen Proben sind 1,18 % bzw. 0,46 % (Daten nicht gezeigt). Für intakte RNAs mit einer Länge von 2.000 nt, ca. 90 % der RNAs enthalten mindestens eine EU und eine 4SU. Für teilweise abgebauten RNAs mit einer Länge von 1.000 nt, ~...

Das menschliche Genom ist in verschiedenen Arten der Codierung und Forensisches RNAs (NcRNAs), einschließlich der mRNAs, rRNAs und tRNAs, kleinen nuklearen RNAs (SnRNAs), kleinen Nukleolus RNAs (SnoRNAs) und lange nicht-kodierende RNAs (LncRNAs)1transkribiert. Die meisten von diesen RNAs besitzen Kleidung der RBPs und fungieren als Ribonucleoprotein Partikel (RNPs)2. Daher ist eine umfassende Kennzeichnung der RBPs Voraussetzung zum Verständnis der regulatorischen Netzwerk zwischen RNAs und RBPs, die an verschiedenen Krankheiten beim Menschen3,4,5beteiligt ist.
Die letzten Jahren verzeichnen einen großen Schub von RBPs entdeckt in verschiedenen eukaryontischen Systemen2,6, einschließlich menschliche7,8,9,10,11, Maus12,13,14, Hefe9,15,16, Zebrafisch17, Drosophila Melanogaster18,19 , Caenorhabditis Elegans16, Arabidopsis Thaliana20,21,22und menschliche Parasiten23,24,25 . Diese Fortschritte haben durch eine RBP-Capture-Strategie von Castello Et Al. entwickelt erleichtert 7 und Baltz Et al. 8 im Jahr 2012 verbindet in Vivo UV-Vernetzung der RNA und seinen interagierenden Proteine, oligo(dT) Erfassung von poly(A) RNAs und Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomic profiling. Allerdings ist angesichts der Tatsache, dass poly(A) meist auf Reifen mRNAs vorhanden ist, die für nur ~ 3 % - 5 % der eukaryotischen Transkriptom26ausmachen, diese weit verbreitete Strategie nicht in der Lage RBPs Interaktion mit non-poly(A) RNAs, einschließlich die meisten ncRNAs und Pre-mRNAs.
Hier berichten wir über die Modalitäten einer neu entwickelten Strategie für die Transkriptom-weite Erfassung von poly(A) und non-poly(A) RBPs27. CARIC genannt, verbindet diese Strategie in Vivo UV-Vernetzung und metabolische Kennzeichnung von RNAs mit Photoactivatable und "anklickbar" Nukleosid-Analoga (enthält eine Bioorthogonal funktionelle Gruppe, die bei Klick Reaktion teilnehmen können), 4 - Thiouridine (4SU) und 5-Ethynyluridine (EU). Die Taste, um optimale Ergebnisse mit der CARIC-Strategie sind Schritte sind effiziente metabolische Beschriftung, UV-Vernetzung und klicken Sie auf die Reaktion und die Aufrechterhaltung der Integrität der RNA. Da Cu(I) verwendet als Katalysator in Klick Reaktion die Zersplitterung des RNAs verursachen können, unbedingt ein Cu(I) Liganden, die RNA Fragmentierung reduzieren können. Wir beschreiben, wie effiziente Klick Reaktionen in Zelle Lysates durchführen, ohne dass es zu schweren RNA-Abbau.
Obwohl RBP erfassen und Identifikation in HeLa-Zellen wird nur in diesem Protokoll beschrieben, kann die CARIC Strategie zu verschiedenen Zelltypen und möglicherweise zu lebenden Organismen angewendet werden. Neben RBP erfassen bietet dieses Protokoll auch optimierte schrittweise Anleitungen für MS Probenvorbereitung und Proteinidentifizierung und Quantifizierung, die hilfreich für diejenigen, die nicht vertraut mit Proteomic Experimente sind.

<table><tbody><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fötales Rinderserum)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 10099141</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin & Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>EU (5-Ethinyluridin)</td><td>Wuhu Huaren Co.</td><td>CAS:69075-42-9</td><td></td></tr><tr><td>4SU (4-Thiouridin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4509</td><td></td></tr><tr><td>10- mal; PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vernetzer</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td>Ausgestattet mit 365-nm-UV-Lampe</td></tr><tr><td>DEPC (Diethylpyrocarbonat)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>Zur Wasseraufbereitung. Hochgiftig!</td></tr><tr><td>Tris&middot; HCl, pH 7,5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>62476</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Biodee</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-freier Proteasehemmer-Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88265</td><td>Eine Tablette für 50 mL Lysepuffer.</td></tr><tr><td>LDS (Lithiumdodecylsulfat)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>15-ml-Ultrafiltrationsröhrchen (10 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0,5-ml-Ultrafiltrationsröhrchen (10 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Magnetkügelchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88816</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethylsulfoxid)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>41639</td><td></td></tr><tr><td>Azid-Biotin</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>AZ104</td><td></td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amin]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>762342</td><td></td></tr><tr><td>Natriumascorbat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Azid-Cy5</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>AZ118</td><td></td></tr><tr><td>LDS-Probenpuffer (4&fach;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>10% Bis-Tris Gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0301BOX</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Natriumdodecylsulfat)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15525017</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Brij-97 [Polyoxyethylen (20)-oleylether]</td><td>J& K</td><td>315442</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900257</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20353</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl (N-Lauroylsarcosin Natriumsalz)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>61743</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td></td><td></td><td>Version: 1.5.5.1</td></tr></tbody></table>

erfassung und identifizierung von rna-bindende proteine mit click-chemie-gestützte rna-interaktom erfassen (caric) strategie

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Eine umfassende Kennzeichnung der RNA-bindende Proteine (RBPs) ist Schlüssel zum Verständnis der posttranskritionelle regulatorischen Netzwerks in den Zellen. Eine weit verbreitete Strategie für RBP-Capture nutzt die Polyadenylation [Poly] Ziel RNAs, die tritt meist auf Eukaryotische reifer mRNAs, verlassen die meisten bindende Proteine der non-poly(A) RNAs nicht identifizierte. Hier beschreiben wir die Einzelheiten einer kürzlich berichtet Methode bezeichnet Klick Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC), die die Transkriptom-weite Erfassung von poly(A) und non-poly(A) RBPs ermöglicht durch die Kombination der metabolischen Kennzeichnung von RNAs in Vivo UV-Vernetzung und Bioorthogonal zu markieren.

Die repräsentativen Ergebnisse der Qualitätskontrolle Schritte werden vorgestellt. Die Ergebnisse enthalten die im Gel Fluoreszenzanalyse im Schritt 2.3.2 (Abbildung 1) beschrieben, der western-Blot-Analyse im Schritt 4.1.3 (Abbildung 2A) beschrieben und die Silber-Färbung Analyse im Schritt 4.2.2 (Abb. 2 b) beschrieben. Die Qualitätskontrolle-Schritte sind entscheidend für die Optimierung der CARIC ...

Ein detailliertes Protokoll zur Anwendung der Klick Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie um Proteine binden beide Codierung und Forensisches identifizieren RNAs wird vorgestellt.

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Diese Methode, CARIC, kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Posttranskription der Generholung zu beantworten, indem sie eine umfassende Zählung von RNA-bindenden Proteinen bereitstellt. Der Hauptvorteil von CARIC ist seine Fähigkeit, Proteine zu erfassen, die an verschiedene Arten von RNAs gebunden sind, wie z. B. mRNAs und nicht-kodierende RNAs. Diese Methode kann in verschiedenen Arten und dem Organismus verwendet werden, um die RNA-Protein-Interaktion bei der Arbeit zu untersuchen.Erstens, Kultur HeLa Zellen in ergänztDMEM bei 37 Grad Celsius in einer fünf Prozent CO2-Atmosphäre. Wenn die Zellen etwa 80 Prozent Zusammenfluss erreichen, ersetzen Sie das Kulturmedium auf jedem Gericht durch 15 Milliliter vorgewärmtes, frisches Medium. Fügen Sie 15 Mikroliter 100 Millimolar EU zu jeder Schale zu einer endgültigen Konzentration von einem Millimolar hinzu.Für experimentelle und keine UV-Kontrollproben fügen Sie 7,5 Mikroliter von 100 Millimolar vier SU zu jeder Schale. Bedecken Sie die Gerichte mit Folie und kulturdie Zellen für 16 Stunden unter den vorherigen Bedingungen. Danach die Hälfte der bisherigen EU-Menge und/oder vier SU zu den entsprechenden Platten hinzufügen und weitere zwei Stunden kultivieren.Um mit der In-vivo-Vernetzung zu beginnen, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie jede Schale dreimal mit PBS mit fünf MilliliterPBS pro Wäsche. Entfernen Sie die Rest-PBS so weit wie möglich. Für die experimentellen und keine vier SU-Kontrollproben legen Sie die Teller auf Eis, wobei der Deckel entfernt wird.Verwenden Sie einen UV-Verkreuzer, um die Zellen mit UV-Licht bei 365 Nanometern und bei zwei Jules pro Zentimeter quadratisch zu bestrahlen. Für die keine UV-Kontrollproben, legen Sie die Gerichte auf Eis und schützen Sie sie vor Licht. Als nächstes fügen Sie jedem Gericht einen Milliliter Prelysepuffer hinzu.Verwenden Sie einen Gummizellenheber, um die Zellen zu kratzen und die Prelysesuspension in einem 15 Milliliter Rohr zu sammeln. Fügen Sie einen Prelysepuffer in ein Rohr ein, das die Suspension von zwei Schalen enthält, wodurch das Gesamtvolumen auf sechs Milliliter eingestellt wird. Fügen Sie dann ein gleiches Volumen des R-Lyse-Puffers hinzu.Passieren Sie die Zelle mehrmals mit einer schmalen Nadel durch eine Spritze, bis das Lysat klar und homogen ist. Das Lysat bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation für eine Stunde inkubieren. Danach verdünnen Sie das Lysat in 20 Volumen des Verdünnungspuffers und teilen Sie es in 15 Milliliter-Fraktionen in 15 Milliliter-Untrafiltrationsröhren, molekulare Cutoff von 10 Kilodalton.Mit einem schwingenden Schaufelrotator drehen Sie die Rohre bei 4000 mal G und vier Grad Celsius für etwa 15 Minuten, bis jede Fraktion auf ein Volumen von weniger als einem Milliliter konzentriert ist. Fügen Sie 14 Milliliter Verdünnungspuffer zu jeder konzentrierten Lysatfraktion hinzu und wiederholen Sie den Konzentrationsprozess. Dann die Fraktionen kombinieren und mit dem zuvor beschriebenen Konzentrationsprozess auf ein Volumen von sechs Millilitern konzentrieren.Bereiten Sie zunächst den Reaktionsmix vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie diese Reaktionsmischung zu den sechs Millilitern vorgereinigten Lysats hinzu und mischen Sie sie gut. 162,5 Mikroliter Reduzierendes Reagenz hinzufügen und gut vermischen.Inkubieren Sie bei Raumtemperatur auf einem Orbital-Shaker bei 800 Rpm für zwei Stunden. Nach diesem Löschen der Reaktion durch Zugabe von fünf Millimolaren EDTA und Inkubation auf dem Orbital-Shaker bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Als nächstes teilen Sie die Reaktionsmischung zwischen zwei 50-Milliliter-Röhren auf, die jeweils vier Volumina von vorgekühltem Methanol enthalten und 30 Minuten lang bei minus 30 Grad Celsius brüten.Zentrifuge bei 4000 mal G und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie zwischen einem und zwei Milliliter vorgekühltem Methanol in das Pellet. Pipetten Sie nach oben und unten, um das Pellet aufzubrechen, um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig und ohne sichtbare Brocken aufgehängt wird.Wiederholen Sie den Zentrifugations- und Resuspensionsprozess zweimal. Ziehen Sie danach das Restmethanol so weit wie möglich heraus, um sicherzustellen, dass das Pellet nicht gestört wird. Fügen Sie 10 Milliliter Rekonstitutionspuffer und Pipetten nach oben und unten hinzu, um das Pellet aufzulösen.Zentrifuge bei 4000 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Dann übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr, um sicherzustellen, dass 20 Mikroliter der Probe für die Qualitätskontrolle zu sammeln. Die gereinigte und rekonstituierte Probe auf die vorbereiteten Streptavidin-Agarose-Perlen übertragen.Bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation über Nacht inkubieren. Drehen Sie die Perlen bei 4000 mal G für fünf Minuten. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr, um sicherzustellen, dass 20 Mikroliter der Probe für die Qualitätskontrolle gesammelt werden.Waschen Sie die Perlen mit 10 Milliliter Waschpuffer A.Inkubieren Mit sanfter Rotation bei 12 Umdrehungen bei 12 Umdrehungen und bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann drehen Sie die Perlen bei 4000 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Wasch- und Zentrifugationsprozess erneut.Wiederholen Sie diesen Waschvorgang für Waschpuffer B und Waschpuffer C, wie im Textprotokoll beschrieben. Danach die Perlen mit 10 Milliliter50 Millimolar Tris Hydrochlorid waschen. Drehen Sie die Perlen bei 4000 mal G für fünf Minuten nach unten.Entfernen Sie den Überstand und teilen Sie die Perlen gleichmäßig zwischen zwei 1,5 Mikrozentrifugenrohren. Um den gefangenen RNPs auszublenden, fügen Sie 400 Mikroliter vorbereiteten Biotin-Elutionspuffers zu 400 Mikrolitergewaschenen, abgesetzten Perlen hinzu. Inkubieren Sie auf einem Orbital-Shaker bei 1500 Rpm bei Raumtemperatur für 20 Minuten.Dann auf einem Orbital-Shaker mit einem Wärmeblock bei 1500 Rpm und 65 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 7800 mal G für eine Minute und sammeln Sie die ausentgangene RNP. 400 Mikroliter frischer Biotin-Elutionspuffer zu den Perlen geben.Wiederholen Sie den Inkubations- und Zentrifugationsprozess, um eine zweite Elute zu sammeln und die beiden Elues in einem einzigen 15-Milliliter-Rohr zu kombinieren. Als nächstes fügen Sie den kombinierten RNP-Elues drei Volumen des Verdünnungspuffers hinzu, um die Konzentration von SDS zu verringern. Konzentrieren Sie die Probe mit einem 0,5-Milliliter-Ultrafiltrationsrohr auf etwa 40 Mikroliter, wie im Textprotokoll beschrieben.Fügen Sie 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter RNase A hinzu und brüten Sie bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden, um RBPs von der vernetzten RNase zu befreien. Sammeln Sie zwei Mikroliter RBPs für die Qualitätskontrolle. Bei der Optimierung von CARIC-Protokollen sind Qualitätskontrollschritte von entscheidender Bedeutung.Die repräsentative Qualitätskontrolle der klickbeschriftten Proben erfolgt über In-Gel-Fluoreszenzanalysen. Nur die doppelt beschriftete Probe zeigt ein starkes Abstrichband bei dem hohen Molekulargewicht, das das Signal vernetzter RNPs darstellt. Das RNP-Signal wird abgeschafft, indem entweder die vier SU oder die EU weggelassen werden. Es kann auch durch Verdauung mit RNase abgeschafft werden A.In einige Fälle wird ein starkes verschmiertes Band in der Nr. 4 SU-Kontrollprobe beobachtet.Dieses Band stellt die beschriftete unvernetzte RNase dar, die sich während der Wärmeinnaturierung in den meisten Fällen verschlechtern wird. Die Qualitätskontrolle der Affinitäts-Umfragedatenwirdin wird durch Western-Blot-Analyse bewertet, die die Biotinsignale in den Proben sowohl vor dem Pulldown als auch nach dem Pulldown zeigt. Eine Silberfärbungsanalyse der erfassten RBPs zeigt, dass bei HeLa-Zellen die Gesamterfassungseffizienz zwischen 0,05 und 0,1 Prozent der Eingabeproteine liegt.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die RNase empfindlich auf Ribonukleasen reagiert. Halten Sie die experimentelle Umgebung so sauber wie möglich, um die Entmagnetisierung von RNase zu reduzieren. Nach diesem Verfahren kann die Protein-Almake-Identifikation mittels Massenspektrometrie vorgeformt werden, um die eisenbindenden Proteine zu enthüllen.Nach ihrer Entwicklung wird die CARIC-Technik den Weg für ein umfassenderes Verständnis der Posttranskriptions-OT-Verordnung am Arbeitsplatz ebnen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

RNA-Transkripte sind Gegenstand intensiver posttranskriptioneller Regelung, die durch eine Vielzahl von trans-agierenden RNA-bindende Proteine ​​(RBPs) vermittelt wird. Hier präsentieren wir Ihnen eine verallgemeinerbare Methode zur Identifizierung und präzise auf Transkriptom-weiten Skala der RNA-Bindungsstellen von RBPs.

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

Dieses Video zeigt einen in vitro RNA-Pulldown-Assay zur Identifizierung von RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die mit den Adenylat-Uridylat-Rich Element (ARE)-Sequenzen in mRNA interagieren. Die Ziel-RBPs aus einem Zelllysat werden mit einer RNA-Sonde gemischt, um RNA-Protein-Komplexe zu bilden. Die Komplexe werden mittels Affinitätsreinigung isoliert, wobei die Affinität der Desthiobiotin-Markierung der RNA-Sonde zu einem Streptavidin-markierten magnetischen Kügelchen genutzt wird.

RNA-Protein-Pull-Down-Assay zur Isolierung von RNA-bindenden Proteinen mittels Affinitätsextraktion

In diesem Video beschreiben wir die systematische Evolution von Liganden mit der Exponentialanreicherungsmethode (SELEX), um spezifische RNA-Bindungssequenzen für ein Zielprotein von Interesse zu identifizieren. Das Protein wird mit einem großen Pool randomisierter RNA-Sequenzen inkubiert, und die proteinbindenden RNA-Sequenzen werden isoliert, PCR-amplifiziert und sequenziert, um ihre Proteinbindungsstellen zu identifizieren.

SELEX-basierter In-vitro-Bindungsassay zur Identifizierung von RNA-Protein-Wechselwirkungen

Ein RNA-Pull-down-Protokoll wird für den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteine ​​(RBPs) und nicht-codierende sowie kodierenden RNAs hier optimiert. Ein RNA-Fragment von Androgen-Rezeptor (AR) wurde als Beispiel verwendet, zu zeigen, wie ihre RBP aus lystate primärer braunen Fettzellen zu erhalten.

Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Kultur

RNA-Protein-Wechselwirkungen sind das Herzstück vieler zellulärer Prozesse. Hier beschreiben wir eine in vivo Methode, um spezifische RNA zu isolieren und neue Proteine zu identifizieren, die mit ihr assoziiert sind. Dies könnte ein neues Licht darauf werfen, wie RNAs in der Zelle reguliert werden.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

Wir beschreiben ein Protokoll zur RNA-bindende Proteine und RNA-bindende Regionen in lebenden Zellen mit UV-vermittelten Photocrosslinking und Massenspektrometrie.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anreicherung endogener RNA-Bindungsstellen oder "Footprints" von RNA:Protein(RNP)-Komplexen aus Säugetierzellen vor. Dieser Ansatz umfasst zwei Immunpräzipitationen von RNP-Untereinheiten und wird daher als RNA-Immunpräzipitation im Tandem (RIPiT) bezeichnet.

Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)

Hier stellen wir ein modifiziertes CLIP-seq-Protokoll namens FbioCLIP-seq mit FLAG-Biotin-Tandemreinigung vor, um die RNA-Ziele von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) in Säugetierzellen zu bestimmen.

Transkriptom-weite Profilierung von Protein-RNA-Wechselwirkungen durch Vernetzung und Immunpräzipitation durch FLAG-Biotin-Tandemreinigung

Die kinetische Vernetzung und Analyse von cDNA ist eine Methode, die es ermöglicht, die Dynamik von Protein-RNA-Interaktionen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Hier wird das Protokoll detailliert beschrieben, einschließlich des Wachstums von Hefezellen, der UV-Vernetzung, der Ernte, der Proteinreinigung und der Vorbereitungsschritte der Next-Generation-Sequencing-Bibliothek.

Überwachung der Protein-RNA-Interaktionsdynamik in vivo mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung von χCRAC

In dieser Arbeit stellen wir eine optimierte in vitro Methode vor, um Proteininteraktoren spezifischer RNA-Sequenzen aufzudecken, zu quantifizieren und zu validieren, wobei Gesamtproteinextrakt aus menschlichen Zellen, Streptavidin-Kügelchen, die mit biotinylierter RNA beschichtet sind, und Massenspektrometrie-Analysen verwendet werden.

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Lernen Sie die CARIC-Methode zur Erfassung von RNA-bindenden Proteinen in HeLa-Zellen mittels Click-Chemie. Dieses Protokoll ermöglicht die umfassende Analyse von Protein-RNA-Interaktionen und posttranskriptioneller Genregulation.

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

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