Name: Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Lernen Sie die Aufreinigung intakter Chloroplasten aus Arabidopsis-Blättern mit Differentialzentrifugation und Gradientenmethoden. Diese Technik ermöglicht die Proteinlokalisierung in Envelope, Stroma und Thylakoiden.

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Diese Arbeit wurde durch eine gemeinsame Promotionsstipendium an IB aus der INRA Pflanze Abteilung Biologie und Zucht und Labex GRAL (ANR-10-LABX-49-01) unterstützt. Wir würden auch gerne ANR Projekt ANR-15-IDEX-02, Dr. Olivier Vallon (IBPC Paris) auf Antikörper gegen lhcp- und Dr. Renaud Dumas (LPCV, Grenoble) anerkennen für Antikörper gegen KARI.

1. Vorbereitung der Puffer, Stammlösungen und Steigungen
<ol><li>Bereiten Sie die folgenden Stammlösungen, die bis zu 6 Monate bei 4 ° c gelagert werden können<ol>
<li>Bereiten Sie 1 L Tricine Puffer (1 M, pH 8,4) und Tricine Buffer (1 M, pH 7.6). Stellen Sie pH-Wert durch Zugabe von KOH Pellets.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 L der Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA, 0,5 M, pH 8) und 3-(N-morpholino) Propan sulfonsäure (MOPS) Puffer (1 M, pH 7,8). Stellen Sie pH-Wert durch Zugabe von NaOH Pellets.</li>
		<li>Bereiten Sie 50 mL von MgCl2 (1 M).</li>
		<li>50 mL der Protease Inhibitoren Lösungen vorbereiten: Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF eingerichtet in Isopropanol, 100 mM), Benzamidine-Hydrochlorid-Hydrat (100 mM), und ε-Caproic Aminosäure (50 mM). Hinweis: Während PMSF und Aminosäure Caproic monatelang bei 4 ° C in Lösung stabil sind, sollte Benzamidine Lösung bei-20 ° c gelagert werden</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die folgenden Lösungen am Vortag das Experiment und speichern Sie alle Lösungen bei 4 ° c<ol>
<li>Bereiten Sie 4 L Schleifen mittlerer pH 8.4 enthält Tricine-KOH (20 mM, pH 8,4), Sorbit (0,4 M), EDTA (10 mM, pH 8) und Nahco33 (10 mM). Stellen Sie pH-Wert durch Zugabe von NaOH Pellets. Rinderserumalbumin (BSA) bei 0,1 % (w/V) kurz vor dem Einsatz hinzufügen und gut verrühren.</li>
		<li>Bereiten Sie 500 mL waschen Medium (2 X) pH 7.6 mit Tricine-KOH (20 mM, pH 7,6), Sorbit (0,8 M), MgCl2 (5 mM) und EDTA (2,5 mM). Stellen Sie pH-Wert durch Zugabe von NaOH Pellets. Verdünnen Sie solche Lösung nach der Zubereitung des Percoll gradient Lösung waschmedium (1 X) zu erhalten.</li>
		<li>Bereiten Sie 200 mL Percoll-gradient-Lösung zur Reinigung von Chloroplasten durch Mischen Percoll mit waschmedium (2 X) auf ein gleiches Volumen zu einer endgültigen Lösung bei 50 % (V/V) Percoll / 0,4 M Sorbit.</li>
		<li>Chloroplasten Fraktionierung bereiten Sie 50 mL Saccharose-Lösungen durch Mischen von MOPS (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM) und unterschiedlichen Konzentrationen von Saccharose (0,3 M, 0,6 M und 0,93 M vor).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die folgenden Steigungen und Puffer vor Beginn des Experiments.<ol>
<li>Bereiten Sie sechs Röhren Percoll Gradienten (jeweils enthaltend 30 mL einer 50 % Percoll / 0,4 M Sorbit) durch Zentrifugation bei 38.700 x g 55 min bei 4 ° C. Halten Sie die Bremse aus Mischung von den Steigungen zu verhindern. Nach Zentrifugation speichern Sie die Röhrchen mit den vorgeformten Gradienten in einem kalten Raum bis zur Verwendung.</li>
		<li>Bereiten Sie vier Röhren von Saccharose Steigungen, mit jeder Verlauf der drei folgenden Saccharose Schichten gebildet: 3 mL von 0,93 M, 2,5 mL von 0,6 M und 2 mL von 0,3 M Saccharose. Überlagern Sie sorgfältig jede Schicht mit einer peristaltischen Pumpe mit 0,93 M unten beginnend und endend mit 0,3 M an der Spitze.</li>
		<li>Chloroplasten Lyse mit MOPS (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM), PMSF (1 mM, eingerichtet in Isopropanol), Benzamidine-Hydrochlorid-Hydrat (1 mM) und ε-Caproic Aminosäure (0,5 mM) bereiten Sie 50 mL hypotone Medium vor. Speichern Sie den Puffer auf dem Eis bis zur Verwendung.</li>
		<li>Bereiten Sie 50 mL Waschpuffer mit MOPS (10 mM, pH 7,8), PMSF (1 mM), Benzamidine-Hydrochlorid-Hydrat (1 mM) und ε-Caproic Aminosäure (0,5 mM) Membran. Speichern Sie den Puffer auf dem Eis bis zur Verwendung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Wachstum und die Ernte von Arabidopsis Blätter
<ol><li>Wachstum der Arabidopsis -Pflanzen Vorbereitung 4 große Kunststoff-Töpfe (für eine Gesamtfläche von 0,5 bis 1 m2) von Arabidopsis -Pflanzen durch Aussaat der Samen in jeder Pfanne 30 mg. Arabidopsis -Pflanzen mit einer Lichtintensität von 150 μM m-2 s-1für 5 Wochen bei 12-h-Licht-Zyklus bei 23 ° C (Tag) / 18 ° C (Nacht) wachsen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Pflanzen in einem Raum dunkel und kalt (4 ° C) über Nacht vor dem Experiment (zur Reduzierung der Stärkekörner in Chloroplasten).</li>
	<li>Vorher wiegen Sie 1 L Becher und dann legen Sie es auf dem Eis vor Beginn der Ernte von Blattmaterial.</li>
	<li>Ernten Sie Arabidopsis Blätter durch die Vermeidung von Boden (Kompost). Erneut wiegen Sie das Becherglas und nehmen Sie das Gewebe Gewicht. Hinweis: 400 bis 500 g des Blattmaterials dürften aus vier Pfannen.</li>
	<li>Blätter in einem kalten Zimmer mit 2 L Puffer Schleifen zu homogenisieren (Hinzufügen von BSA vor Gebrauch) dreimal / 2 s jedes Mal in einem Mixer mit hoher Geschwindigkeit.</li>
	<li>Filtern Sie das Homogenat in einem kalten Zimmer mit 4 Schichten aus Musselin und eine Schicht aus Nylon-Blutex. Drücken Sie vorsichtig die Homogenat Blätter in Musselin/Nylon-Blutex, die Flüssigkeit zu extrahieren.</li>
	<li>Das restliche Gewebe in den Mixbecher für einen zweiten Extraktion zu erholen. Wiederholen Sie die Schritte, 2.5 und 2.6 mit 2 L des Schleifens Mittel- und neue 4-5 Schichten aus Musselin (in einem kalten Zimmer).</li>
</ol>3. Reinigung des rohen Chloroplasten mit Differentielle Zentrifugation
<ol><li>Ebenso verteilen Sie den groben Zelle Extrakt in sechs 500 mL Flaschen und stellen Sie die Flaschen auf dem Eis vor Zentrifugation. Zentrifuge für 2 min, sobald die maximale Geschwindigkeit (2.070 x g) (maximale Beschleunigung und Bremse auf 4 ° C) erreicht ist.</li>
	<li>Den überstand sanft zu verwerfen.</li>
	<li>Aspirieren des restlichen Überstands mit einer Wasserpumpe und die Pellets mit konzentrierter Rohöl Chloroplasten auf Eis.</li>
	<li>Sanft Aufschwemmen Pellets durch Hinzufügen von einen minimalen Volumen waschmedium (1 X) (Endvolumen von kombinierten Chloroplasten Suspensionen = 36 mL) mit einem Pinsel oder einem gebogenen Kunststoffspachtel. Verwenden Sie ein 10 mL pipettieren, 3 mL waschmedium in jeder Flasche hinzuzufügen. Hinweis: Verwenden Sie pipettieren nicht mit sehr feinen Spitzen, um Bruch der Chloroplasten zu vermeiden. Alternativ schneiden Sie die blaue Spitze von einem Pipettieren mit einer Rasierklinge, ein größeres Loch zu generieren.</li>
	<li>Sammeln Sie die resuspendierte Chloroplasten in eine Röhre mit einer 10 mL pipettieren. Mischen Sie vorsichtig durch invertieren die Röhre um eine homogene Suspension vor der Verladung auf Percoll Gradienten zu erhalten.</li>
</ol>4. Reinigung des intakten Chloroplasten auf kontinuierliche Percoll Steigung
<ol><li>Laden Sie langsam 6 mL der Suspension Chloroplasten übereinander die sechs Percoll-Gradienten mit einer 10 mL pipettieren, um Bruch der Chloroplasten zu vermeiden.</li>
	<li>Zentrifugieren der Gradienten für 10 min bei 13.300 x g, 4 ° C mit einem schwingen-Eimer-Rotor. Hinweis: Die Beschleunigung sollte langsam sein, und die Bremse sollte getrennt werden (Bremse ausgeschaltet oder langsam Abbremsen), um zu verhindern, mischen die Percoll-Gradienten.</li>
	<li>Aspirieren Sie die obere Phase, die gebrochenen Chloroplasten und intakte Mitochondrien mit einem Wasserpumpe enthält, und rufen Sie dann intakte Chloroplasten vorhanden in der unteren phase (die breitere dunkelgrünen Band) mit einer 10 mL pipettieren. Achten Sie darauf, dass Sie keine Kerne und zellenrückstand (gefunden an der Unterseite des Rohres) mit den intakten Chloroplasten (Abbildung 2A) abzusaugen.</li>
	<li>Verdünnen Sie 3-4-fach das intakte Chloroplasten-Fahrwerk mit waschen Puffer (1 X). Zentrifuge für 2 min, sobald die maximale Geschwindigkeit (2.070 x g, 4 ° C) erreicht ist (maximale Beschleunigung und Bremsen).</li>
	<li>Den überstand sorgfältig zu verwerfen.</li>
	<li>Völlig Aspirieren des restlichen Überstands mit einer Wasserpumpe und halten das Pellet konzentrierte intakt Chloroplasten auf Eis.</li>
	<li>Halten Sie vor der Chloroplasten Lyse eine Aliquote intakt Chloroplasten Bruchteil in etwa 1 mL waschmedium (1 X) für weitere Analysen mit Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) und westliche Beflecken. Halten Sie eine kleine aliquoten von diese intakten Chloroplasten zur Bestimmung der Proteinkonzentration. Speichern Sie die intakte Chloroplasten Bruchteil in flüssigem Stickstoff für weitere Experimente.</li>
</ol>5. Lyse der intakten Chloroplasten mit eine hypotone Puffer und Reinigung der Chloroplasten Sub Fächer auf diskontinuierliche Saccharose Steigungen
<ol><li>Lösen Sie die gereinigten intakten Chloroplasten durch resuspending das Pellet in hypotone Medium, die Protease-Inhibitoren (das endgültige Volumen sollten nicht mehr als 12 mL) enthält. Hinweis: Von diesem Schritt ist die Verwendung von Pipettieren mit feinen Spitzen (blaue Tipps) möglich da Unversehrtheit der Chloroplasten nicht mehr erforderlich ist (pipettieren Chloroplasten rauf und runter, solange Pellet nicht ganz Nukleinsäuretablette ist). Arabidopsis Chloroplasten sind sehr zerbrechlich (im Vergleich zu Erbse Chloroplasten, zum Beispiel) und ihrer Lyse ist fast sofort nach der Inkubation in hypotone Medium.</li>
	<li>3 mL lysierten Chloroplasten auf der Oberseite jedes vorgeformten Saccharose Steigungen mit einer peristaltischen Pumpe langsam zu laden.</li>
	<li>Ultrazentrifugen Gradienten für 1 h (70.000 x g, 4 ° C). Balance-Paare von Röhrchen mit hypotone mittlere Puffer vor der Zentrifugation.</li>
	<li>Sorgfältig die Stromale lösliche Proteine wiederherstellen, indem Sie pipettieren der oberen Phase des Verlaufs (3 mL aus jeder Verlauf) (Abb. 2 b). Nehmen Sie ein Aliquot zur Bestimmung von Protein-Konzentration-7. Speichern Sie das Stroma in flüssigem Stickstoff für weitere Experimente.</li>
	<li>Aspirieren der verbleibenden oberen Phase jeder Verlauf bis zu das gelbe Band mit einem Wasserpumpe.</li>
	<li>Rufen Sie das gelbe Band (Umschlag) mit einem pipettieren (ca. 1 mL aus jeder Verlauf). Bündeln Sie die Umschläge in einer Röhre.</li>
	<li>Entfernen Sie die restlichen Phase jeder Verlauf bis zu der Thylakoidmembran Pellet mit einem Wasserpumpe.</li>
</ol>6. Waschen und Konzentration der Thylakoidmembran und Umschlag-Membran-Systeme
<ol><li>Aufschwemmen der Thylakoidmembran Pellets (grüne Pellets) in ein Mindestvolumen (2 mL) der Membran Waschpuffer (1 X) (mit Protease-Inhibitoren).</li>
	<li>Verdünnen Sie die Umschlag und Thylakoidmembran Suspensionen 3-4-fach in Membran waschmedium (stellen Sie die Lautstärke auf 10 mL) und Ultrazentrifugen für 1 h (110.000 x g, 4 ° C). Gleichen Sie Paare von Röhrchen mit Waschpuffer vor Zentrifugation Membran aus.</li>
	<li>Aspirieren Sie sorgfältig die Überstände mit einem Wasserpumpe.</li>
	<li>Fügen Sie ca. 100 µL Waschpuffer (mit Proteaseinhibitoren) zum Umschlag Pellet Membran. Nehmen Sie ein Aliquot zur Bestimmung von Protein-Konzentration-7. Speichern Sie die gereinigten Umschlag Membran Vorbereitung in flüssigem Stickstoff.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Thylakoids Pellet in 3 mL Waschpuffer (mit Proteaseinhibitoren) Membran. Nehmen Sie ein Aliquot zur Bestimmung von Protein-Konzentration-7. Thylakoidmembran Membran Bruchteil in flüssigem Stickstoff zu speichern.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der vorliegende Artikel soll die Schritt-für-Schritt-Protokoll verwendet zur Reinigung von Chloroplasten (und ihre Sub-Fächer) detail aus Arabidopsis Thaliana. Da die Verfügbarkeit von seine vollständige Genomsequenz vor fast zwei Jahrzehnten und große Sammlungen von Einfügung Mutanten der Community zur Verfügung gestellt ist Arabidopsis als Modellpflanze jetzt allgemein akzeptiert. Während diese Pflanze für gentechnische Ansätze perfekt angepasst wurde, mussten jedoch Pflanzenforscher Biochemische und physiologische Werkzeuge, um dieses neue Modell anzupassen. Protokolle ermöglichen photosynthetisch aktive Chloroplasten aus Blättern der etablierten biochemische Modelle wie Spinat12 oder Erbse13 so reinigen mussten angepasst werden. Die erste Methode beschreiben, Reinigung von Arabidopsis Chloroplasten erschien 199814, kurz vor der Veröffentlichung die Arabidopsis Genom-Sequenz. Mehrere Jahre erfolgten spätere, einfache Methoden zur Isolierung von Arabidopsis Chloroplasten mit Studien zur in-vitro- Import von Proteinen in gereinigten Organellen analysieren kompatibel zur Verfügung15,16. Jedoch erlaubte diese Methoden nicht, um hohe Reinheit und Erhaltung der photosynthetischen Aktivität des gereinigten Chloroplasten zu kombinieren. Vor kurzem war17, eine schnelle Methode festgestellt, die beruht auf der Verwendung von Percoll Gradienten ermöglicht, um fast 90 % der Photosynthese-Rate gemessen in den starten Blättern von Arabidopsis zu behalten.
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht, um Arabidopsis Chloroplasten auf ein hervorragendes Niveau der Reinheit zu reinigen. In der Tat, immunologische Erkennung von Verunreinigungen aus anderen Abteilungen der Zelle gezeigt, dass die gereinigten Organellen frei von mitochondrialen sind und Plasmamembran Marker9,10. Dieses Protokoll war auch effizient zu reinigen Chloroplasten aus mehreren Arabidopsis Ökotypen18, wie Columbia (Col) oder Wassilewskija (WS), d. h. die Ökotypen, die für Genom verwendet oder zum Ausdruck gebracht wurden-Sequenz Tags (ESTs) Sequenzierung Projekten aber auch zu generieren T-DNA Einfügung Mutanten in Arabidopsis. Das heißt, wenn Proteomics Studien werden durchgeführt müssen, ist dieses Protokolls kompatibel mit diesen zwei Referenz-Ökotypen von Arabidopsis. Schließlich ist die Ausbeute an Chloroplasten unter Verwendung dieses Protokolls ähnlich dem erhält man, wenn ausgehend von Spinat oder Erbsen Blätter (z.B. 3 %, gemessen von der Chlorophyllgehalt in die Percoll-gereinigte Chloroplasten im Vergleich zu den insgesamt Chlorophyll Menge Blätter ab). In Bezug auf Proteine ergibt sich in der Nähe von 50 mg der Chloroplasten Proteine, wenn Organellen von 500 g 5 Wochen altes Baby Arabidopsis Blätter gereinigt werden.
Zu solchen guten Ertrag (und Chloroplasten Integrität), man sollte jedoch besonderes Augenmerk auf mehrere Schritte bei der Verwendung dieses Protokolls. Die Chloroplasten in Arabidopsis ist eine extrem fragilen Struktur (Dies gilt nicht für Erbse Chloroplasten, zum Beispiel). Besondere Aufmerksamkeit ist daher erforderlich, um große Bruch der Organellen während der Reinigung zu vermeiden. Die Anzahl und Größe der Stärkekörner in Chloroplasten vorhanden sind entscheidend für die Zubereitung von intakten Chloroplasten. In der Tat werden Chloroplasten mit großer Stärke Getreide während der anfänglichen differentielle Centrifugations Schritte mit dem Ziel, die grobe Chloroplasten Brüche12konzentrieren im allgemeinen gebrochen werden. Daher sollten die Pflanzen über Nacht in einem Zimmer dunkel und kalt (4 ° C) vor dem Experiment, um die Stärke zu verringern gehalten werden.
Neue Benutzer dieses Protokolls könnte versucht sein, von größeren Mengen an Blattmaterial (riesige Rosetten aus alten Arabidopsis -Pflanzen mit großen Blättern) zu starten versucht, die Wiederherstellung der gereinigten Chloroplasten zu verbessern. Jedoch in unseren Händen ausgehend von jungen Blätter (5 Wochen alten) ist der beste Kompromiss, Ertrag, Reinheit und Integrität des gereinigten Organellen zu kombinieren. In der Tat sind auch alte Blätter in Phenolverbindungen hochangereichertes, die gezeigt wurden, und Chloroplasten Integrität19negativ beeinflussen.
Schließlich ist die erste Extraktionsschritt (Schleifen des Gewebes) ein weiterer wichtiger Schritt. Der Mischprozess muss auf wenige Sekunden beschränkt. Wie bereits erwähnt, könnte neue Benutzer versucht sein, verwenden Sie länger zu mischen, so erwartet, um den Ertrag der gereinigten Organellen stark zu verbessern. Wenn längere mischen effektiv mehr Material aus den Blättern veröffentlicht, scheint es jedoch, dass der Anteil der gebrochenen Chloroplasten in den groben Zelle Extrakt rapide zunimmt. Aufgrund dieses hohen Verhältnis von gebrochen, um intakte Chloroplasten im Medium weitere Reinigungsschritte (Trennung Percoll Gefälle) werden stark beeinflusst und die Ausbeute der Reinigung ist unerwartet niedriger.
Verfügbarkeit von speziellen Protokollen Organellen zu reinigen haben eine Reihe von hohen Durchsatz erlaubt Proteomics-basierten Experimente an Chloroplasten Proben durchgeführt werden. Diese Daten wurden in mehreren öffentlichen Datenbanken6, wodurch für die Biologen im Bereich eine genaue Lokalisierung der subzelluläre (und Subplastidial) für viele Chloroplasten Proteine zur Verfügung gestellt. Dies galt vor allem für Umschlag Proteine deren Identität und Lage blieb weitgehend unbekannt vor dieser Analysen, da Umschlag Membranen eine kleine Chloroplasten-Komponente (1-2 % der Chloroplasten Proteine) darstellen, während Sie spielen eine Schlüsselrolle in Chloroplasten Stoffwechsel und Biogenese5,20. Mit dem beschriebenen Protokoll hier analysierten wir vor kurzem die Zusammensetzung der drei wichtigsten Chloroplasten Fächer von Arabidopsis (d. h. das Stroma, die Thylakoids und die Umschlag-Membran-System)9. Basierend auf einem semi-quantitative Proteomik-Ansatz (spektrale zählen), konnten wir beurteilen die Partitionierung von Hunderten von Proteinen in diesen drei Fächern Chloroplasten.
Während dieses Protokoll ermöglicht es, um die drei Hauptfächer der Chloroplasten von Arabidopsiszu reinigen, ist es auch möglich, zusätzliche Sub Fächer in den Chloroplasten zu unterscheiden. In der Tat besteht die Umschlag-Membran-System die innere und die äußere Hülle Membranen (Abbildung 1). Eine Methode, um innere und äußere Hülle Membranen aus Arabidopsis Chloroplasten reinigen bleibt jedoch nach bestem Wissen und gewissen hergestellt werden. Innere und äußere Hülle Membranen können aus Spinat21 oder Erbse22 Chloroplasten gereinigt werden. Die wichtigste Einschränkung der Arabidopsis ergibt sich meist aus der einschränkenden Mengen an Ausgangsmaterial. Ab 500 g Arabidopsis Blätter (die bereits 1 m2 Fläche in einer Kammer Wachstum erfordert) kann nur 100 µg Umschlag Proteine zu reinigen. Auf der anderen Seite ist es einfach, mit zu beginnen, 5-10 kg Spinat aus dem Markt, um große Menge an Chloroplasten8 reinigen und am Ende mit einer Ausbeute von 3 bis 10 mg Umschlag Proteine aus diesem Material hinterlässt.
Das gleiche gilt für die Thylakoidmembran Sub-Fächer. In der Tat Thylakoids bestehen aus Licht membranvesikel (Lamellen) und dichten Strukturen (Grana) (Abbildung 1). Bestimmte Protokolle stehen diese beiden Fächer in Arabidopsis23,24zu unterscheiden. Wieder, inventarisiert basierend auf eine quantitative Proteomik-Analyse, wir vor kurzem die Proteine in diesen zwei Sub-Fächer24vorhanden. Diese Ansätze, zusammen mit einer eingehenden Untersuchung der Literatur, Validierung, oder Hypothesen für den Subplastidial Standort Hunderter Thylakoidmembran Proteine erlaubt. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass zusätzliche Membrane Microdomains an den gebogenen Rand der Thylakoids vorhanden sind. Diese Lipoprotein Sub Fächer oder Plastoglobules, sind dauerhaft zu Thylakoidmembran Membranen gekoppelt und enthalten eine bestimmte Gruppe von Proteinen25. Unter Verwendung dieses Protokolls, ist es somit nicht möglich, diese spezifische Proteine aus anderen Thylakoidmembran Komponenten zu unterscheiden.
Einige echte (bekannten) Umschlag, Stroma oder Thylakoidmembran Komponenten fehlen noch aus der Liste der gefundenen Proteine. Die kontinuierliche Verbesserung der Empfindlichkeit der MS wird mit gezielten Biochemische und immunologische Analysen große Hilfe, den Chloroplasten-Inhalt auf ein komplettes Repertoire an die Zusammensetzung der verschiedenen Sub-Fächer zu überdenken sein.

Chloroplasten sind wesentliche Bestandteile der Pflanzenzellen. Sie stammen aus einem Cyanobakterien Vorfahren, der eine Endosymbiose unterzogen und schließlich entwickelte sich als eine Organelle Evolution1,2. Solche Organellen enthalten drei Hauptfächer (Abbildung 1). Envelope-Systems besteht aus einer inneren und einer äußeren Membranen umgeben die Organellen. Diese Doppelmembran-System enthält verschiedene Enzyme im Stoffwechsel der Fette und Pigmente und widmet sich vor allem um die Kontrolle über die Kommunikation zwischen Plastiden und die Zellflüssigkeit. Es enthält verschiedene Verkehrssysteme, mit denen die Einfuhr von nuklearen-kodierten Proteine und den Austausch von Ionen und Metaboliten zwischen dem Cytosol und die Chloroplasten so regulieren wichtige Stoffwechselfunktionen der pflanzlichen Zelle3,4 . Das Stroma der lösliche Phase der Chloroplasten, enthält Enzyme des Calvin-Zyklus (CO2 Assimilation), die Synthese von verschiedenen Metaboliten wie Aminosäuren und Vitamine und die Transkription und Translation Maschinen von der Plastiden. Die Thylakoidmembran Membran ist ein weithin organisierte interne Membran-Netzwerk wo die leichte Phase der Photosynthese stattfindet. Chloroplasten sind dabei der Ort, wo wichtige Stoffwechselwege5auftreten.
Um neue Regulierungsmechanismen zu entschlüsseln, die Chloroplasten Dynamik und Physiologie steuern, deshalb definieren die Sub-plastidial Lokalisierung der Chloroplasten Proteine entscheidend für gezielte Untersuchungen mit dem Ziel, besser zu verstehen, Proteine Funktionen unterstützen im Modell Organismen6. Um Zugang zu den echten Subplastidial Lokalisierung dieser Proteine bekommen, gilt es somit von hochreinen Subplastidial Fraktionen (Umschlag Membranen, Stroma und Thylakoids) beginnen. In diesem Zusammenhang ist das Ziel dieses Protokolls intakte Chloroplasten von Arabidopsis Blätter mit differenzierten Centrifugations und kontinuierliche Percoll Steigungen zu reinigen und zu ihnen fraktionieren mit diskontinuierlichen Saccharose Steigungen, in drei Sub-Fächer (z. B. Umschlag, Stroma und Thylakoids). Die hier beschriebene Methode bietet auch Anweisungen, um die Reinheit des gereinigten Sub-Organellen Brüche mit Hilfe von Markern, die verschiedenen Chloroplasten Sub Fächer zugeordnet zu beurteilen. Dieses Protokoll ist wertvoll für die Lokalisierung der Subplastidial von Proteinen mit Immunoblotting und zur weiteren Analyse des gereinigten Fraktionen mittels Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomik-Studien.

<table><tbody><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>Tricin</td><td>Roth</td><td>6977.2</td><td></td></tr><tr><td>Sorbit</td><td>Roth</td><td>6213.1</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Promega</td><td>H5032</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Roth</td><td>8551.1</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Roth</td><td>8076.5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidin</td><td>, Sigma</td><td>B6506</td><td></td></tr><tr><td>&epsilon;-Aminocapronsäure,</td><td>Fluka</td><td>21530</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS)</td><td>Roth</td><td>6979.3</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Roth</td><td>9286.2</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid Lagerbestand: 30% (w/v) Acrylamid, 0,8% (w/v) Bisacrylamid</td><td>Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Roth</td><td>1057.1</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T-8133</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Roth</td><td>9592.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>USB</td><td>US12370</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Roth</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>Gelfärbemedium</td><td>Clini-sciences</td><td>GEN-QC-STAIN</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>CARLO ERBA</td><td>528151</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>Fettfreies Milchpulver</td><td>R&eacute; gilait</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>H/1150/PB15</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Pellets Sigma</td><td>1.05012</td><td></td></tr><tr><td>NaOH Pellets</td><td>CARLO ERBA</td><td>480507</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HMA1 Antikörper</td><td></td><td>Seigneurin-Berny et al, 2006</td><td>Verwendet in einer Verdünnung von 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-KARI Antikörper</td><td></td><td>Ferro et al, 2010</td><td>Wird in einer Verdünnung von 1:1000 verwendet</td></tr><tr><td>Anti-LHCP-Antikörper</td><td></td><td>Vallon et al, 1991</td><td>Verwendet in einer Verdünnung von 1:25.000</td></tr><tr><td>P-Cumarsäure</td><td>Sigma</td><td>C-9008</td><td></td></tr><tr><td>Luminol (3-Aminophalhydrazin)</td><td>Fluka</td><td>9253</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO).</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Große (30 cm & mal 45 cm) Kunststoffkoffer</td><td>Puteaux</td><td>162135</td><td></td></tr><tr><td>A. thaliana Samen</td><td></td><td></td><td>Ca. 30 mg Samen für eine ganze Kiste</td></tr><tr><td>Kompost "Floragard"</td><td>Puteaux</td><td>16311770</td><td></td></tr><tr><td>Anbauräume</td><td></td><td></td><td>12-Stunden-Lichtzyklus, eingestellt auf 23°; C (Tag) / 18°; C (Nacht) mit einer Lichtstärke von 150 &mu; mol/m2/s.</td></tr><tr><td>Musselin oder Käsetuch</td><td>Raffin</td><td>70116</td><td>80-cm-groß</td></tr><tr><td>Nylon blutex 50 &mu; m aperture</td><td>Tripette et Renaud, Sailly Saillisel</td><td></td><td>50 &mu; m Apertur</td></tr><tr><td>Motorbetriebener Mixer, drei Geschwindigkeiten, 1 Gallone (4 l) Fassungsvermögen</td><td>Waring Mixer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Starrwinkelrotoren JLA-10.500 (6 und mehr 500 ml Plastikflaschen)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman JA-20 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JA-20 (6 und mal 50 mL Polypropylen-Röhrchen)</td><td>Sorvall Instrumente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schwingrotor JS-13.1 (6 und 50 mL Polycarbonat-Röhrchen)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotor (6 & 13,2 mL ultraklare Röhrchen)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotorröhrchen (13,2 mL ultraklare Röhrchen)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge (Beckman L7)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge (Beckman JSE-06D18)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf 5415D oder gleichwertig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserpumpe, die über ein Kunststoffrohr mit einer Pasteurpipette verbunden ist.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulosemembranen</td><td>BA85, Schleicher und Schuell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>3MM, Whatman, Maidstone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltische Pumpe</td><td></td> mit flüssigem Stickstoff <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Gilson <tr><td>Gel Elektrophoreseapparatur mit den verschiedenen Zubehörteilen, die für die Proteintrennung durch Elektrophorese erforderlich sind (Kämme, Platten und Gießapparate).</td><td>Bio-Rad Protean 3 oder gleichwertig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System für den Proteintransfer auf Nitrozellulosemembranen</td><td>Bio-Rad Protean 3 oder gleichwertig</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung der chloroplasten sub fächer von arabidopsis für die analyse von protein-lokalisierung durch immunoblotting oder proteomics

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasten sind wesentliche Bestandteile der Pflanzenzellen. Diese Plastiden erfüllen viele wichtige Funktionen, wie Assimilation von Kohlenstoff, Schwefel und Stickstoff sowie Synthese von wesentlichen Metaboliten. Diese Organellen bestehen aus den folgenden drei wichtigsten Sub-Fächer. Der Umschlag, gekennzeichnet durch zwei Membranen, umgibt die Organellen und steuert die Kommunikation von Plastiden mit anderen Fächern der Zelle. Das Stroma ist die lösliche Phase der Chloroplasten und der Haupt-Website wo Kohlendioxid in Kohlenhydrate umgewandelt wird. Die Thylakoidmembran Membran ist die innere Membran-Netzwerk bestehend aus Grana (flache komprimierte Sacs) und Lamellen (weniger dichten Strukturen), wo sauerstoffhaltige Photosynthese stattfindet. Dieses Protokoll beschreibt Schritt für Schritt Verfahren für die Reinigung, mit differenzierten Centrifugations und Percoll Gradienten, der intakten Chloroplasten aus Arabidopsisund deren Fraktionierung, mit Saccharose Steigungen, in drei Sub-Fächer (z. B. Umschlag, Stroma und Thylakoids). Dieses Protokoll beschreibt auch, wie die Reinheit dieser Fraktionen mit Marker, die auf die verschiedenen Chloroplasten Sub Fächer zu bewerten. Die hier beschriebene Methode ist wertvoll für die Lokalisierung der Subplastidial von Proteinen mit Immunoblotting, sondern auch für subzellulären und Subplastidial Proteomics und andere Studien.

Aufeinander folgenden Schritten des Verfahrens was gereinigten Chloroplasten und ihre Sub-Fächer sind in Abbildung 2wieder aufgenommen. Die Percoll-Verlauf (Abbildung 2A) ermöglicht intakte Chloroplasten von gebrochenen Chloroplasten und Mitochondrien (oben des Farbverlaufs) oder Kerne und zellenrückstand (Ende des Farbverlaufs) zu unterscheiden. Nach Bruch durch die Percoll-gereinigte Organellen durch einen osmotischen Schock sind die daraus resultierenden Brüche auf einer Steigung von Saccharose (Abb. 2 b) getrennt. Das Stroma (lösliche Bestandteil der Chloroplasten) schwimmt an der Oberfläche des Farbverlaufs Saccharose. Die leichten Umschlag membranvesikel werden als diskrete gelbe Band an der 0,6/0,93 M Saccharose Schnittstelle wiederhergestellt. Die schwersten Thylakoidmembran Membranen Vesikel sind konzentriert an der Unterseite des Rohres. Nach Erholung, Wasch- und Konzentration der zwei Membran-Fraktionen Proteine werden quantifiziert und die Zusammensetzung aller vier Fraktionen auf eine SDS-PAGE (Abbildung 2) analysiert. Die Bahnen sind auf eine gleiche Protein-Basis (20 µg der einzelnen gereinigten Fraktionen) geladen. Wissend, dass Chloroplasten nur 1 % des Umschlags Proteine und 50 % der Proteine aus dem Stroma oder die Thylakoids enthalten, tendenziell dies Kreuzkontamination von gereinigten Umschlag Zubereitungen mit anderen Chloroplasten Sub Fächern zu überschätzen. Allerdings kann diese Methode um winzige Mengen von Proteinen, die Kreuz-Kontamination den Umschlag Bruch zu erkennen. Marker aus jedem Fach (z.B. reichlich Proteine) sind sehr hilfreich bei der Bewertung der Kontamination der Fraktionen. In der Tat dürften die Thylakoidmembran und Umschlag Membran Brüche enthalten geringe Mengen an die große Untereinheit der RuBisCO (RBCL), das am häufigsten vorkommende Protein aus dem Stroma (50 kDa). Gebrochene Chloroplasten können leicht von intakten Chloroplasten durch den Verlust dieser Stromazellen Protein8unterschieden werden. Das Licht, die Ernte komplexe Proteine (LHCP) sind 25 kDa reichlich Thylakoidmembran Komponenten, die kaum sollte Umschlag Membranen9(weniger als 3 %) zu verunreinigen. Zu guter Letzt die Phosphat-Triose-Phosphat Nyrianer (TPT) ist ein 30-kDa-Protein, das nur in den gereinigten Umschlag Bruch aufgrund seiner starken Anreicherung sichtbar ist (d. h. 50 bis 100 X) in den Umschlag Bruchteil im Vergleich zu ganzen Chloroplasten extrahiert. Mit der beschriebenen Methode hier, Chloroplasten Sub Fächer sind in der Regel schlecht Kreuz verunreinigt, wie mit Western-Blot Analysen (Bild 2D) unter Berufung auf Antikörper gegen bekannte Marker für alle drei Sub-Fächer bestätigt: die löslichen Ketol-Säure Reductoisomerase (KARI) aus dem Stroma, die Chloroplasten Umschlag Kupfer ATPase (HMA1) und das Licht, die Ernte komplexe Proteine (LHCP) aus der Thylakoidmembran Membranen. Cross-Kontamination der drei Sub-Fächer kann mit Immunoblotting und Mass Spectrometry Analysen9quantifiziert werden. Während das Stroma von Umschlag oder Thylakoidmembran Fraktionen in der Regel nicht kontaminiert ist, enthalten die gereinigten Umschlag Brüche 3 % der Thylakoidmembran Proteine und bis zu 10 % der Proteine aus dem Stroma. Thylakoids enthalten bis zu 3 % der Membranproteine, Umschlag aber Proteine aus dem Stroma schlecht verunreinigen die Thylakoidmembran Membranen (weniger als 1 %). Mehr als mit eine entscheidende Rolle bei der Ermittlung der echten Subplastidial Lage der Chloroplasten Proteine, das vorliegende Verfahren somit begrenzt auch falsche Rückschlüsse auf Subplastidial Lokalisierung von Proteinen aus überqueren Sie Verunreinigungen.
<img alt="Strukturdiagramm der Chloroplasten; Hüllmembranen, Thylakoidmembranen, Grana, Stroma-Details." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: Repräsentative Schema der Chloroplasten Sub Fächer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Experiment zur Isolierung von Chloroplasten; SDS-PAGE und Western-Blot-Ergebnisse zur Analyse von Chloroplastenfraktionen." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: Reinigung des intakten Chloroplasten und ihre drei wichtigsten Sub-Abteile mit Percoll und Saccharose Steigungen. A. Percoll Farbverlauf ermöglicht die Trennung von gebrochenen und intakte Chloroplasten. B. Saccharose Gefälle ermöglicht die Trennung von Stroma, Umschlag und Thylakoidmembran Brüche. C. Vertreter SDS-PAGE von Proteinen aus intakten Chloroplasten und ihre drei Sub-Hauptfächer ermöglichen, um reichlich Marker aus jedem Sub-Fach zu visualisieren. Jede Spur enthält 10 µg von Proteinen. Molekulargewicht Marker: RBCL, große Untereinheit der RuBisCO (Marker für das Stroma); TPT, Phosphat/Triose-Phosphat Nyrianer (Marker für den Umschlag); LHCP, leichte Ernte komplexe Proteine (Marker für die Thylakoidmembran). D. Western-Blot-Experimente, sodass von jedem Sub-Fach um spezifischer Marker (mit spezifischen Antikörpern) zu erkennen: die Chloroplasten Umschlag Kupfer ATPase HMA110, das Licht, die komplexe Proteine LHCP aus der Thylakoidmembran Ernte Membranen-11und der Ketol-Säure Reductoisomerase KARI aus dem Stroma-9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier beschreiben wir eine Methode, um intakte Chloroplasten aus Arabidopsis Blättern und ihre drei Sub-Hauptfächer (Umschlag, Stroma und Thylakoids), reinigen mit einer Kombination von differenziellen Centrifugations, kontinuierliche Percoll Gradienten und diskontinuierliche Saccharose Steigungen. Die Methode ist wertvoll für Subplastidial und subzelluläre Lokalisierung der Proteine durch Immunoblotting und Proteomik.

Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie es ermöglicht, Proteine ähnlicher Aktivitäten zu unterscheiden, die unterschiedliche Rollen haben, abhängig von der Lokalisierung in Hüllkurven-, Stroma- oder Thylakoidmembranen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu bei dieser Methode sind, kämpfen, weil sie Pflanzen verwenden, die zu alt sind, das Blatt zu lange mischen oder nicht vorsichtig genug sein werden, wenn sie die Pellets intakter, aber zerbrechlicher Chloroplasten wieder aufhängen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Laden oder Wiederherstellen von Bruchteilen aus Perkoll- oder Saccharosegradientenschritten schwer zu erlernen ist.Wegen der Gefahr der Vermischung der Gradienten und damit der Kreuzkontamination der verschiedenen Chloroplasten-Unterfraktionen. Die Demonstration des Verfahrens wird von Imen Bouchnak, einem Doktoranden aus unserem Labor, und Lucas Moyet, einem Indoor-Ingenieur, sein. Zu Beginn, wachsen Arabidopsis Pflanzen für fünf Wochen mit einem 12-Stunden-Lichtzyklus bei 23 Grad Celsius am Tag und 18 Grad Celsius in der Nacht, mit einer Lichtintensität von 150 Mikromoler pro Quadratmeter pro Sekunde.Am nächsten Tag einen Fünf-Liter-Becher vorwiegen und dann auf Eis legen. Ernten Sie die Arabidopsis Blätter, stellen Sie sicher, dass keine Boden pflücken. Wiegen Sie den Becher erneut und zeichnen Sie das Gewebegewicht auf.Die geernteten Blätter in einen kalten Raum überführen. Legen Sie die Blätter in einen Mixer, der zwei Liter Schleifpuffer enthält, und homogenisieren Sie sie, indem Sie sie dreimal mit hoher Geschwindigkeit für eine Dauer von jeweils zwei Sekunden mischen. Legen Sie vier Schichten Musselin und eine Schicht Nylon blau tex in ein Sieb und diese, um das Homogenat zu filtern.Drücken Sie die gemischten Blätter vorsichtig in den Musselin und blauen Tex, um die gesamte Flüssigkeit zu extrahieren. Das restliche Gewebe im Mixerbecher wiederherstellen und den Homogenisierungsprozess mit frischem Schleifpuffer wiederholen. Verwenden Sie vier bis fünf Schichten neuen Musselins, um dieses neue Homogenat in einem neuen Becher zu filtern, wie zuvor beschrieben.Verteilen Sie den Rohzellextrakt gleichmäßig in sechs 500-Milliliter-Flaschen. Legen Sie die Flaschen auf Eis. Zentrifugieren Sie die gekühlten Flaschen bei 2070 G und vier Grad Celsius für zwei Minuten.Danach den Überstand vorsichtig entsorgen. Verwenden Sie eine Wasserpumpe, um alle verbleibenden Überstand zu aspirieren und halten Sie die Pellets, die konzentrierte Spritchloroplaste enthalten, auf Eis. Mit einer 10-Milliliter-Pipette, fügen Sie drei Milliliter Waschmedium zu jeder Flasche, um sicherzustellen, nicht feine Pipettenspitzen verwenden, um zu vermeiden, die Chloroplasten zu brechen.Verwenden Sie dann einen Pinsel oder einen gebogenen Plastikspachtel, um die Pellets vorsichtig wieder aufzuhängen. Mit einer 10-Milliliter-Pipette die wieder aufgehängten Chloroplasten in einem einzigen Rohr sammeln. Um das Rohr vorsichtig umzukehren, um eine homogene Chloroplastensuspension zu erhalten.Verwenden Sie zunächst eine 10-Millileter-Pipette, um langsam sechs Milliliter der Chloroplastensuspension auf jeden der sechs vorbereiteten Percoll-Gradienten zu laden. Zentrieren Sie die Steigungen mit einem schwingenden Schaufelrotor 10 Minuten lang bei 13, 300 G und vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine Wasserpumpe, um die obere Phase zu aspirieren, die gebrochene Chloroplasten und intakte Mitochondrien enthält.Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Pipette, um intakte Chloroplasten in der unteren Phase zu bergen, wobei Sie darauf achten, die Kerne und Zellablagerungen, die am Boden des Rohres gefunden wurden, zusammen mit den intakten Chloroplasten nicht zu saugen. Verdünnen Sie die intakte Chloroplastensuspension drei- bis viermal mit Waschmedium. Halten Sie etwa 10 Milliliter einer Aliquot intakter Chloroplastenfraktion zur weiteren Analyse durch SDS-Page und Western Blotting auf.Zentrifuge bei 2070 G und vier Grad Celsius für zwei Minuten. Danach den Überstand vorsichtig entsorgen. Verwenden Sie eine Wasserpumpe, um alle verbleibenden Überstand zu aspirieren und halten Sie das Pellet, das konzentrierte Rohchloroplasten enthält, auf Eis.Um die gereinigten intakten Chloroplasten zu lysieren, setzen Sie das Pellet in hypotonischem Medium, das Protease-Inhibitoren enthält, wieder auf. Die wieder aufgehängten Chloroplasten in ein 10 Milliliter Falkenrohr geben. Bereiten Sie den Saccharosegradienten wie im Textprotokoll beschrieben vor.Mit einer peristaltischen Pumpe langsam drei Milliliter der lysierten Chloroplasten auf jeden der vorgeformten Saccharosegradienten laden. Verwenden Sie hypotonischen mittleren Puffer, um Röhrenpaare auszugleichen, und zentrieren Sie dann den Gradienten bei 70, 000 G und vier Grad Celsius für eine Stunde. Nehmen Sie ein Aliquot der löslichen stromalen Proteine, die bei der Bestimmung der Proteinkonzentration verwendet werden sollen.Verwenden Sie anschließend eine Wasserpumpe, um die verbleibende obere Phase des Gefälles bis zum gelben Band zu aspirieren. Rufen Sie mit einer Pipette das gelbe Band ab, das der Umschlag ist. Ziehen Sie die Umschläge in ein Rohr.Entfernen Sie dann die verbleibende Phase des Gradienten bis zum Thylakoidpellet. Die Thylakoidpellets im Membranwaschpuffer mit Proteasehemmern wieder aufhängen. Die Thylakoid-Aufhängung verdünnen und mit Waschmedium drei- bis vierfach umhüllen, wobei das Endvolumen auf 10 Milliliter eingestellt wird.Rohrpaare mit Membranwaschpuffer ausbalancieren und bei 110, 000 G und vier Grad Celsius eine Stunde lang ultrazentrifugieren. Danach verwenden Sie eine Wasserpumpe, um den Überstand sorgfältig zu aspirieren. Etwa 100 Mikroliter Membranwaschpuffer in das Hüllpellet geben.Dann, aspirieren Sie den Überstand aus dem Thylakoid-Rohr. Die Thylakoid-Pellets in drei Milliliter Membranwaschpuffer wieder aufhängen. Bewahren Sie die drei gereinigten Unterteile in flüssigem Stickstoff auf, um sie in weiteren Experimenten zu verwenden.Nachdem die Membranfraktionen zurückgewonnen, gewaschen und konzentriert sind, wird SDS-Page verwendet, um die Proteine zu quantifizieren und die Zusammensetzung aller vier Fraktionen zu analysieren. Das am häufigsten vorkommende Protein aus dem Stroma ist RBCL, und repräsentative Ergebnisse zeigen das erwartete Ergebnis, dass sehr wenig von der großen Untereinheit dieses Proteins die Thylakoid- und Hüllmembranfraktionen enthalten ist. Die leichten Erntekomplexproteine sind reichlich Thylakoid-Komponenten, die die Hüllenmembranen kaum kontaminieren sollten.Schließlich ist der Phosphattriophosphattranslocator nur in der gereinigten Hüllkurvenfraktion sichtbar, da er im Vergleich zu den gesamten Chloroplastenextrakten in der Hüllkurve stark anreichert. Die Kreuzkontamination der drei Unterkompartimente, der löslichen Ketol-Säure-Reductoisomerase aus dem Stroma, der Chloroplastenhülle n.A. kupfern atPase und der leichten Ernte komplexer Proteine aus den Thylakoidmembranen können durch Immunoblotting und Massenspektrometrieanalyse quantifiziert werden. Während die Stroma in der Regel nicht durch Hüll- oder Thylakoidfraktionen kontaminiert ist, enthalten die gereinigten Hüllkurvenfraktionen 3% Thylakoidproteine und bis zu 10% der Proteine aus dem Stroma.Die Thylakoide sind schlecht mit Proteinen aus dem Stroma kontaminiert, enthalten aber bis zu 3% der Hüllmembranproteine. Chloroplasten erfüllen viele wichtige Funktionen wie die Assimilation von Kohlenstoff, Schwefel und Stickstoff, sowie die Synthese von essentiellen Metaboliten. Um neue Regulierungsmechanismen zu entschlüsseln, die die Chloroplastenphysiologie kontrollieren, ist die Definition der surplastiken Lokalisation von Chloroplastenproteinen für supergezielte Studien von entscheidender Bedeutung.Chloroplasten enthalten mehrere Unterteile. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Chloroplastenfeld zu beantworten, z. B. wo sich ein bestimmtes Chloroplastenprotein innerhalb der Organelle befindet. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, alle Chloroplasten-Isolationsschritte bei vier Grad durchzuführen, um Protea-Widerstand in gereinigte Fraktionen zu überweisen.Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie lascare proteomische Ansätze durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Zusammensetzung und Dynamik des Proteoms der Werte plastid Sub-Kompartimente zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Pflanzenphysiologie den Weg, viele verschiedene Aspekte der Chloroplastenbiogenese und -funktion mithilfe einer gezielten Analyse von Kandidatenproteinen, die in Plastid-Unterteilen identifiziert wurden, zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Volumenmixer, flüssigem Stickstoff, auf bestimmten Verbindungen wie Proteasehemmern besondere Sorgfalt erfordert.Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, Labormantel und Schutzbrille sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Hier präsentieren wir ein Interaktom-Capture-Protokoll, das auf Arabidopsis thaliana Blatt-Mesophyll-Protoplasten angewendet wird. Diese Methode beruht kritisch auf in vivo UV-Vernetzung und ermöglicht die Isolierung und Identifizierung von p-mRNA-bindenden Proteinen aus einer physiologischen Umgebung.

MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

Wir entwickelten eine neuartige Methode zur Co mehrere Chimären fluoreszierende Fusionsproteine in Anlagen zur Überwindung der Schwierigkeiten von konventionellen Methoden zum Ausdruck zu bringen. Es nutzt die Vorteile der Verwendung einer einzigen Ausdruck Plasmid, das enthält mehrere funktionell unabhängig Protein mit dem Ausdruck Kassetten um Co Proteinexpression zu erreichen.

Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in effizienter Weise in Pflanzen

Wir präsentieren Protokolle hierin für High Yield Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und Protein Transport Assays für die Chloroplasten Twin Arginin Translokation (CpTat), sekretorische (cpSec1) und Signalwege Anerkennung Teilchen (CpSRP).

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Proteine in Protoplasten zum Ausdruck zu bringen, mit PEG-vermittelten Transformationsmethode. Die Methode bietet einfach Ausdruck der interessierenden Proteine und effiziente Untersuchung von Protein-Lokalisierung und der Importvorgang für verschiedenen experimentellen Bedingungen in-vivo.

Studium der Protein Import in Chloroplasten mit Protoplasten

Dieses Protokoll beschreibt die Auswahl optimaler plasmodesmaler Marker für konfokalmikroskopische Analysen von Proteinen, die während Virus-Plasmodesmata-Interaktionen oder des plasmosmodesmalen Transports auf Plasmodesmen abzielen.

Konfokalmikroskopische Analyse der Proteinsortierung zu Plasmodesmata bei Nicotiana benthamiana

Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung von intakten Proben der Endosperm-Zellschicht in Arabidopsis thaliana-Samen . Die Methode erfordert nur gängige Laborgeräte wie eine Injektionsnadel und eine Präzisionszange und ermöglicht eine hochauflösende fluoreszierende Bildgebung von Endospermzellen sowohl in sich entwickelnden als auch in reifen Samen.

Aufbereitung von intaktem Gewebe für die mikroskopische Analyse der Endosperm-Zellschicht in sich entwickelnden und reifen Arabidopsis-Samen

Lernen Sie die Aufreinigung intakter Chloroplasten aus Arabidopsis-Blättern mit Differentialzentrifugation und Gradientenmethoden. Diese Technik ermöglicht die Proteinlokalisierung in Envelope, Stroma und Thylakoiden.

Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics (Video) | JoVE Journal

Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

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