Ein Mikro-CT-basierte Verfahren zur Charakterisierung von Läsionen und Lokalisierung von Elektroden in kleinen tierischen Gehirnen
November 8th, 2018
Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode zur Vorbereitung von kleinen tierischen Gehirne für Mikro-CT-Bildgebung, in welche Läsionen quantifiziert werden können und Elektroden mit hoher Präzision im Kontext des gesamten Gehirns gelegen.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Neurowissenschaften zu beantworten, indem sie eine einfachere, weniger fehleranfällige und quantitativemethode zur Überprüfung von Läsionen und zum Lokalisieren von Elektrodenstandorten bereitstellt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Überprüfung von Läsionen und Elektrodenstellen im gesamten Gehirn ermöglicht, ohne dass schnitter. Das Endprodukt ist ein digitales 3D-Volumen des Gehirns und mehrere Gehirne können parallel verarbeitet werden.
Obwohl diese Methode bei der Ratte nachgewiesen wird, kann sie auch auf andere Organismen wie Mäuse und Zebrafinken angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da einige Schritte besondere Sorgfalt erfordern, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Um zu beginnen, legen Sie ein extrahiertes Gehirn in Profusion Lösung in einem 50 Milliliter konischen Rohr.
Bewahren Sie die Probe zwei bis drei Tage lang mit sanftem Schütteln bei vier Grad Celsius auf. Stellen Sie sicher, dass das Osmium in Wasser und nicht in einem Puffer verdünnt ist. Dies liegt daran, dass das Wasser als mildes Reinigungsmittel wirkt, so dass das Osmium tief in das Gewebe eindringen kann.
50 Milliliter 2%Osmiumtetroxid in doppelt destilliertem Wasser zubereiten. Dann legen Sie das Gehirn in eine neue 50 Milliliter konische Röhre und fügen Sie die Osmium-Tetroxid-Lösung. Schließen Sie das Rohr und versiegeln Sie es mit Paraffinfolie, um Leckagen zu vermeiden.
Bewahren Sie das versiegelte Rohr bei vier Grad Celsius mit sanftem Schütteln für zwei Wochen auf. Stellen Sie sicher, dass das Rohr horizontal platziert ist. Das Gehirn ist sehr dick und ein langer Weg, um durch Diffusion zu reisen.
Wenn Sie das Rohr horizontal platzieren, kann das Osmium tiefer in das Gewebe gelangen. Nachdem die Probe zwei Wochen lang inkubiert wurde, waschen Sie sie fünfmal mit doppelt destilliertem Wasser, um das gesamte ungebundene Osmiumtetroxid aus der Probe zu entfernen. Als nächstes die Probe mit doppelt destilliertem Wasser 30 Minuten bei vier Grad Celsius waschen.
Ersetzen Sie das doppelt destillierte Wasser durch vier Verdünnungen von Ethanol, um die Probe zu dehydrieren. Um den Harzinfiltrationsprozess zu beginnen, bewegen Sie die Probe durch drei Aceton- und drei Acetonharzverdünnungen, und tauchen Sie die Probe dann in 100%Harz bei Raumtemperatur ein, um den Infiltrationsprozess fortzusetzen. Danach die Probe in eine Einwegform übertragen.
Die Probe vier Stunden lang bei Raumtemperatur mit frischem 100%Harz einfangen. Die Probe im Vakuumofen für 15 Minuten bei 45 Grad Celsius entgasen. Dann die Probe im Ofen für 48 Stunden bei 60 Grad Celsius aushärten.
Wenn die Probe ausgehärtet ist, schälen Sie die Einwegform ab und scannen Sie sie mit der Micro-CT-Maschine. Bei der traditionellen Schnitte muss die Orientierung des Gehirns vorbestimmt sein. Mit dieser Micro-CT-Methode kann das digitale Volumen des Probenhirns dreidimensional manipuliert und virtuell in jede Richtung geschnitten werden.
Die Rasterelektronenmikroskopie des präparierten Rattenhirns bestätigt, dass das Gewebe für die Zwecke der Mikro-CT-Bildgebung nicht signifikant geschädigt wurde. Ein Zebrafinkenhirn wurde ebenfalls nach diesem Protokoll vorbereitet und gescannt, um den Nutzen dieser Methode an anderen kleinen Tierhirnen zu testen. Diese Technik kann verwendet werden, um Oberflächenläsionen im Gehirn zu finden, sowie Läsionen tief im Gehirn.
Diese Technik kann auch auf die Position einzelner Tetrodes in situ, elektrolytische Läsionen, Elektrodenspuren, Tetro-Arrays in situ und Siliziumsonden in situ angewendet werden. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, das Gehirn zu erlauben, für lange genug und mit genügend Agitation zu brüten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Optogenetik und Zwei-Photonen-Bildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über die Rolle zu beantworten, die verschiedene Gehirnbereiche in verschiedenen Verhaltensweisen spielen.
Diese Technik könnte es Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften ermöglichen, Struktur-Funktions-Beziehungen zwischen Gehirn und Verhalten bei Ratten, Mäusen, Singvögeln und anderen Kleintieren besser zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Osmium extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten in einer Vakuumhaube, sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Vorbereitung von Kleintiergehirnen, insbesondere Rattengehirnen, für die Mikro-CT-Bildgebung. Die Technik zielt darauf ab, Läsionen zu quantifizieren und Elektroden präzise zu lokalisieren, ohne dass eine Sektionierung erforderlich ist, und erzeugt ein umfassendes 3D-digitales Volumen des Gehirns.
Wichtige Studienkomponenten
Wissensgebiet
- Neurowissenschaften
- Bildgebungstechniken
- Läsionsanalyse
Hintergrund
- Mikro-CT-Bildgebung ermöglicht eine zerstörungsfreie Analyse von Hirnstrukturen.
- Traditionelle Sektionierungsmethoden können fehleranfällig sein und die Orientierungsflexibilität einschränken.
- Diese Methode verbessert die Fähigkeit, Läsionen und Elektrodenplatzierung zu analysieren.
- Anwendbar für verschiedene Kleintiere wie Mäuse und Zebrafinken.
Zweck der Studie
- Zur Entwicklung einer vereinfachten und weniger fehleranfälligen Vorbereitungsmethode für die Mikro-CT-Bildgebung.
- Zur Bereitstellung einer genauen Lokalisierung von Läsionen und Elektroden.
- Zur Erleichterung der 3D-Manipulation von Hirnproben für verbesserte Analyse.
Verwendete Methoden
- Die Hauptplattform ist die Mikro-CT-Bildgebung von vorbereiteten Hirnproben.
- Das wichtigste biologische Modell ist das Rattengehirn, aber die Methode ist anpassbar für andere Kleintiere.
- Die Methode beinhaltet spezifische Inkubationszeiten und die Verwendung von Osmiumtetroxid für die Gewebevorbereitung.
- Kritische Schritte umfassen die horizontale Platzierung des Röhrchens und mehrere Waschschritte, um die Osmium-Penetration sicherzustellen.
- Die abschließende Vorbereitung umfasst das Aushärten des Harzes und das Scannen mit einem Mikro-CT-Gerät.
Hauptergebnisse
- Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Oberflächen- und tiefen Hirnläsionen.
- Es ermöglicht eine genaue Identifizierung von Elektrodenbahnen und Läsionen bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Gewebeintegrität.
- Gescannte Proben zeigen, dass Gewebeschäden minimal sind, was die Anwendbarkeit der Technik bestätigt.
- Das Verfahren kann weitere Experimente wie Optogenetik und Zwei-Photonen-Bildgebung unterstützen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert eine effektive Methode zur Vorbereitung von Tiergehirnen für eine detaillierte Analyse mittels Mikro-CT.
- Die Technik ermöglicht es Forschern, Neuronenverhalten und strukturelle Beziehungen zu untersuchen, ohne die Proben zu beschädigen.
- Gesamthaft verbessert es die Fähigkeiten der Neurowissenschaftsforschung zum Verständnis der Hirnmechanik.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Accurate lesion characterization and electrode localization are critical for validating mechanistic hypotheses in neuroscience-driven drug discovery. This micro-CT-based workflow enables high-resolution, quantitative mapping of brain interventions, reducing manual error and supporting reproducible, cross-study comparisons. The approach enhances predictive confidence at the target validation and preclinical model inflection points, directly impacting translational continuity and portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of lesion placement and electrode localization for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by providing 3D anatomical context for intervention sites.
- Facilitates quantitative comparison of experimental manipulations across studies and models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain models for downstream functional assays and behavioral studies.
- Standardizes lesion and electrode mapping, improving reproducibility and assay reliability.
- Generates digital volumes suitable for automated or manual segmentation and analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns anatomical intervention data with behavioral and functional outcomes in disease-relevant systems.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting multi-modal data integration.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This micro-CT method integrates at the interface of discovery biology and preclinical model validation, bridging anatomical verification with functional and behavioral readouts.
- Discovery Biology: Provides quantitative, 3D verification of experimental manipulations for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, high-resolution anatomical data to support assay readiness and cross-study standardization.
- Analytics: Enables digital measurement and comparison of lesion volumes and electrode positions across conditions.
- Translational Research: Supports alignment of anatomical and functional data for disease-relevant model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, digital workflow adaptable to multiple small animal models and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation studies.
- Operational Value: Streamlines verification processes, enabling parallel sample processing and digital archiving.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by standardizing anatomical validation across programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative anatomical data for model selection and advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue preparation, micro-CT imaging, and digital volume analysis.
- Demands access to micro-CT instrumentation and compatible analysis software (free or proprietary).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample handling and imaging protocols.
- Adaptable to various small animal models with protocol adjustments for tissue size and composition.
- Safety precautions are essential due to hazardous reagents such as osmium tetroxide.
