Wie den Anteil der photoaktiviert fluoreszierende Proteine in großen Mengen und in lebenden Zellen zu quantifizieren
7. Januar 2019
Hier präsentieren wir eine Protokoll, die genetisch gekoppelten spektral unterschiedliche Photoactivatable und fluoreszierende Proteine beteiligt. Diese fluoreszierenden Proteins Chimären erlauben Quantifizierung der PA-FP-Fraktion, die photoaktiviert, fluoreszierende, d. h. die Photoaktivierungen Effizienz. Das Protokoll zeigt, dass verschiedene Modi der Photoaktivierungen verschiedenen Photoaktivierungen Effizienz ergeben.
Wir präsentieren hier ein Protokoll, das genetisch gekoppelte spektral unterschiedliche photoaktivierbare und fluoreszierende Proteine beinhaltet. Diese internen Lineale ermöglichen die Quantifizierung der PAFP-Fraktion, die fotoaktiviert ist, um fluoreszierend zu sein. Bisher gab es keine Methode, um in Massen in Lebenszellen zu quantifizieren, wie viele der PAFP-Exprimierten fotoaktiviert sind, um fluoreszierend zu werden. Die vorgestellte Quantifizierung der Photoaktivierungseffizienz ist beispielhaft für PA-GFP und PA Cherry in lebenden Zellen, aber sie ist grundsätzlich allgemein anwendbar und kann für jedes photoaktivierbare fluoreszierende Protein unter jedem experimentellen Zustand verwendet werden. Bei der Arbeit mit genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen variiert die absolute Menge der exprimierten Proteine von Zelle zu Zelle und ist unbekannt. Um die Expression zwischen den Zellen zu standardisieren, führen wir interne Lineale genetisch gekoppelter spektral unterschiedlicher fluoreszierender Proteine ein. Durch die Kopplung der genetischen Informationen eines photoaktivierbaren floreszierenden Proteins mit einem spektral unterschiedlichen immer auf fluoreszierenden Protein-internen Linealen entstehen innere Lineale, die immer noch zu einer unbekannten Gesamtmenge ausgedrückt werden, aber in einer festen bekannten relativen Menge von eins zu eins. Um mit dem Konstruieren der Plasmide zu beginnen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Auch Kultur in der Standard-Zelllinie in ihrem perspektivischen Medium mit der phenolroten freien Version. Wenn Sie bereit sind, das Experiment zu beginnen, ernten Sie die Zellen mit Trypsin ohne Phenolrot, um die Hintergrundblüten zu reduzieren. Nach der Ernte eine 2 ml Pipette mit der Zellsuspension aus einer konfluenten Zellkultur füllen, die in einem T 12.5-Zellkulturkolben angebaut wird. Fügen Sie einen Tropfen in jede Kammer einer acht Kammer Glasrutsche. Inkubieren Sie die Folie unter Standard-Zellkulturbedingungen für 24 Stunden. Als nächstes transfect die Zellen mit kommerziellen Reagenzien nach dem Verteiler-Protokoll. Transfekte die Zellen mit der GFP Cherry, PA-GFP Cherry und GFPPA Cherry Chimären. Dann kehren Sie die Zellen zum Inkubator zurück, um Proteinexpression, Faltung und Reifung zu ermöglichen. Nach insgesamt 20 Stunden nach der Transfektion, übertragen Sie die Zellen auf das Stadium eines konfokalen Florstoffmikroskops, das mit der befeuchteten und erhitzten Umweltkammer ausgestattet ist, die auf 37 vorgewärmt ist.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll vorgestellt, das genetisch gekoppelte, spektral unterscheidbare photoaktivierbare und fluoreszierende Proteine nutzt. Diese Chimären ermöglichen die Quantifizierung der Photoaktivierungseffizienz des PA-FP-Anteils, der fluoreszierend wird, und zeigen, dass unterschiedliche Photoaktivierungsmodi zu variierenden Effizienzen führen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Fluoreszenzprotein-Technologie
- Photoaktivierungstechniken
Hintergrund
- Fluoreszierende Proteine sind unverzichtbare Werkzeuge in der biologischen Forschung.
- Photoaktivierbare fluoreszierende Proteine ermöglichen die räumliche und zeitliche Kontrolle der Fluoreszenz.
- Das Verständnis der Photoaktivierungseffizienz ist entscheidend für genaue experimentelle Ergebnisse.
- Unterschiedliche Aktivierungsmethoden können die Leistungsfähigkeit dieser Proteine beeinflussen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Beurteilung der Photoaktivierungseffizienz.
- Vergleich der Wirkungen verschiedener Photoaktivierungsmodi.
- Verbesserung der Anwendbarkeit fluoreszierender Proteinchimären in der Forschung.
Verwendete Methoden
- Genetische Kopplung von photoaktivierbaren und fluoreszierenden Proteinen.
- Quantifizierung des photoaktivierten Anteils.
- Vergleich verschiedener Photoaktivierungstechniken.
- Analyse der Photoaktivierungseffizienzen.
Hauptergebnisse
- Unterschiedliche Arten der Photoaktivierung führten zu variierenden Effizienzen.
- Das Protokoll ermöglichte die erfolgreiche Quantifizierung der Photoaktivierungseffizienz.
- Fluoreszierende Protein-Chimären zeigten ein erhebliches Potenzial für Forschungsanwendungen.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können zukünftige Studien mit photoaktivierbaren Proteinen leiten.
Schlussfolgerungen
- Die Studie liefert ein wertvolles Protokoll für Forscher.
- Das Verständnis der Photoaktivierungseffizienz ist entscheidend für die Versuchsplanung.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um die Verwendung fluoreszierender Proteine zu optimieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Quantifizierung der Photoaktivierungseffizienz fluoreszierender Proteine schließt eine wichtige Lücke in der Live-Cell-Bildgebung und ermöglicht eine zuverlässigere Interpretation des dynamischen Proteinverhaltens. Diese Fähigkeit unterstützt die Target-Validierung und die Assay-Entwicklung, indem sie einen messbaren Parameter für die Leistung photoaktivierbarer Sonden bereitstellt. Eine verbesserte Vorhersagegenauigkeit bezüglich der Sondenaktivierung verringert mechanistische Unschärfen in nachgeschalteten Anwendungen wie phänotypischen Screenings und translationsorientierten Biomarker-Studien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem der Anteil erfolgreich aktivierter photoaktivierbarer Proteine quantifiziert wird.
- Operativer Wert: Bietet eine ratiometrische interne Kontrolle, um die Variabilität der Expression von Zelle zu Zelle zu normalisieren.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Identifizierung von Leitverbindungen, indem der Vergleich der Photoaktivierungseffizienzen zwischen verschiedenen Proteinvarianten oder Bedingungen ermöglicht wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, quantitative Messwerte zur Photoaktivierungseffizienz für die Optimierung von Assays.
- Reproduzierbarkeit: Verwendet genetisch gekoppelte interne Referenzgrößen, um eine konsistente relative Expression über experimentelle Wiederholungen hinweg sicherzustellen.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Bulk- und Lebendzellformaten und ermöglicht die Integration in Workflows für Hochdurchsatz-Screenings mit hohem Informationsgehalt.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht die mechanistische Ent-Risikobewertung, indem die Effizienz der Photoaktivierung mit funktionellen Endpunkten in krankheitsrelevanten Systemen verknüpft wird.
- Vorhersagegenauigkeit: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung auf der Grundlage quantitativer Daten zur Photoaktivierungsleistung.
- Biomarker-Ausrichtung: Unterstützt die Entwicklung photoaktivierbarer Reporter für die longitudinale Verfolgung in präklinischen Modellen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung über die Assay-Entwicklung bis zur präklinischen Bewertung, insbesondere dort, wo eine räumliche und zeitliche Kontrolle der Proteinaktivität erforderlich ist.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Quantifizierung des aktivierten Anteils von photoaktivierbaren Sonden in lebenden Zellen.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch verhältnisbasierte Messung, die unabhängig von absoluten Expressionsniveaus ist.
- Analytik: Bietet quantitative abhängige Variablenmessungen (Anteil der Photoaktivierung), die den Vergleich von Aktivierungsmodi erlauben.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem sie die standardisierte Bewertung von photoaktivierbaren Reportern in Krankheitsmodellen ermöglicht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung beliebiger spektral unterscheidbarer Paare von photoaktivierbaren fluoreszierenden Proteinen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit hinsichtlich der Leistungsfähigkeit photoaktivierbarer Sonden und verringert falsch-negative Ergebnisse in aktivitätsbasierten Assays.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung zwischen verschiedenen Laboren und experimentellen Aufbauten.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung bei der Sondenauswahl (Weiterentwicklung oder Abbruch) durch bereitgestellte quantitative Daten zur Aktivierungseffizienz.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung photoaktivierbarer Werkzeuge basierend auf validierten Leistungskennzahlen.
Durchführungsüberlegungen
- Benötigt Fachkenntnisse in der molekularen Klonierung, um genetisch gekoppelte fluoreszierende Proteinchimären herzustellen.
- Setzt Zugang zu konfokaler oder Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie mit Photoaktivierungsfunktion voraus.
- Erfordert die Standardisierung von Bildgebungsparametern und Photoaktivierungsprotokollen zwischen verschiedenen Anwendern.
- Benötigt die Validierung der Funktionalität der Chimären sowie der spektralen Trennung in der Zielzelllinie.
- Auf Systeme beschränkt, in denen die genetische Kopplung von Fluorophoren die Proteinfunktion oder -lokalisation nicht beeinträchtigt.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:20
Cell Culture and Transfection
2:31
Imaging and Photoactivation
5:45
Imaging Analysis and Algorithm for Ratiometric Intensity-based Quantification of Photoactivation Efficiency
9:09
Results: Maximizing Photoactivation Efficiency
9:50
Conclusion
