Name: Biocytin Erholung und 3D-Rekonstruktionen der gefüllten Hippocampal CA2 Interneuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Biocytin-Rückgewinnung und 3D-Rekonstruktion von Hippocampus-CA2-Interneuronen nach elektrophysiologischen Aufzeichnungen. Diese Methode ermöglicht präzise morphologische Analysen neuronaler Schaltkreise.

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Diese Forschung wird finanziell unterstützt von Novartis Pharma (Basel) und dem Medical Research Council ausgezeichnet zu Prof. Alex Thomson, der Biotechnologie und biologische Wissenschaften Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), der physiologischen Gesellschaft der Europäischen Union Horizon 2020 Rahmenprogramm für Forschung und Innovation im Rahmen der spezifischen Grant Agreement Nr. 720270 (menschliche Gehirn Projekt SGA1) und unter bestimmten Grant Agreement Nr. 785907 (menschliche Gehirn Projekt SGA2). Wir sind sehr dankbar, Prof. Alex Thomson, zum Aufbau des Protokolls in anderen kortikalen Regionen, die Sicherung der Finanzierung und für ihre kontinuierliche Unterstützung für dieses Projekt. Beiträge von Lab-Mitglieder, die geholfen, Optimierung der Erholung-Protokoll und rekonstruiert CA2 Neuronen sind dankbar anerkannt: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.

<ol><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics%3A+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321, 53-57 (2008).</li>
<li>DeFelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li>
<li>Bezaire, M. J., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+CA1+local+circuits%3A+knowledge+base+for+interneuron-pyramidal+cell+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity.</a> Hippocampus. 23, 751-785 (2013).</li>
<li>Katona, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior-dependent+activity+patterns+of+GABAergic+long-range+projecting+neurons+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus.</a> Hippocampus. 27, 359-377 (2017).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitating+pyramid+to+horizontal+oriens-alveus+interneurone+inputs%3A+dual+intracellular+recordings+in+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li>
<li>Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+correlations+between+action+potential+duration+and+the+properties+of+synaptic+connections+in+layer+4+interneurones+in+neocortical+slices+from+juvenile+rats+and+adult+rat+and+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat.</a> Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).</li>
<li>Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+bistratified+cell+IPSPs+and+basket+cell+IPSPs+by+pentobarbitone+sodium%2C+diazepam+and+Zn2%2B%3A+dual+recordings+in+slices+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus.</a> European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).</li>
<li>Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).</li>
<li>Thomson, A. M., Lamy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+neocortical+local+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maps of neocortical local circuitry.</a> Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>Wilent, W. B., Nitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+Place+Fields+of+Hippocampal+Formation+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).</li>
<li>Hirsch, J. A., Martinez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+processing+in+the+visual+cortical+column%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Laminar processing in the visual cortical column.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).</li>
<li>Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hippocampal+network+for+spatial+coding+during+immobility+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep.</a> Nature. 531, 185-190 (2016).</li>
<li>Yu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+hippocampal-cortical+memory+representations+for+experiences+associated+with+movement+versus+immobility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility.</a> eLife. 6, e27621(2017).</li>
<li>Markram, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+and+Simulation+of+Neocortical+Microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry.</a> Cell. 163, 456-492 (2015).</li>
<li>Van Geit, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BluePyOpt%3A+Leveraging+Open+Source+Software+and+Cloud+Infrastructure+to+Optimise+Model+Parameters+in+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience.</a> Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17(2016).</li>
<li>Gal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rich+cell-type-specific+network+topology+in+neocortical+microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry.</a> Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).</li>
<li>Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/cercor/article/12/9/936/383201">Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro.</a> Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).</li>
<li>Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+connections+made+by+presynaptic+cortico-cortical+pyramidal+cells+in+layer+6+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex.</a> Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).</li>
<li>West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+6+cortico-thalamic+pyramidal+cells+preferentially+innervate+interneurons+and+generate+facilitating+EPSPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs.</a> Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).</li>
<li>Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+properties+of+excitatory+synaptic+connections+involving+layer+4+pyramidal+cells+in+adult+rat+and+cat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).</li>
<li>Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neurons+in+the+CA2+subfield+of+the+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).</li>
<li>Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+involving+parvalbumin-positive+basket+cells+in+the+CA2+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus.</a> Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).</li>
<li>Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SP-SR+interneurones%3A+a+novel+class+of+neurones+of+the+CA2+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus.</a> Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).</li>
<li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemistry+and+electron+microscopy%3A+The+Preservation+of+Cellular+Ultrastructure+and+Enzymatic+Activity+by+Aldehyde+Fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation.</a> Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).</li>
<li>Somogyi, P., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+note+on+the+use+of+picric+acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde+fixative+for+correlated+light+and+electron+microscopic+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry.</a> Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).</li>
<li>Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunofluorescence%2C+peroxidase+labelling+and+ultrastructural+analysis+of+interneurones+following+prolonged+electrophysiological+recordings+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).</li>
<li>Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104(2014).</li>
<li>Mercer, A., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cornu+Ammonis+Regions-Antecedents+of+Cortical+Layers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers?</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83(2017).</li>
<li>Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+manual+neuronal+reconstruction+from+biocytin+histology+or+2-photon+imaging%3A+morphometry+and+computer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65(2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Elektrophysiologische Aufnahmen in Vitro (Abbildung 1 Ac,d und v. Chr., d) kombiniert mit histochemische und immunhistochemische Verfahren ermöglichen die detaillierte Morphologie, verbindliches Proteingehalt an Calcium und Identität des Erwachsenen kortikale Interneurone aufgezeichnet offenbart werden. In der CA2-Region, diese Technik erlaubt die Studie der lokalen Schaltung zum ersten Mal und offenbart Unterklassen von Interneuronen, die zuvor nicht in CA1 oder CA3 beschrieben hatte: breit dendritischen und axonalen Arbor Korb Zellen (Abbildung 1 b), Bistratified Zellen und SP-SR Interneuronen.
Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert, um die Ultrastruktur der Neuronen zu bewahren und erhalten ausgezeichnete Erholung der dendritischen (einschließlich Stacheln) und axonalen Dorne. Kritischen Schritte umfasst die Verwendung der doppelten Fixierung Technik zur Verbesserung der Kontrast für Lichtmikroskopie26 und die Zugabe von Glutaraldehyd und Pikrinsäure Lösung zur Fixativ Lösung Antikörper eindringen Verbesserung und Erhaltung der neuronalen Ultrastruktur27. Frost-Tausalz-sanfte Permeabilisierung gibt bessere Erhaltung der Feinstruktur, während Osmication und Harz einbetten Z-Plane Schrumpfung28reduzieren. Darüber hinaus ist die Visualisierung von sehr feinen Strukturen (Axone mit kleinen Boutons z. B. feine) verbessert durch Inkubation in den Abschnitten mit H2O2 und NaBH4 Hintergrundfärbung reduzieren. Kontrast kann auch mit dem Zusatz von NiCl2 der HRP-Reaktion erhöht werden.
Die histologische Verfahren detailliert hier bietet hervorragende Ergebnisse hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit. Allerdings bestimmt die Dauer der elektrophysiologischen Aufnahmen die Qualität der Färbung, mit kürzeren Aufnahmen meist verbunden mit schlechten axonalen Färbung Biocytin/Fluoreszenz. Die Wahl der Aufnahme Protokolle (intrazelluläre Aufnahmen mit scharfen Elektroden vs. ganze Zelle Patch spannen) kann auch Biocytin Aufbewahrung und Erhaltung der feinen Anatomie beeinflussen.
Während die Schwierigkeiten in Feinstruktur in histologischen Verarbeitung hier beschrieben und die Zeit genommen, bei 100 X Vergrößerung (1-4weeks abhängig von der Komplexität des Axons) rekonstruieren die Erhaltung sind willkommen, diese Methode gibt eine genaue Darstellung der dendritischen und axonalen Durchmesser. Die Verwendung von weniger anspruchsvolle Protokolle, Biocytin Kennzeichnung zu offenbaren ist verständlich, aber diese häufig klare Visualisierung der feinen axonalen Verzweigungen entgegen. Reinigungsmittel, Eintrag von Avidin-HRP Biocytin und Antikörper, enthüllen zu fördern sind oft in dicke Schichten notwendig, aber Feinstruktur stören können. Neurowissenschaftler Suche ständig für halbautomatische Methoden der Rekonstruktion, sondern für bleibt jetzt sowie für Axone insbesondere Biocytin-HRP mit manuellen Rekonstruktion der Gold-Standard-31.
Hochdetaillierte neuronale Rekonstruktionen, besonders genaue Zeichnungen der axonalen Boutons und Knoten, das Vorhandensein oder Fehlen von Myelin und ganz allgemein die Zeichnung des kompletten axonalen Laube, mit der Darstellung der genauen Axon-Durchmesser ändert sich entlang seiner Länge, finden Sie weitere Informationen für die genaue Identifizierung eines unterschiedlichen Typs Interneurone. Obwohl viele Interneurone nicht genau in einer bestimmten Klasse passen, bietet die oben beschriebene Technik korrelierte Daten auf neuronale elektrophysiologischen Eigenschaften, die kurzfristige Plastizität im Zusammenhang mit einer bestimmten Art von Verbindung und detaillierte neuronaler Rekonstruktionen, so dass den Schaltplan in der CA2-Region, zum Beispiel im Detail untersucht werden.
Feine, detaillierte Struktur wird oft in Rechenmodelle vereinfacht. Zwar verständlich, führt dies zum Verlust von Informationen, die in Zukunft kritisch erweisen könnte. Analyse der detaillierte 3D Rekonstruktionen mit parallelen synaptischen Daten ermöglicht die Zugabe von weiteren Kriterien für die interneuronale Einstufung. Daten können in öffentlichen Repositories hinterlegt und werden durch Modellbauer, um das Ergebnis der sporadische Änderungen im Axon Durchmesser und Myelinisierung auf Aktionspotential Ausbreitung rechnerisch zu erkunden.

Der Kortex und Hippocampus sind Strukturen von solcher Komplexität, dass die Klassifizierung der neuronalen1,2,3,4, Karten der Verbindungen zwischen ihnen5,6 Subtypen , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 und wie diese Schaltung unterstützt kognitive Funktionen12,13,14,15 sind noch unter intensivem Studium und Weiterbildung diskutiert. Zum Beispiel, Details und Komplexität der Schaltung zu verstehen und um Daten aus vielen verschiedenen Studien zu koordinieren, ist es äußerst hilfreich zu definieren und beschreiben Sie die Komponenten dürfen, aber es bleibt eine Frage zur Diskussion, wie viele verschiedene Klassen von Neuronen vorhanden sind, oder sogar ob es möglich ist, alle Neuronen als Zugehörigkeit zu einer bestimmten Klasse zu definieren ist. Computational Tools, die bauen und Testen von Schaltungen mit unterschiedlichem Grad der Komplexität, werden entwickelten16,17,18, aber diese Bemühungen im Mittelpunkt steht die Notwendigkeit einer detaillierten Untersuchungen der Zelltypen und von den Eigenschaften der Verbindungen zwischen ihnen. Eine große Menge an Informationen über die lokalen Schaltung des Neocortex der erwachsenen Ratten hat bereits erfasst wurden, mit das Protokoll beschrieben hier10,19,20,21, 22. Obwohl der "Schaltplan" bei weitem nicht vollständig ist, einige klare Muster oder Regeln entstanden. Obwohl einige Details unterscheiden, sind diese Regeln zwei Säugetierarten (Ratte und Katze) und über mehrere neokortikalen Regionen gemeinsam soll die Entwicklung von grundlegenden Bausteine, die auf menschlichen Neocortex gleichermaßen anwendbar sein dürften. Die hier beschriebene Technik wird verwendet, um unser Verständnis der funktionalen Karte der kortikalen Schaltung durch die Identifizierung der präsynaptischen und postsynaptischen Neuronen beteiligt Verbindungen in den Regionen, die nicht vor, detailliert untersucht worden sind, unter Verwendung eines Protokolls zu verlängern Das ermöglicht ausgezeichnete Gewebe Erhaltung und bemerkenswerte Färbung Erholung im Erwachsenen Gehirngewebe. Daten auf der lokalen Schaltkreis CA2 und neuronale Eigenschaften in diesem Unterfeld haben mit dieser Methode gesammelt wurden, durch die Kombination von intrazellulären elektrophysiologische Aufnahmen (gekoppelte Aufnahmen mit scharfen Mikroelektroden) mit Biocytin füllen, Immunfluoreszenz, histologische Verfahren und hochdetaillierten neuronaler Rekonstruktionen, direkter Vergleich mit den benachbarten CA Regionen23,24,25.
In diesem Artikel beschriebene Verfahren wurde entwickelt im Laufe der Jahre erhalten detaillierte neuronalen Anatomie erlaubt die korrekte Klassifizierung der Zellen und die hohe Qualität und genaue Rekonstruktionen der beiden ihre dendritischen und axonalen Dorne, Daten korreliert mit elektrophysiologische Daten aus gekoppelten Aufnahmen mit scharfen Elektroden. Die histologische Protokoll wurde optimiert, um die Ultrastruktur der Neuronen zu bewahren und erhalten ausgezeichnete Erholung der dendritischen (einschließlich Stacheln) und axonalen Dorne. Zum Beispiel gibt das Prinzip der doppelten Fixierung Technik durch zunächst in einer Fixativ Lösung eintauchen und zweitens nach dem fixieren in Osmium ausgefällt einen guten Kontrast für Lichtmikroskopie26. Eine kleine Menge von Glutaraldehyd und Pikrinsäure Lösung dazu das Fixativ Lösung, Antikörper eindringen zu verbessern und die Zellen Ultrastruktur wie in einer früheren Studie27zu bewahren. Die Permeabilisierung der Gehirnscheiben der Frost-Tausalz-Methode kombiniert mit Cryo-Schutz mit Saccharose, anstatt einer herkömmlichen Waschmittel bietet auch optimale Erhaltung der Gewebe für detaillierte morphologische Analyse der aufgezeichneten Zellen. Darüber hinaus ist die Visualisierung besonders der sehr feine Strukturen durch verringern Hintergrundfärbung mit der Inkubationen mit Wasserstoffperoxid (H2O2) und Natriumborohydrid (NaBH4) gesteigert. Hinzufügen von Nickelchlorid (NiCl2) zu den Meerrettich-Peroxidase (HRP) erhöht Reaktion auf ein schwarzes Pigment Reaktionsprodukt zu erhalten auch den Kontrast.
Das folgende Protokoll beschreibt die Verfahren zum ausgezeichneten Gewebe Bewahrung und hochdetaillierte neuronalen 3D-Rekonstruktionen nach intrazellulären Aufnahmen in Vitrozu ermitteln. Die Beschreibung der Slice-Vorbereitung, intrazelluläre gekoppelte Aufnahmen mit scharfen Elektroden und anschließende histologische Verfahren, die in unserem Labor wurden bisher gemeldeten28. Das Protokoll gilt für die Zellen intrazellulär mit Biocytin in 450 – 500 μm dicke Scheiben gefüllt, kann das gleiche Protokoll nach ganzen Zelle Aufnahmen verwendet werden. Jedoch wird die Verwendung von dünneren Scheiben weniger vollständige Rekonstruktionen der Zellen führen.

<table><tbody><tr><td>Avidin-7-amino-4-methylcumarin-3-essigsäure (Avidin-AMCA) Antikörper - 20,8 mg/ml&nbsp;</td><td>Vector laboratories</td><td>A2008</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin&nbsp; &ge; 98% (DC)</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>3,5 Diaminobenzidin (DAB) Tablette, Zur Herstellung von 5 mL</td><td>Sigma</td><td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan Epoxidharz A</td><td>Sigma</td><td>44611</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan Epoxidharz B</td><td>Sigma</td><td>44612</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan Epoxidharz C</td><td>Sigma</td><td>44613</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan Epoxidharz D</td><td>Sigma</td><td>44614</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, puriss. p.a., absolut, &ge; 99,8</td>%<td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>48723</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehydlösung, Grad I, 25 % in H2</td><td>O Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin, &ge; 99%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)- 14,3 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>F2653</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen Texas Red (TR)- 3,3 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>T2767</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid, 30%ige Lösung</td><td>Sigma</td><td>H-1009</td><td></td></tr><tr><td>Immersionsöl, Viskosität 1,250 cSt (lit.)</td><td>Sigma</td><td>I0890</td><td></td></tr><tr><td>Nickelchlorid (NiCl2 . 6H2O)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>N5756</td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid, für die Elektronenmikroskopie, 4% in H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, Reagenzqualität, kristallin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pikrinsäure, mit Wasser angefeuchtet, &ge; 98%</td><td>Sigma</td><td>197378</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer 1 M</td><td>Sigma</td><td>P3619</td><td></td></tr><tr><td>Propylenoxid (C3H6O), 99%</td><td>Alfa Aesar&nbsp;</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>Natriumtetrahydroborat</td><td>VWR</td><td>27885.134</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher scientific</td><td>S/8600/53</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Hydrochlorid, &ge; 99.0%</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Sockel, &ge; 99,9%</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Eindeckmedium, Brechungsindex 1,45&nbsp;</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC HRP Kit</td><td>Vector laboratories</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>Verwendete Geräte&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C4A Schröpflinge aus Aluminium&nbsp;</td><td>GA-MA & ASSOCIATES, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMR Mikroskop&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q&nbsp; Fluoreszenz-Lichtquelle</td><td>Excelitas Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DFC450 digitale Mikroskopkamera&nbsp;</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapidograph technischer Zeichenstift 0,18 mm&nbsp;</td><td>London Grafikzentrum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,18 mm Rapidograph Feder</td><td>London Grafikzentrum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapidograph technischer Zeichenstift 0,25 mm&nbsp;</td><td>Londoner Grafikzentrum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25 mm Rapidographenfeder</td><td>Londoner Grafikzentrum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida-System mit PC-Workstation, Bühne, Kamera und Joystic für XYZ-Tischsteuerung</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida Softwareversion 2017</td><td>Microbrighfield (MBF) Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDRAW Grafiksuite X5</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videobearbeitungssoftware&nbsp;</td><td>Adobe Premiere Pro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen 14 mL</td><td>Fisher wissenschaftlich&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biocytin erholung und 3d-rekonstruktionen der gefüllten hippocampal ca2 interneuronen

Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons

Wie kortikale Netzwerkaktivität verarbeitet ist Informationen für eine große Anzahl von Grundlagenforschung und klinische Fragestellungen von Bedeutung. Das hier beschriebene Protokoll identifiziert die grundlegenden Bausteine der diese Schaltung. Eingehenden Studien der kortikalen Regionen bieten letztlich andere Wissenschaftler mit der Schaltungskomponenten notwendig für das Verständnis, wie das Gehirn erhält, verarbeitet und speichert Informationen und was schief läuft in der Krankheit, während der elektrophysiologischen und morphologische Daten sind weit verbreitet durch rechnerische Neurowissenschaftler in den Bau von Modell-Netzwerke, die Informationsverarbeitung zu erkunden. Die hier beschriebene Protokoll beschreibt wie Biocytin gefüllten Zellen aufgezeichnet in der CA2-Region des Hippocampus sind wiederhergestellt und dann in 3D rekonstruiert. Das Protokoll beschreibt darüber hinaus die Demonstration der Calcium-bindendes Protein oder Peptid Inhalte in aufgezeichneten Interneuronen.

Neuronen im Hippocampus CA2 füllten sich mit Biocytin nach elektrophysiologische Aufnahmen (Zahlen 1Ac, Ad und 1Bc, Bd). Die Scheiben wurden über Nacht nach den Aufnahmen und der Neurochemie und morphologische Charakterisierung von Neuronen ergaben sich nach dem hier beschriebenen Protokoll.
Die Calcium-bindendes Protein oder Protein-Inhalt der gefüllten Interneuronen wurde durch Inkubation der Scheiben mit primären Antikörper und dann mit Fluoreszent markierten Sekundärantikörper bestimmt. Die Brand-Merkmale der Interneuronen während der Aufnahmen werden die Wahl der verwendeten primären Antikörper diktieren. Avidin-AMCA wurde verwendet, um die Biocytin gefüllt Interneuron visualisieren und Anti-Maus-Fluorescein erfolgt (FITC) und Ziege Anti-Kaninchen Texas Red (TR) wurden verwendet, um die interneuronale Neurochemie (Abbildung 1Bb) charakterisieren.
Im Anschluss an die Fluoreszenz-Visualisierung wurde eine HRP-Protokoll verwendet, um Biocytin (Abbildung 1Ab) offenbaren. Die feinere detaillierte Anatomie des CA2 Interneuronen wurde dann in 3D mit einem Neuron-Wiederaufbau-Software (Abbildung 2 und Abbildung 3a) gezeichnet. Eine Video von einem 3D-Rekonstruktion einer Korb-Zelle aufgenommen und in CA2 gefüllt wird im Videoangezeigt. Neuronale Rekonstruktionen galten als abgeschlossen, wenn die dendritischen und axonalen Dorne in die Tiefe des 450-500 μm Segments beschränkt waren. Armen axonalen Arbor Färbung wurde durch die Anwesenheit von abgeschnittenen Zweigen mit offenen Enden an der Ober- oder Unterseite der Scheibe oder durch eine Färbung bewertet, die auf das Axon ersten Segment und sehr proximale Äste beschränkte. Abbildung 4 stellt die Beispiele für eine gute und eine schlechte HRP Färbung folgende Biocytin Visualisierung.
Morphometrische Analyse von 3D-Rekonstruktionen (Abbildung 3) kann durchgeführt werden, Zweig Komplexität, Soma-Fläche und der Fläche und Volumen der dendritischen und axonalen Dorne zu demonstrieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig1.jpg"> Abbildung 1 : Neuronale Rekonstruktionen von zwei Arten von Korb Zellen aufgenommen und in der hippocampal CA2-Region gefüllt und korreliert elektrophysiologische Daten nach intrazellulären Aufnahmen erzielt in Vitro. Diese Zahl wurde von früheren Studien23,24geändert. SO Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM Stratum Lacunosum Moleculare. (A) Aa: Rekonstruktion einer CA2 Korb Zelle mit eingeschränkten dendritischen und axonalen Laube mit einem Zugrohrs (1000 X). Die Dendriten sind in schwarz, und das Axon ist rot. Ab: Bild der Biocytin gefüllten Korb Zelle nach dem hier beschriebenen Avidin-HRP-Protokoll. AC: Repräsentative Spur von Spannung Responses to hyperpolarizing und depolarisierende Stromeinspeisung einer CA2 Korb Zelle mit eingeschränkten dendritischen und axonalen Arbor. Anzeige: Beispiel einer CA2 Pyramide Arbor Korb Zelle Verbindungen einschränken mit scharfen Elektroden aufgenommen. Zusammengesetzte exzitatorischen postsynaptischen Potential (EPSP) Durchschnittswerte zeigen kurze Zug Depression offensichtlich während Reaktionen auf Züge der drei Ähren. (B) Ba: 2D Rekonstruktion einer CA2 Korb Zelle mit breiten dendritischen und axonalen Dorne mit einem Zugrohrs (1000 X). Die dendritische Baum dieser Korb Zelle (in schwarz) radial durch alle Schichten der CA2-Region und horizontal in SO und SP der CA2 und CA3 Regionen erweitert. Eine horizontale Dendrit erreichte auch die CA1-Region. Das Axon (in rot) auf die CA3 und CA1 Regionen ausgeweitet. BB: Die Biocytin gefüllt (AMCA Färbung) Korb Zelle war PV-Immunopositive (FITC Färbung) und CB-Immunonegative (Texas-rote Färbung). BC: Repräsentative Spur von Spannung Responses to hyperpolarizing und depolarisierende Stromeinspeisung einer CA2 Korb Zelle mit breiten dendritischen und axonalen Arbor. BD: Composite EPSP Durchschnittswerte zeigen kurze Zug Moderation offensichtlich während Reaktionen auf Züge der drei Ähren. In früheren Studien25,30finden Sie Beispiele für andere Arten von Interneuronen in CA2 aufgezeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig2.jpg"> Abbildung 2 : 3D Zellkörper Wiederaufbau. (A) 3D Rückverfolgung der Zellkörper. Blick auf die verschiedenen Konturen an verschiedenen Z-Positionen zurückzuführen, während durch die Zellkörper mit Schwerpunkt. (B) 3D Ansicht der verschiedenen Konturen. (C) 3D Ansicht der Zellkörper in einem anderen Winkel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig3.jpg"> Abbildung 3 : Morphometrie Analysen der neuronalen 3D-Rekonstruktionen. (A) 3D-Rekonstruktion einer CA2 schmale Laube Korb Zelle. Jede dendritische Verzweigung ist vertreten durch eine Farbe (grün, blau, rot und Pink) und Axon in hellblau. (B) Dendrogramm der Korb Zelle repräsentieren die Anzahl der dendritischen Zweige und Länge der einzelnen Segmente enthaltenen Kugeln konzentrisch mit dem Soma und Abständen von 100 μm aus der Soma. Die Farben auf das Dendrogramm entsprechen denen der Dendriten in A. (C) Beispiel für eine morphometrische Analyse auf CA2 Pyramidenzellen (adaptiert von einer früheren Studie23) durchgeführt. Die Zahl der dendritischen Filialen wurde gegen die Entfernung von der Soma CA2 Pyramidenzellen geplottet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig4.jpg"> Abbildung 4 : Beispiele für gute (A) und Arm (B) HRP beflecken. (A) Biocytin Erholung zeigte eine sehr gut gefüllte Interneuron in CA2. Der Zellkörper (CB) ist dunkel gefärbt und hat klare Konturen. Die Dendriten sind Perlen und einige Stacheln (dargestellt durch rote Sterne) angezeigt. Die axonale Laube (A) ist dicht und kleine Boutons präsentiert. (B) Beispiel für eine schlechte dendritischen und axonalen Färbung 2 Pyramidenzellen in CA2. Die Färbung des CB ist schwach mit keine klare Gliederung. Schlechte Färbung ist oft verbunden mit kürzeren elektrophysiologische Aufnahmen, was in der Gegenwart sehr wenige Biocytin gefüllt Zweige. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
Video 1: Neuronalen 3D-Rekonstruktion einer CA2 Korb Zelle mit eingeschränkten dendritischen Arbor (auch CA2 schmale Laube Korb Zelle genannt) mit seinen Soma in Stratum Pyramidale, quer durch alle Schichten und Axon CA2 Stratum Pyramidale und angrenzenden Stratum Oriens Dendriten und Radiatum. Sehr wenige Zweige erreicht der proximalen CA3 Stratum Oriens und CA3 Stratum Pyramidale. Diese Zelle wurde mit Biocytin nach elektrophysiologische Aufnahmen gefüllt und Abschnitte mit Avidin-HRP nach dem hier beschriebenen Protokoll verarbeitet wurden. Durch Schneiden, wurde nur das Axon in die Tiefe des Segments erholt, obwohl die Dendriten intakt sind. Dendriten sind dunkelrosa und Axon in weiß. Schicht und Region Grenzen wurden am Anfang des Videos hinzugefügt. 3D-Rekonstruktion von Georgia Economides-3D Video von Svenja Falk. Das Video wurde aufgenommen mit einem Neuron-Wiederaufbau-Software wie in Schritt 2.17 angegeben und mit einem Video-editing-Software bearbeitet. Link zum Video:30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/Figure_3.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Lösungen verwendet</td>
			<td>Zusammensetzung/Anweisungen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fixierung-Lösung</td>
			<td>4 % Paraformaldehyd, gesättigte 0,2 % Pikrinsäure, Lösung 0,025 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PB)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1 M Phosphatpuffer pH 7.6</td>
			<td>Fügen Sie 100 mL von Lager 1 M Phosphat-Puffer zu 900 mL destilliertem Wasser hinzu</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH-Wert 7,4/7,5</td>
			<td>Fügen Sie 10 mL 0,1 M Phosphatpuffer, 0,2 g KCl und 8,76 g NaCl bis 990 mL destilliertes Wasser</td>
		</tr>
<tr>
<td>TRIS-Puffer pH 7,5</td>
			<td>5,72 g Tris-Hydrochlorid und 1,66 g Tris-Base in 50 mL destilliertem Wasser auflösen. Dann machen Sie bis zu 1 L mit destilliertem Wasser.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gepufferte Glutaraldehyd und Paraformaldehyd Fixativ Lösung</td>
			<td>4 % Paraformaldehyd, gesättigte 0,2 % Pikrinsäure, Lösung 0,025 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer.</td>
		</tr>
<tr>
<td>ABC-Lösung</td>
			<td>Lösung für mindestens 30 min vor Gebrauch aus dem ABC-Kit gemacht werden. Fügen Sie 1 Tropfen der Lösung A und 1 Tropfen der Lösung B bis 2,5 mL PBS.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Durcupan Epoxidharz:</td>
			<td>Zu 20 Töpfe: 20 g der Komponente A, 20 g der Komponente B, 0,6 g der Komponente C und 0,4 g Komponente D -</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Schützen Sie das Gleichgewicht von Leckagen durch die Abdeckplatte mit einem Kreis von Filterpapier. Sorgfältig abwägen der Reagenzien in einen Tripour Becher im oben genannten Verhältnis. Mischen Sie gründlich, indem mit zwei Holzstäbchen für mindestens 5 min kräftig rühren. Die Mischung sollte eine gleichmäßige Dichte dunkelbraune Farbe geworden. Stellen Sie den Becher in den Ofen bei ~ 50 ° C für maximal 10 min so viele Luftblasen wie möglich zu entfernen. Hinweis: Das Harz beginnt zu heilen, wenn Sie dem Becher in den Ofen länger als 10 min. Dekantieren des Harzes in Plastiktöpfen oder 5 mL Spritzen weglassen, sie datieren und in den-20 ° C-Gefrierschrank einsatzbereit speichert.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Tabelle der Lösungen.

Das Protokoll hier skizzierten beschreibt die Immunfluoreszenz-Analyse, Biocytin Erholung und qualitativ hochwertige Rekonstruktionen der hippocampalen CA2 Interneuronen nach der intrazellulären elektrophysiologische Aufnahmen in-vitro- so dass neuronale Charakterisierung und letztlich feine neuronalen Anatomie studiert werden.

Biocytin Erholung und 3D-Rekonstruktionen der gefüllten Hippocampal CA2 Interneuronen

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described ...

Diese Methode kann helfen, neuronale Subtypen zu klassifizieren und unser Verständnis der funktionellen Karte kortikaler Schaltkreise zu erweitern. Dieses Protokoll wurde optimiert, um die Ultrastruktur der Neuronen zu erhalten und eine ausgezeichnete Erholung sowohl derdritischer als auch axonaler Lauben zu erhalten, was qualitativ hochwertige Rekonstruktionen ermöglicht. Übertragen Sie am Ende einer elektrophysiologischen Aufzeichnung die Scheibe mit der aufgezeichneten Zelle auf eine kleine Schale VON ACSF.Während der Arbeit in einer Dunstabzugshaube, rollen Sie die Scheibe auf ein kleines Stück fein hochwertiges Filterpapier und legen Sie ein weiteres Stück befeuchtetes Filterpapier auf die Scheibe. Das Gewebe in einen kleinen Plastiktopf mit 5 bis 10 Milliliter fixierender Lösung legen und über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Am nächsten Tag das Gewebe aus dem Behälter mit fixativer Lösung in einen Behälter mit zwei Millilitern 0,1 Molphosphatpuffer übertragen, um zu spülen, und schneiden Sie überschüssiges Gewebe mit einer Skalpellklinge ab.Entfernen Sie überschüssiges Gewebe, indem Sie die Scheibe in eine Petrischale legen, und schneiden Sie das überschüssige Gewebe mit einer Skalpellklinge ab. Übertragen Sie das getrimmte Gewebe auf eine saubere Petrischale, um sicherzustellen, dass es flach ohne Falten oder Falten liegt. Entfernen Sie den überschüssigen Puffer mit einem trockenen Pinsel.Bedecken Sie das Gewebe mit warmer Gelatinelösung und legen Sie die Petrischale auf einen gefrorenen Block, um die Lösung schnell abzukühlen. Dann bewegen Sie das Gericht der Einstellung Gelatine auf 4 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten. In einer Dunstabzugshaube schneiden Sie mit einer Skalpellklinge einen kleinen, 1 x 1 Zentimeter großen Block mit dem eingebetteten Gelatinegewebe aus.Heben Sie den Block mit einem kleinen Spachtel an und übertragen Sie ihn vorsichtig in eine frische Fixierlösung. Mindestens 30 Minuten bei vier Grad Celsius fixieren. Nach dieser zweiten Fixierung den Gelatineblock dreimal in fünf Milliliter PB waschen.Trocknen Sie den Block nach dem Waschen mit einem Stück Papiergewebe. Dann verwenden Sie eine kleine Menge Cyanoacrylat-Kleber, um den Block zu kleben, mit dem Gewebe an der Spitze ausgerichtet, auf einen Vibram-LKW mit Superkleber. Schneiden Sie die Scheibe mit einer Dicke von 50 Mikrometern mit einem Vibratom ab und legen Sie jeden Abschnitt sorgfältig in eine Glasdurchstechflasche mit 10 Prozent Saccharose.Nach dem Schnitt einen Abschnitt vorsichtig von der Durchstechflasche aufnehmen und flach in einen Petrischalendeckel legen. Verwenden Sie dann eine frische Skalpellklinge, um die Gelatine um den Abschnitt herum zu entfernen. Legen Sie die Abschnitte in eine Durchstechflasche mit 2 Milliliter frische 10 Prozent Saccharose in PB, und agitieren Sie für 10 Minuten, um den Kryoschutzprozess zu beginnen.Legen Sie die Abschnitte nach kryoschutzweise mit einem Pinsel flach auf ein kleines Rechteck aus Aluminiumfolie. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Abschnitten und falten Sie die Folie vorsichtig in ein Paket. Halten Sie die Aluminiumfolie in der Nähe der Oberfläche von flüssigem Stickstoff, ohne die Oberfläche für 30 Sekunden zu berühren.Und dann lassen Sie die Abschnitte für etwa 30 Sekunden vollständig auftauen. Wiederholen Sie das Einfrieren Tauwetter noch zwei Mal. Entfernen Sie alle Abschnitte von der Folie mit einem Pinsel und legen Sie sie in eine Glasflasche mit zwei Milliliter PB, um überschüssige Saccharose unter ständiger Erregung abzuwaschen.Nach der Immunfärbung für fluoreszenzbildende Bildgebung, legen Sie das Dia in eine Glas Petrischale mit PBS enthalten, und entfernen Sie vorsichtig den Deckelschlupf. Dann waschen Sie die Abschnitte von der Rutsche mit sanften Impulsen von PBS aus einer Pasteur Pipette. Legen Sie die Abschnitte in eine saubere Glasdurchstechflasche mit PBS.Führen Sie die Avidin HRP-Reaktion durch erste Inkubation der Abschnitte in Avidin Biotin-Komplex oder ABC, für mindestens zwei Stunden, um das HRP-Reaktionsprodukt zu verstärken. Als nächstes waschen Sie die Abschnitte mit PBS 3 mal für 10 Minuten, und dann mit Tris Puffer zweimal für 10 Minuten. Nach dem Entfernen der letzten Tris Pufferwäsche, fügen Sie schnell einen Tropfen von acht Prozent Nickelchlorid-Lösung auf die Diaminobenzidin-Lösung oder DAB-Lösung.Dann Pipette die Lösung in und aus zu mischen und schnell einen Milliliter dieser Lösung über die Abschnitte hinzufügen. Inkubieren Sie die Abschnitte in dieser Lösung für 15 Minuten. Dann fügen Sie 10 Mikroliter 1 Prozent Wasserstoffperoxid in die DAB-Lösung.Lassen Sie die Reaktion im Dunkeln unter ständiger Agitation für etwa ein bis zwei Minuten ablaufen, bis die Zellen beschriftet sind. In einer Dunstabzugshaube einen kleinen Kreis Filterpapier in eine Petrischale legen und mit PB dämpfen. Heben Sie die Abschnitte nacheinander mit einem Pinsel aus der Glasflasche und legen Sie sie vorsichtig flach auf das Papier. Bedecken Sie die Abschnitte mit einem weiteren befeuchteten Kreis von Filterpapier und entfernen Sie überschüssigen Puffer, indem Sie Gewebepapier sanft an die Oberfläche berühren.Acht oder neun Tropfen von einem Prozent Osmiumtetroxid in PB auf das oberste Papier auftragen. Bedecken Sie das Gericht und behalten Sie in der Dunstabzugshaube für mindestens 30 Minuten, aber nicht mehr als 1 Stunde. Nach dem Spülen, Montieren und Abdecken der Abschnitte, dehydrieren Sie durch eine Reihe von 50 Prozent, 70 Prozent, 95 Prozent und 100 Prozent Alkohollösungen.Nach dem Austrocknungsschritt die Abschnitte für etwa fünf Minuten in eine Glasdurchstechflasche mit 100 Prozent Ethanol auf einem Shaker übertragen. Ersetzen Sie die Alkohollösung durch Propylenoxid und waschen Sie sie dreimal für fünf Minuten. Nach der letzten Wäsche etwa zwei Milliliter Propylenoxid in der Durchstechflasche aufbewahren und Harz im Verhältnis 1:1 hinzufügen.Stellen Sie sicher, dass das Harz gelöst ist und halten Sie die Abschnitte 30 Minuten lang unter ständiger Rührung. Nach 30 Minuten verwenden Sie einen Holzstab, um jeden Abschnitt in eine Aluminiumplanchette mit Epoxidharz zu legen, und über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag die Planchette für ca. 10 Minuten auf eine Kochplatte stellen.Dann nehmen Sie jeden Abschnitt mit einem Holzstab und legen Sie auf einer sauberen Rutsche. Nachdem alle Abschnitte auf die Folie übertragen wurden, sehen Sie sich die Folie unter einem Seziermikroskop an, um die Ausrichtung der Scheiben zu überprüfen und einen Deckelschlupf über die Abschnitte zu legen. 48 Stunden im Ofen bei 56 Grad Celsius aushärten.Verwenden Sie ein Ziel mit niedriger Vergrößerung, um sich auf den Home-Abschnitt zu konzentrieren, der den Zellkörper enthält. Verwenden Sie dann ein 100-faches Ziel, konzentrieren Sie sich auf den Zellkörper, und klicken Sie in die Mitte, um den Referenzpunkt zu markieren. Um das Soma in 3D mit dem 100x-Objektiv zu verfolgen, wählen Sie Kontur aus der Spurenregisterkarte aus, und wählen Sie die Zellkörperkontur aus.Verwenden Sie den Joystick, um den Fokus ganz oben auf den Zellkörper zu verschieben. Platzieren Sie die Punkte, indem Sie auf den Umfang des Teils klicken, das sich derzeit im Fokus befindet. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie die Kontur schließen aus, um diese erste Gliederung abzuschließen.Wiederholen Sie diesen Vorgang an verschiedenen Z-Positionen, bis der Boden des Zellkörpers erreicht ist. Um die dendritische Laube zu verfolgen, wählen Sie Dendrit oder apikal dendrit, im Neuronenmenü. Verfolgen Sie zunächst ein kurzes Anfangssegment für jeden Dendriten mit dem Mausscrollrad, um den Durchmesser des Cursors an den Durchmesser des Dendriten anzupassen.Verfolgen Sie entlang jedes Dendriten. Wenn ein Knoten in der Struktur erreicht ist, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Bifurcating-Knoten oder den Trifurcating-Knoten aus dem Dropdown-Menü. Um übereinstimmende Punkte zwischen den Dendriten in einem Abschnitt zu identifizieren, der als abgeschlossener Abschnitt übereinstimmt, klicken Sie auf die Registerkarte Verschieben, und wählen Sie Übereinstimmungspunkte aus.Wählen Sie die Anzahl der Punkte aus, die abgeglichen werden müssen, und drücken Sie dann OK. Klicken Sie auf das Ende einer abgeschlossenen Filiale und dann auf die Filiale. Wiederholen Sie dies für jeden Matchpunkt. Sobald alle Dendriten jedes Abschnitts zurückverfolgt wurden, verfolgen Sie das Axon mit dem gleichen Verfahren, das hier gezeigt wird, eine Rekonstruktion einer CA2-Korbzelle mit eingeschränkter dendritischer und axonaler Laube mit einem Zeichenrohr.Die Dendriten sind in schwarz und das Axon ist in rot. Dies ist ein Beispielbild der biocytingefüllten Korbzelle nach dem hier beschriebenen Avidin HRP-Protokoll. Hier ist ein Video einer neuronalen 3D-Rekonstruktion der CA2-Korbzelle zu sehen.Dendriten sind in dunkelrosa und das Axon in weiß. Schließlich zeigt dieses Bild ein Dendrogramm der CA2-Korbzelle. Es wird einige Zeit dauern, bis dieses Protokoll kompetent wird.Dieser optimierte Ansatz kann jedoch hochauflösende Bilder komplexer kortikaler und hippocampaler Strukturen in-vitro erzeugen.

biocytin-recovery-3d-reconstructions-filled-hippocampal-ca2

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt den Prozess der Visualisierung eines mit Biocytin gefüllten Interneurons in einem Hippocampus-Schnitt einer Ratte und hebt seine neurochemische Identität durch den Einsatz spezifischer Antikörper und Fluoreszenzmikroskopie hervor.

Immunfärbung von Interneuronen in einem Hippocampus-Schnitt an der Ratte

Dieses Video zeigt das Verfahren zum Färben von fixierten Rattenhirnschnitten, die Biocytin-gefüllte Interneurone enthalten. Das Protokoll umfasst die Inkubation mit dem Avidin-Biotin-Komplex (ABC), die Färbung mit HRP und chromogenem Substrat, die Konservierung der Strukturen mit Osmiumtetroxid und die Einbettung des Gewebes in Harz für die Bildgebung.

Markierung von Biocytin-gefüllten Interneuronen in Hippocampusschnitten von Ratten zur Visualisierung

Um die Struktur neuronaler Netze zu verstehen, funktionellen und morphologischen Charakterisierung der einzelnen Neuronen notwendig. Hier zeigen wir, juxtasomal Biocytin Etikettierung, die elektrophysiologischen Ableitungen in der extrazellulären Konfiguration ermöglicht, aber die Aufrechterhaltung der Fähigkeit, intrazellulär beschriften Sie die Neuron für Post-hoc-Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Architektur.

Juxtasomal Biocytin Labeling, um die Struktur-Funktions-Beziehung der einzelnen kortikalen Neuronen Studieren

Kortikaler Netzwerke werden von einem kleinen, aber vielfältige Reihe von hemmenden Inter gesteuert. Funktionelle Untersuchung von Inter erfordert daher gezielte Aufnahme und strenge Identifizierung. Hier beschrieben wird, ist ein kombinierter Ansatz, der Ganzzellableitungen von einzelnen oder synaptisch gekoppelten Paare von Neuronen mit intrazelluläre Markierung, Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

Kulturen mit niedriger Dichte von primären hippokampalen Neuronen benötigen normalerweise eine Glia-Feeder-Schicht, um neurotrophe Faktoren zu liefern und die Langlebigkeit zu erhalten. Wir beschreiben hier eine vereinfachte Methode zur Kultivierung von Neuronen mit extrem niedriger Dichte auf Glasdeckgläsern in Gegenwart einer neuronalen Feeder-Schicht mit hoher Dichte, die die Untersuchung spezifischer neuronal-autonomer Mechanismen erleichtert.

Ein vereinfachtes Verfahren für Ultra-Low Density, Long-Term Primäre Hippocampus Kultur

Dieses Protokoll stellt eine Methode für die morphologische Erholung von Neuronen während elektro Aufnahmen mit biocytin Füllung und anschließende immunhistochemischen Nachbearbeitung geflickt. Wir zeigen, dass dicke biocytin gefüllten Abschnitte, die später mit einem zweiten primären Antikörper Tage oder Monate erneut gefärbt können wurden gefärbt und Eindecken werden.

Immunostaining von Biocytin gefüllte und verarbeitete Abschnitte für Marker Neurochemisches

Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die Kombination von ganzen Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen und zwei-Photon imaging um Ca2 + Transienten im neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten zu erfassen.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Hier stellen wir Protokolle zur Herstellung von akuten Hirnscheiben vor, die den lateralen Geniculate-Kern enthalten, und die elektrophysiologische Untersuchung der Funktion retinogenes und kortikogener Synapsen. Dieses Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, Synapsen mit der hohen Freisetzungs- und Low-Release-Wahrscheinlichkeit in den gleichen akuten Gehirnscheiben zu untersuchen.

Elektrophysiologische Untersuchungen der Retinogeneulate und Corticogeniculate Synapse-Funktion

Wir stellen ein Protokoll zur Vorbereitung von Akutscheiben aus dem dorsal-zwischengeschalteten Hippocampus von Mäusen vor. Wir vergleichen dieses transversale Präparat mit koronalen Schnitten in Bezug auf die Qualität der Aufnahmen und die Erhaltung morphologischer Merkmale aufgezeichneter Neuronen.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

Die Kombination von viraler Vektortransduktion und Gehirn-Clearing mit der CLARITY-Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung einer großen Anzahl von Neuronen und Astrozyten.

Untersuchung der räumlichen Interaktion zwischen Astrozyten und Neuronen in geräumten Gehirnen

Erfahren Sie die Biocytin-Rückgewinnung und 3D-Rekonstruktion von Hippocampus-CA2-Interneuronen nach elektrophysiologischen Aufzeichnungen. Diese Methode ermöglicht präzise morphologische Analysen neuronaler Schaltkreise.

Biocytin Erholung und 3D-Rekonstruktionen der gefüllten Hippocampal CA2 Interneuronen

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