Struktur-Lösung von den fluoreszierenden Proteins Himmelblau mit MeshAndCollect

Das automatisierte MeshAndCollect-Protokoll wurde entwickelt, um serielle Kristallographie mit Standard-Rotationsdatensammlung zu kombinieren, um kleine Kristalle aus Puckproben zu messen. Das Verfahren identifiziert zunächst die Position von Kristallen, die auf demselben Probenhalter montiert sind, um dann die Sammlung von Teildatensätzen zu leiten, die anschließend zusammengeführt und für die Lösung der Struktur verwendet werden. MeshAndCollect ist überzeugend, da es Ihnen ermöglicht, Experimente schnell und mit dem gleichen Setup, Strukturlösung, Liganden-Screening und all dem mit winzigen Kristallen zu machen.

Die Methode ist kompatibel mit dem VMX von synchrotron beamline, der ideal mit einem hohen Photonenflex, einem kleinen Strahldurchmesser und einem schnellen Nachladedetektor ausgestattet ist. Verbinden Sie zunächst das erweiterte Informationssystem für die Datenbank von Proteinkristallographie beamline und wählen Sie MX.Log mit der Experimentnummer und dem Kennwort aus dem Formular A aus. Wählen Sie als Nächstes Lieferung Neu hinzufügen aus, und geben Sie die angeforderten Informationen ein.

Wählen Sie Partielle hinzufügen aus, und füllen Sie die relevanten Daten aus. Wählen Sie Container hinzufügen, wählen Sie einen SC3 Puck, und füllen Sie die erforderlichen Informationen einschließlich der Positionen der Probenhalter in der Puck. In der experimentellen Hütte, laden Sie den Puck in die Probe Wechsler Doer und notieren seine Position.

Melden Sie sich als Nächstes in das Informationssystem für die Datenbank von Proteinkristallographie Beamline an. Wählen Sie Experiment vorbereiten aus, suchen Sie die Lieferung, wählen Sie Weiter aus, und geben Sie die Beamline- und Puckposition im Musterwechsler an. Melden Sie sich bei der Beamline-Steuerungssoftware mit der experimentellen Nummer und dem Kennwort im Formular A an.

Drücken Sie Sync, um die Beamline-Steuerungssoftware mit dem Informationssystem für die Datenbank von Proteinkristallographie Beamline zu synchronisieren. Verwenden Sie die Beamline-Steuerungssoftware, um den Probenhalter auf das Goniometer zu montieren. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf eine Position im Sample-Wechslerbereich, und wählen Sie Probe montieren aus.

Wählen Sie die mittlere Schaltfläche und dann drei Klicks In-Mitte auf der Mitte der Kante der Spitze der Schleife. Speichern Sie die zentrierte Position, indem Sie Speichern auswählen. Fügen Sie unter Erweitert die Visuelle Neuausrichtung des Workflows zur Datensammlungswarteschlange hinzu.

Starten Sie dann den Workflow, indem Sie auf Warteschlange sammeln klicken. Wählen Sie als Nächstes eine der gespeicherten Mittelpositionen aus, indem Sie darauf klicken. Klicken Sie erneut auf die mittlere Taste, dann eine Drei-Klick-Mitte auf der Mitte des Anfangs des Stiels der Schleife.

Speichern Sie die zweite Position, indem Sie auf Speichern klicken. Und klicken Sie dann auf Weiter. Nachdem der Workflow die Ebene des Probenhalters an der Rotationsachse des Goniometers ausgerichtet hat, zentrieren Sie den Probenhalter wieder irgendwo in der Mitte des Netzes.

Richten Sie den Probenhalter so aus, dass die Fläche des Netzes senkrecht zur Röntgenstrahlrichtung verläuft, indem Sie die Omega-Achse mit der Beamline-Steuerungssoftware drehen. Klicken Sie in der Beamline-Steuerungssoftware auf das Dropdown-Menü Aperture und wählen Sie einen Wert aus. Klicken Sie dann auf das Symbol des Mesh-Werkzeugs, um das Netzwerkzeugfenster aufzuführen.

Zeichnen Sie in der Beispielansicht der Beamline-Steuerungssoftware das Netz per Linksklick und Ziehen der Maus über den Bereich, der Kristalle auf dem Probenhalter enthält. Um das Netz zu speichern, klicken Sie auf die Plus-Schaltfläche im Netzwerkzeugfenster. Geben Sie im Auflösungsfeld der Beamline-Steuerungssoftware die Auflösung ein, bei der Beugungsbilder gesammelt werden sollen.

Wenn keine vorherigen Informationen über die Beugungsqualität der Kristalle bekannt sind, wird ein Wert zwischen zwei und 2,5 empfohlen. Wählen Sie MeshAndCollect auf der Registerkarte Erweiterte Datensammlung aus. Fügen Sie sie der Warteschlange hinzu, und klicken Sie auf Warteschlange sammeln.

Verwenden Sie im Parameterfenster die beamlineabhängigen Standardparameter. Im hier beschriebenen Experiment sind Die Standardparameter 0,037 Sekunden Belichtungszeit pro Netzscanpunkt, 100 % Übertragung und eine Grad-Oszillation pro Netzscanlinie. Klicken Sie auf Weiter.

Die Netzscanläufe und die an jedem Rasterpunkt gesammelten Beugungsbilder werden mit der Software Dozer analysiert und nach Beugungsstärke geordnet. Nach der Dozer-Analyse wird eine Heatmap generiert und der Auftrag für nachfolgende Teildatensammlungen wird automatisch basierend auf der Beugungsfestigkeit zugewiesen. Klicken Sie schließlich auf Weiter, um die teilseits gehenden Datensammlungen zu starten.

MeshAndCollect, wie in MXCuBE implementiert, wurde für die Sammlung von partiellen Beugungsdatensätzen aus kleinen Kristallen von Cerulean verwendet, die sich auf demselben Probenhalter befinden, in dem die visuelle Identifizierung von Kristallen schwierig war. Um den Probenhalter zu überprüfen, wurde ein Raster über die Mitte der Netzschleife gezeichnet und basierend auf der Dozer Score Heatmap wurden automatisch 85 partielle Beugungsdatensätze erfasst. Diese wurden einzeln integriert und dann zu einem Datensatz mit 99,8% Vollständigkeit bei einer Auflösung von 1,7 Angstroms zusammengeführt.

Wie erwartet, könnte die Kristallstruktur von Cerulean durch molekularen Ersatz mit dem erzeugten Datensatz gelöst werden. Nach der Verfeinerung wurden eine R-Arbeit von 22,8 % und ein R frei von 25,4 % erhalten. Die Superposition der zuvor ermittelten Struktur zeigt eine globale RMSD auf c-alpha Positionen von 0,1 Angstroms.

Für Projekte, bei denen die Optimierung der Kristallwachstumsphase, MeshAndCollect bietet die Möglichkeit, einen vollständigen Datensatz basierend auf der Kombination dieser amorphen Teildatensätze aus kleineren Kristallen erhalten zu erhalten. Diese Technik ebnete den Weg für Strukturbiologen, um eine Struktur aus Teilen zu lösen, bei denen nur ein paar Zehntel Mikrokristalle nicht produziert werden konnten.