Optimierte Interferon-Gamma ELISpot Assay zur Maßnahme T-Zell-Antworten im Meerschweinchen-Modell nach der Impfung
20. Januar 2019
Die Entwicklung der Interferon-Gamma ELISpot Assay für Meerschweinchen PBMCs ermöglicht die Charakterisierung der T-Zell-Reaktionen in diesem hochaktuellen Modell für die Untersuchung von Infektionskrankheiten. Wir haben den Test zur Messung der T-Zell-Antworten intradermale Bereitstellung von DNA-Impfstoffen angewandt.
In der Vergangenheit beschränkte sich die Charakterisierung von Immuntherapeutika im Meerschweinchenmodell auf die Messung der humoralen Immunität. Der ELISpot-Assay überwindet diese Einschränkung und wird Forschern helfen, aussagekräftigere Daten in diesem Tiermodell zu generieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Zellen aus peripherem Blut gewonnen werden.
Es ist keine Nekropsie erforderlich. Dies ermöglicht nicht nur die Messung der Größe, sondern auch die Kinetik der T-Zell-Antworten bei einzelnen Meerschweinchen während einer natürlichen Infektion oder während eines Impfstoffschemas. Demonstrieren sie das Verfahren wird Holly Pugh sein.
Sie ist wissenschaftliche Mitarbeiterin der präklinischen R- und D-Abteilung von Inovio. Beginnen Sie 15 Mikroliter 35% Ethanol zu jedem Brunnen einer ELISpot-Assayplatte. Nach 60 Sekunden 150 Mikroliter PBS zu jedem Brunnen hinzufügen.
Und die Platte invertieren, um die Ethanol-Vorbehandlung zu stoppen. Große Sorgfalt sollte auch beim Umgang mit den ELISpot-Assayplatten geübt werden, um eine Kontamination oder Beschädigung der Membran zu vermeiden. Um die Platte zu waschen fügen Sie 250 Mikroliter PBS zu jedem Brunnen.
Nachdem Sie die Wäsche zwei weitere Male wiederholt haben, fügen Sie jedem Brunnen 100 Mikroliter Anti-Meerschweinchen-Interferon-Gamma-Antikörper VE4 hinzu. Dann inkubieren Sie die Platte für mindestens 12 Stunden bei 4 Grad Celsius. Nach der Inkubationszeit die Teller dreimal waschen.
Fügen Sie 200 Mikroliter Blockierpuffer zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Dann waschen Sie die Teller noch dreimal.
Bereiten Sie konische Rohre mit 4,5 ml Raumtemperatur-Gradientenmedium vor. Dann mischen Sie ein gleiches Volumen von Hanks'Balanced Salt Solution mit dem Blut. Schichtdas verdünntes Blut nach und nach über die Dichte Gradient medium, achten darauf, nicht die Schnittstelle zu stören.
Danach zentrieren Sie die Rohre bei 800 x g 30 Minuten lang ohne Bremsen bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Rohr aus der Zentrifuge, wobei darauf geachtet wird, die Schichten nicht zu stören. Nach korrekter Identifizierung der Schichten saugen Die komplette Buffy-Schicht an, um die PBMCs zu ernten.
Schichtung des HBSS-verdünnten Blutes langsam auf das Dichtegradientenmedium. Vermeiden Sie Störungen des Rohres und schalten Sie die Zentrifugenbremsen aus. Übertragen Sie die Zellen in eine neue 15 ml Tube.
Dann verdünnen Sie die Zellen in R10 mittel bis zu einem Gesamtvolumen von 15 ml. Nach dem Pelletieren der Zellen, entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 15 ml R10 Medium. Übergeben Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein neues Rohr.
Zählen Sie die Zellen und bestimmen Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit dem Trypan-Blauausschlusstest. Dann verdünnen Sie die Zellen mit R10 medium. Entfernen Sie zunächst den Sperrpuffer und waschen Sie die Platten.
Für jede PBMC-Probe geben Triplicate der Positivkontrolle, der Negativkontrolle und jedes experimentierfreudige Stimulans an. Verdünnen Sie den Proteinpeptidpool in R10 mittel- bis dreimal so hoch wie die gewünschte Endkonzentration. Danach 50 Mikroliter des Peptids R10 Medium Mischung zu den Stimulans Testbrunnen der Platte hinzufügen.
Dann fügen Sie 50 Mikroliter MT Peptid Formulierung in R10 medium zu den negativen Kontrollbrunnen der Platte. Fügen Sie ConA in R10 Medium zu den Positivkontrollbrunnen der Platte hinzu, und fügen Sie dann 100 Mikroliter der PBMC-Suspension in alle Brunnen ein. Legen Sie die ELISpot-Platte auf eine gleichmäßige Oberfläche im Inkubator und vermeiden Sie es, die Platte während der Inkubationszeit zu stören.
Nachdem Sie die Platte vorsichtig aus dem Inkubator entfernt haben, kehren Sie die Platte um, um den Überstand zu entfernen. Dann waschen Sie den Teller dreimal. Fügen Sie 100 Mikroliter verdünnter biotinylierter Detektion simpere Anti-Meerschweinchen-Interferon-Gamma-Antikörper N-G3 zu jedem Brunnen.
Dann inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Invertieren Sie die Platte, um die Antikörperlösung zu entfernen und die Wäsche dreimal zu wiederholen. Nach dem Entfernen der PBS von der Platte, fügen Sie 100 Mikroliter ALP konjugierte sedierte sptavidin in Sperrpuffer verdünnt zu jedem Brunnen.
Dann inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für eine Stunde. Invertieren Sie die Platte, um die ALP Streptavidin Lösung zu entsorgen und waschen Sie die Platte zweimal. Invertieren Sie die Platte und blots es gegen ein sauberes Papiertuch, um überschüssige PBS zu entfernen.
Danach die Platte mit 250 Mikroliter Neines DI-Wasser pro Brunnen waschen. Invertieren Sie die Platte und entfernen Sie das überschüssige Wasser mit einem sauberen Papiertuch. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter BCIP/NBT Substratlösung zu jedem Brunnen hinzu.
Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 20 Minuten vor Licht geschützt. Spülen Sie die Platte viermal mit DI-Wasser. Dann invertieren und tippen Sie auf die Platte, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
Schließlich entfernen Sie die Kunststoffentwässerung von der Unterseite der Platte und lassen Sie die Membran vollständig trocknen. Nach erfolgreicher Dichtegradientenzentrifugation, wie bereits gezeigt, sollte die rote viskose Flüssigkeit am Boden des Rohres die meisten roten Blutkörperchen enthalten. Die buffy Schicht liegt zwischen der Plasmaschicht und dem Dichtegradientenmedium.
Die Vorbehandlung der Brunnen vor dem Hinzufügen des Capture-Antikörpers zeigte der Assay eine verbesserte Definition zusammen mit einer Verringerung der Anzahl unspezifischer Flecken in den negativkontrollierbaren Brunnen. Spots deuten auf Interferon-Gamma-Produzierenvon T-Zellen innerhalb der PBMC-Population hin. Beim Versuch dieser Technik ist es wichtig, sich daran zu erinnern, das Blut sorgfältig, aber schnell zu verarbeiten.
Dies wird die Zelllebensfähigkeit verbessern, die Punktbildung verbessern und die Bildung unspezifischer Flecken reduzieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blut und BCIP/NBT-Substrat gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter PSA sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden. Ich glaube, dass dieses Protokoll es Forschern ermöglicht, Krankheiten mit einer wichtigen T-Zell-Komponente wie TB, Ebola und HSV zu untersuchen.
Wichtig ist, dass die Entwicklung von Impfstoffprotokollen im Versuchskaninchenmodell verfeinert und der Einsatz weniger relevanter Tiermodelle verringert wird.
Übersicht
Die Entwicklung des Interferon-gamma-ELISpot-Assays für periphere mononukleäre Zellen (PBMCs) des Meerschweinchens ermöglicht die Charakterisierung von T-Zell-Antworten in diesem wichtigen Modell für Infektionskrankheiten. Mit diesem Assay können Forscher sowohl die Stärke als auch die Kinetik von T-Zell-Antworten während natürlicher Infektionen oder Impfregime messen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Infektionskrankheiten
- Impfstoffentwicklung
Hintergrund
- Bisherige Methoden konzentrierten sich auf die Messung der humoralen Immunität bei Meerschweinchen.
- Der ELISpot-Assay bietet eine Möglichkeit, T-Zell-Antworten ohne Sektion zu bewerten.
- Diese Technik verbessert die Datenerhebung im Meerschweinchenmodell.
- Sie ist entscheidend für die Untersuchung von Krankheiten mit erheblicher Beteiligung der T-Zellen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Messung von T-Zell-Antworten bei Meerschweinchen.
- Verbesserung von Impfprotokollen im Meerschweinchenmodell.
- Verringern der Abhängigkeit von weniger aussagekräftigen Tiermodellen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von ELISpot-Assay-Platten mit Ethanol und PBS.
- Isolierung von PBMCs mittels Dichtegradientenzentrifugation.
- Inkubation mit Immobilisierungsantikörpern und Nachweisreagenzien.
- Sorgfältige Handhabung, um Kontaminationen zu vermeiden und die Zellviabilität sicherzustellen.
Hauptergebnisse
- Der Test misst erfolgreich T-Zell-Antworten bei Meerschweinchen.
- Bessere Definition und weniger unspezifische Flecken in den Ergebnissen.
- Ermöglicht die Untersuchung der T-Zell-Dynamik während Infektionen und Impfungen.
- Erleichtert die Forschung zu Krankheiten wie Tuberkulose, Ebola und HSV.
Schlussfolgerungen
- Der ELISpot-Test ist ein wertvolles Werkzeug für immunologische Studien an Meerschweinchen.
- Er vertieft das Verständnis der T-Zell-Antworten bei Infektionskrankheiten.
- Diese Methode kann zu verbesserten Strategien in der Impfstoffentwicklung führen.
Häufig gestellte Fragen
Exemplarische Branchenrelevanz
Der Interferon-gamma-ELISpot-Test für PBMCs des Meerschweinchens schließt eine wichtige Lücke in der präklinischen Immunologie, indem er eine längsschnittliche Verfolgung von T-Zell-Antworten ohne Sektion ermöglicht. Diese Fähigkeit erhöht das Vorhersagevertrauen hinsichtlich Impfkandidaten, die auf intrazelluläre Erreger abzielen, und unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in der frühen Entdeckungsphase. Die Verwendung von peripherem Blut erleichtert die interdisziplinäre Zusammenarbeit und verringert die Abhängigkeit von weniger aussagekräftigen Tiermodellen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von vaccinespezifischen T-Zell-Antworten zur Validierung immunologischer Wirkmechanismen.
- Operationaler Wert: Liefert quantitative IFN-Gamma-Komponentenzählungen als funktionellen Endpunkt für die Zielinteraktion und Modulation von Signalwegen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch Korrelation der T-Zell-Größe und -Kinetik mit schützender Immunität in krankheitsrelevanten Modellen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt reproduzierbare, quantitative Daten aus PBMC-Isolaten, um die Standardisierung von Assays über verschiedene Impfstoffkandidaten hinweg zu unterstützen.
- Operationaler Wert: Macht terminale Blutentnahmen überflüssig und ermöglicht wiederholte Probenentnahmen von einzelnen Tieren für die kinetische Profilierung.
- Assay-Eignung: Liefert definierte Spot-Bildung mit reduziertem unspezifischem Hintergrund und verbessert so das Signal-Rausch-Verhältnis bei der Screening von Substanzen oder Antigenen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckungs- und präklinische Phase, indem sie die antigenspezifische Dynamik von T-Zellen während von Impfregimen misst.
- Krankheitsrelevanz: Direkt anwendbar auf Pathogene mit starker T-Zell-Abhängigkeit, einschließlich Tuberkulose, Ebola und HSV, wie im Protokoll beschrieben.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt die Priorisierung von Projekten, indem sie Impfstoffkonstrukte identifiziert, die eine starke zelluläre Immunität hervorrufen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich in die Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase ein und ermöglicht die Immunüberwachung nach der Identifizierung von Leitverbindungen und vor Wirksamkeitsprüfungen.
- Entdeckungsbiochemie Unterstützt die Hypothesenprüfung von T-Zell-Epitopen und der Zytokinpolarisation als Reaktion auf Impfantigene.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Ergebnisse zur Bewertung der Immunogenität unterschiedlicher Antigendesigns oder Applikationsplattformen.
- Analytik: Bietet Messungen der IFN-Gamma-Spot-bildenden Einheiten (SFU), die einen statistischen Vergleich der Immunantworten über verschiedene Zeitpunkte und Behandlungsgruppen hinweg ermöglichen.
- Translationale Forschung Verbindet frühes Immunprofilen mit präklinischer Wirksamkeit durch die Verfolgung antigenspezifischer T-Zell-Antworten in vivo.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert eine wiederverwendbare, auf PBMCs basierende Immunüberwachungsplattform, die in Impfstoffprogrammen für infektiöse Krankheiten und Onkologie anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem funktionelle, antigenspezifische T-Zell-Daten aus einem physiologisch relevanten Modell bereitgestellt werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Platten-Vorbehandlung, PBMC-Isolierung und Nachweisschritte, die die Variabilität minimieren.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitalnutzungseffizienz, indem der Tierversuchseinsatz reduziert und die Datenerhebung an denselben Versuchspersonen zu mehreren Zeitpunkten ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Impfstoffkandidaten basierend auf zellulären Immunogenitätsprofilen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Immunologie, Zellisolierung und aseptischer Technik, um die Vitalität der PBMCs und die Integrität des Assays zu gewährleisten.
- Setzt den Zugang zu ELISpot-Plattenlesern, Inkubatoren, Zentrifugen sowie Reagenzien wie anti-Meerschweinchen-IFN-gamma-Antikörpern und BCIP/NBT-Substrat voraus.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen den Teams hinsichtlich der Zeitpunkte der Blutverarbeitung, des Zellwaschens und der Stimulationsbedingungen, um die Vergleichbarkeit der Daten sicherzustellen.
- Muss bei der Anpassung des Assays an andere Nagetier- oder nichtmenschliche Primatenmodelle die artenspezifische Validierung der Reagenzien berücksichtigen.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Notwendigkeit einer zeitnahen Blutverarbeitung zur Erhaltung der Zellfunktion sowie die Anforderungen an den Umgang mit Biohazard-Materialien wie menschlichem oder tierischem Blut und alkalischer Phosphatase-Substraten.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
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Title
0:58
Preparation of ELISpot-plates and Cell-stimulation
2:09
Blood Sample Processing
3:44
Plate Preparation and Cell-plating
4:47
Detection of Interferon-gamma Positive Spots
6:34
Results: ELISpot Assay Used to Characterize T-cell Responses in Guinea Pigs
7:15
Conclusion
