Name: Erkennung von Tilapia See Virus mit konventionellen RT-PCR und SYBR Green RT-qPCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Erfahren Sie die RT-PCR-basierte Detektion von Tilapia Lake Virus in Fischgeweben. Dieses Protokoll zeigt RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und quantitative PCR zur zuverlässigen Viruserkennung in der Aquakultur.

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Wir sind dankbar, das Institut für Veterinär Bakteriologie, Vetsuisse-Fakultät, Universität Bern für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Komitee für akademische Förderung des wissenschaftlichen Nachwuchses und der Gleichstellung der Geschlechter an der Vetsuisse-Fakultät, Universität Bern von 120 % Finanzierung Modell finanziert an PN vergeben. WS und PR werden vom Center for Advanced Studies unterstützt für Landwirtschaft und Nahrungsmittel, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand unter der Hochschulbildung Forschungsförderung und nationale Forschung Universität Projekt von Thailand, Büro der Hochschulbildung Kommission, Bildungsministerium, Thailand. Wir möchten danken Dr. Kwanrawee Sirikanchana für ihre Erzählung und Piyawatchara Sikarin für die Videobearbeitung.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

TiLV wurde erstmals im Jahr 2014 in Israel14 gemeldet und seitdem wurde es in mehreren Ländern, darunter Ägypten, Kolumbien, Indien, Malaysia, Uganda, Tansania und Thailand15,16,18, identifiziert 35 , 48. globales Bewusstsein, insbesondere in Tilapia produzierenden Ländern mehr Aufmerksamkeit auf das Virus und verschiedene Einschränkungen und Kontrollmaßnahmen von Regierungsbehörden haben versucht, die Ausbreitung von TiLV umgesetzt worden. Hier wurde ein detailliertes Protokoll zur TiLV Erkennung im Tilapia Gewebe, für Musterkollektion, RNA-Isolierung, cDNA Synthese, PCR und qPCR Assays erläutert. Es gibt verschiedene Aspekte dieser Methoden, die eine spezifische Diskussion zu rechtfertigen. TiLV wurde in Fisch überspannt eine Vielzahl Größen9,12,14,15,49 und Arten von Tilapia bisher einschließlich gezüchteten Hybriden Tilapia (O. identifiziert Niloticus x O. Aureus)11,14, Nil Tilapia (O. Niloticus)9,10,14,15,16, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 und roter Tilapia (Oreochromis SP.()16,33,48,51, wie auch in wilden Nile Tilapia9,12, schwarz Tilapia51, T. Zilli14,15, S. Galilaeus, O. Aureus und T. Simonis Intermedia14 und vor kurzem TiLV wurde in Wildkarpfen (Barbonymus identifiziert Schwanenfeldii)52. Gewebeproben von inneren Organen (Kieme, Milz, Leber, Herz, Kopf Niere) oder Schleim37 können von gesunden sowie sterbenden Tilapia unabhängig von Alter, Größe oder Art gesammelt und zur RNA-Isolierung verarbeitet werden. Das Gesamt RNA Extraktion Protokoll beschriebenen verwendet hier eine monophasische Lösung von Phenol und Guanidinium-Thiocyanat, die ein chaotropen denaturierenden Agent ist. Die Gewebe werden direkt in dieser Lösung gefolgt von dem Zusatz von Chloroform und Zentrifugation Phasentrennung zu erreichen, wobei eine klare RNA mit oberen wässrigen Phase, eine Interphase und eine geringere organische Phase erzeugt wird, homogenisiert. Die RNA ist isoliert von der wässrigen Phase durch Isopropanol-Fällung, gefolgt von der wiederhergestellten RNA get rid of Verschmutzungen waschen. Isolierung der RNA durch diese Methodik wurde Pionierarbeit von Piotr Chomczynski und Nicoletta Sacchi und wurde als Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform Extraktion53,54bezeichnet. Diese Art von Reagenz für die RNA-Extraktion verwendet im Handel gekauft werden oder im Labor gemacht (siehe die Tabelle der Materialien für weitere Informationen). Dieses Protokoll dauert etwas länger als das Spalte-basierte Methoden wie die Silica-basierten Reinigung, aber im Allgemeinen es ist kostengünstiger und ergibt mehr RNA.
In diesem Protokoll Quantifizierung der RNA mit A260 Werten wurde skizziert, wobei Spektralphotometrie Werte RNS-Qualität zeigen können (A260/A280 = 1,9-2,1). Während diese Methode einen guten Indikator für Probe Reinheit geben wird, kann nicht es absolut über die Qualität der extrahierten RNA informieren. Um richtig festzustellen, ob die RNA intakt oder teilweise abgebaut ist, können Proben Trennung durch Agarose-Gelelektrophorese wobei Verschmieren der die EtBr 18 gebeizt und 28 s rRNA zeigen RNA-Abbau. Weitere Überprüfung der RNS-Qualität zählen mit einem Lab-on-a-Chip-Instrument. Darüber hinaus ist es auch wichtig, die gereinigte RNA mit DNase verdauen ich verunreinigen entfernen host genomischen DNA, die abhängig von den nachgelagerten Anwendungen zu falschen Ergebnissen führen kann. Wenn Host gDNA RNS-Probe zu einem großen Teil noch verunreinigt ist, kann auch eine zusätzliche Behandlung der DNaseI am Ende des Verfahrens RNA-Extraktion durchgeführt werden (siehe Tabelle der Materialien).
Komplementären DNA-Synthese kann großen Einfluss auf das Gesamtergebnis qPCR und ist ein Aspekt der Methode, die Variation einführen kann. Die cDNA-Protokoll befürwortet hier besteht aus einer einzelnen Komponente-Aufstellung mit Oligo (dT) und somit nur transkribiert mRNAs mit PolyA Schwänzen. Es ermöglicht die Benutzer die Kontrolle der genau welche, die Komponenten zur Verwendung in der reversen Transkription Reaktion und diese Art der cDNA Synthese für TiLV Erkennung32bewährt hat. Eine Alternative zu diesem Set-up ist ein kommerziell gekauften Master-Mix enthält alle Komponenten für die reverse Transkription Reaktion und ist sehr schnell und einfach ohne die üblichen mehrstufigen, pipettieren und Multi-Temperatur-Protokoll. Dies ist vorteilhaft, weil es minimiert die Handhabung und fördert die Einheitlichkeit in allen Proben. Solche Meister-Mischungen enthalten häufig oligo(dT) und zufällige Primer, so dass es für verschiedene RNA-Vorlagen und repräsentative cDNA Kopien der Sequenzen aus der gesamten Länge des RNAs in einer Population zu generieren (virale und Tilapia mRNA hosten) und in der Theorie, jede gewünschte RNA-Spezies kann dann durch konventionelle PCR oder qPCR von solch einer Probe gemessen werden. Diese Vielseitigkeit ist der Hauptvorteil eines 2-Stufen-RT-PCR-Ansatzes; Freuen Sie sich auf einen langfristigen Pool, der für viele verschiedene Experimente verwendet werden kann. In den Ergebnissen ist ein One-Step RT-PCR-Ansatz vertreten wobei Sequenz spezifische Primer (Tabelle 1) dienten und die RT und PCR wurden in eine Röhre durchgeführt (siehe Materialliste). In der Regel spezifische Primer Sequenz ermöglichen eine höhere Effizienz der RT der zielgruppenspezifischen RNA als zufällige Grundierung zu verwenden, aber das bestimmte Ziel-RNA ist die einzige, die in solch einer cDNA-Probe quantifiziert werden kann, die das einzige Ziel von bestimmten Laboratorien sein können (siehe Tabelle der Materialien für Produktvorschläge cDNA Synthese).
Während konventionelle RT-PCR erscheint häufig verwendet werden bisher in der TiLV Diagnose9,13,14,15,16,17,18, 33 , 35 , 48 , 55. RT-qPCR hat gezeigt, dass ein leistungsfähigeres Tool für die Erkennung und Quantifizierung von geringen Mengen an TiLV in Fisch Geweben oder Schleim32,37sein. Im Allgemeinen ist qPCR in klinische Virologie Diagnostiklabors aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit, Spezifität, gute Reproduzierbarkeit, Dynamikbereich und Geschwindigkeit21verbreitet. Während qPCR zunächst teurer als bei herkömmlichen RT-PCR kann, bietet es viele wichtige Vorteile gegenüber konventionellen PCR; Es hat eine schnellere Turnaround-Zeit von Probe zu Ergebnissen und Post-PCR-Schritte ist nicht erforderlich. Dieser letzte Punkt bedeutet, dass es minimales Risiko für Labor-Kontamination gibt und es sich leichter anpassen Hochdurchsatz-Situationen wie z. B. bei Ausbrüchen lässt. Darüber hinaus ist es von Natur aus empfindlicher als herkömmliche RT-PCR, die von entscheidender Bedeutung für niedrige Viruslast in subklinische Infektionen21zu erkennen ist. Dies würde einen verschachtelten PCR-Ansatz erfordert reverse Transkription, zwei weitere PCR-Reaktionen und Analyse von Agarose-gel-Elektrophorese. Diese viele Schritte nehmen viel Zeit und erhöhen die Chancen auf Fehler oder Kontamination. Dennoch aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit verlangt RT-qPCR sorgfältige experimentelles Design und ein gründliches Verständnis der Quantifizierung Techniken zur Erzeugung von präzise Ergebnisse56,57.
Die DNA-Bindung Fluorophor, SYBR Green nachgewiesen in diesem Protokoll. Es ist ein DsDNA unspezifischen DNA bindenden Farbstoff und die Spezifität des Assays liegt somit vollständig in das Set der Zündkapseln, die Fehlalarme58erzeugen kann. Daher, während die DsDNA schmelzen Kurvenanalyse am Ende von jedem PCR durchgeführt ein besonders wichtiger Bestandteil der PCR-Reaktion ist, denn es, dass nur eine PCR Amplifikate der richtige T bestätigtm entsteht (sollte auch dies durch Gel Elektrophorese, wenn neue Assays umgesetzt werden). Tm eines DNA-Fragments ist abhängig von einer Vielzahl von Funktionen wie Länge, GC Zusammensetzung, Sequenz, Strang Komplementarität, Konzentration sowie auf Puffer-Komponenten und PCR-Enhancer. Die schmelzenden Kurve Analysen in die repräsentativen Ergebnisse von zwei Labors ergab das Vorhandensein von Primer-Dimere oder andere unerwünschte PCR-Produkte, aber wenn dies mit anderen Proben und/oder Versuchsanordnungen beobachtet wird, dann sollte der Test sein neu optimiert. Erweiterte qPCR Technologien erfordern keine solchen schmelzenden Kurve Schritt und in der Tat, da diese Methoden, wie Papier geschrieben wurde, eine TaqMan basierend TiLV RT-qPCR entwickelt wurde unter Verwendung zwei Zündkapseln und einer Sonde, so dass es sehr spezifische TiLV34.
Zweifellos die Primer entwickelt für RT-qPCR-Assays sind grundlegend für den Erfolg des Tests und die Primer hier wurden entwickelt, basiert auf öffentlich zugänglichen TiLV genomischen Daten zur Zeit32. Allerdings RNA-Viren sind bekannt für hohe Mutationsraten aufweisen und mögliche Belastungen werden die aktuellen diagnostischen Tests zu entkommen, da für ISAV59beobachtet wurde. Werden immer schwierig für solche Virustypen generieren eine universelle Pfanne-TiLV RT-qPCR-Assay und solche Tests nur kontinuierlich verbessert werden wenn mehr TiLV Genomdaten von weitreichenden Orte und Zeiträume zur Verfügung stehen.
Schließlich ist es wichtig, doppelte laufen oder wenn möglich, dreifacher Reaktionen in beide Intra und inter qPCR-Assays. Wenn die C-t -Werte sehr hoch sind, ist die Verwendung von Wiederholungen besonders wichtig festzustellen, dass die PCR-Reaktion zuverlässig und reproduzierbar ist. Im Allgemeinen wenn Daten replizieren Reaktionen variiert mehr als 0,5 Zyklen, die Reaktionen sollte wiederholt werden und wenn die C-t -Werte konsequent > 0,5 Zyklen variieren repliziert, die Probe erneut optimiert werden sollte. Die Verwendung einer integrierten qPCR Pipettierroboter hilft ungemein mit diesem Thema, aber es ist ein Luxus-Werkzeug. Wie bei jedem Experiment sind die Aufnahme geeignete und angemessene Kontrollen von größter Bedeutung für die Entwicklung von robusten molekularer Assays, vor allem in diagnostischen Labors, wo solche Tests müssen akkreditiert sein. Kontrollen sollten positiv (positive TiLV Probe, TiLV Plasmid standard) und Negativkontrollen (NTC und -RT) Proben sowie die Erkennung von endogenen Tilapia-Housekeeping-Gene enthalten. Solche Kontrollen darf nicht unterschätzt werden und sollte in jeder Probe, die Qualität der einzelnen Schritte des Tests richtig zu verstehen und richtig interpretieren die Ergebnisse aufgenommen werden.

Die global-Kopf-Versorgung mit Fisch erreicht einen neuen Rekordwert von 20 kg im Jahr 2014 und das war aufgrund des kräftigen Wachstums in der Aquakultur. Aquakultur bleibt eine der am schnellsten wachsenden tierische Lebensmittel produzierenden Sektoren weltweit und ist der nur tierische Lebensmittel produzierenden Sektor, der schneller als die menschliche Bevölkerung1 wächst. Tilapiine Cichilds umfassen die zweitwichtigste Süßwasserfische weltweit mit einer weltweiten Gesamtproduktion von 6,4 Millionen Tonnen (MT) und einen geschätzten Wert von 9,8 Milliarden US-Dollar im Jahr 20152bewirtschaftet. Die Top-Ten-Produzenten von Tilapia sind China (1,78 MT), Indonesien (1.12 MT) und Ägypten (0,88 MT), gefolgt von Bangladesch, Vietnam, den Philippinen, Brasilien, Thailand, Kolumbien und Uganda2. Es wird erwartet, dass globale Tilapia Produktion rund 7,3 MT 20303. Tilapia sind solche eine wichtige globale Nahrungsquelle geworden, nicht nur weil sie eine preiswerte Quelle für Protein4 sondern auch weil sie leicht zu züchten in Kapazität unter einer Vielzahl von Wasser und Klima Bedingungen5,6. Vor ein paar Jahrzehnten glaubte man, dass gab es einige kommerziell bedeutenden Krankheiten bedrohen Tilapia Landwirtschaft aber das ist nicht mehr wahr. Eine aufstrebende Viruserkrankung namens Tilapia See Viruskrankheit (TiLVD) ist die erste jemals kritische Krankheit-Epidemie in Tilapia gefunden und die gesamte Branche ist gefährdet. Diese Krankheit hat gravierende sozio-ökonomischen Folgen und ist eine direkte Bedrohung auf die Ernährungssicherheit für Millionen von Menschen in Afrika7, Asien und Südamerika. Zum Jahresbeginn 2018 berichtet der Weltorganisation für Tiergesundheit (OIE), dass die ätiologische Agenten dieser Krankheit, TiLV, offiziell entdeckt worden waren, auf drei Kontinenten über acht Länder8 und da war dieser Erreger-Informationskarte Es aktualisiert wurden weitere Berichte des TiLV in Tansania, Uganda9, Indonesien10, Taiwan11 und Peru12. TiLV ist eine neuartige einsträngige RNA-Virus beschrieben, um eine Orthomyxo-ähnliche Viren sein, denn es eine Vielzahl von Eigenschaften erinnert an andere Orthomyoxoviruses wie Grippe oder infektiösen Lachsanämie Virus (ISAV)13 enthält. Es wurde zuerst in der Nachmahd von massiven Verlusten von wilden und gezüchteten Tilapia in den See von Galiläa, Israel14gekennzeichnet. Danach genannten ähnliche Ausbrüche von Krankheiten als Sommer-Sterblichkeit und die einmonatige Sterblichkeit-Syndrom mit TiLV Infektion assoziiert wurden im Nil Tilapia (Oreochromis Niloticus) in Ägypten15 und Nil und roten Hybrid Tilapia gemeldet (Oreochromis spp.) in Thailand16beziehungsweise. Erkennung von aquatischen tierischen Viren erfolgt historisch durch Wachstum und Isolierung von Viren in Zellkultur. Verschiedene Zelllinien wurden für die Ausbreitung und die Isolierung von TiLV einschließlich e-11 Zellen aus Snakehead Fisch (Ophiocephalus Striatus)17,18, OmB und TmB aus Oreochromis getestet Mossambicus18, und OnlB und OnlL aus Nil Tilapia (O. Niloticus)19. Während Virus Kultur den Vorteil hat, dass es Material für weitere Experimente bietet, hat es den Nachteil, dass es mindestens 4 bis 7 Tage erfordert, die Bildung von zytopathischen Effekte (CPE) zu beobachten und natürlich verschiedene piscine Viren, fitter sind replizieren kann weitergegeben werden und produzieren ähnliche CPE.
In den letzten Jahrzehnten gab es eine Abkehr von der traditionellen, oft zeitaufwändige diagnostische Methoden wie Zellkultur, Serologie und Antigennachweis und Ersatz mit schneller und empfindlicher Nukleinsäure-basierte Erkennung Tests20, 21. Dies wird deutlich durch die Tatsache, die viele qPCR-Assays für ISAV22,23, virale hämorrhagische Blutvergiftung Virus (VHSV)24 als wichtige diagnostische Methoden für eine Vielzahl von Viruserkrankungen in Wassertiere, wie z. B. entwickelt wurden ,25, Betanodavirus26,27 Lachsfische Alphavirus28, Fisch Iridovirus29, Anguillid Herpesvirus 1 (AngHV1)30und Lymphocystis Krankheit-Virus (LCDV)31 . Robuste Methoden für Diagnose und Erreger Überwachung sind dringend erforderlich, um die Verbreitung der TiLV zu verringern. Solche Methoden sollen frühzeitige Erkennung der Infektion, bevor klinische Symptome entwickeln und Erkennung von niedrigen Virus Lasten. Heute, verschiedene PCR-Protokolle einschließlich der RT-PCR14,32, nested RT-PCR18, halb-verschachtelte RT-PCR33und RT-qPCR32,34 für den Nachweis von TiLV entstanden im Gewebe der Fische. Ein Vergleich der RT-qPCR und Virus Isolation in anfälligen Zelllinien für die Erkennung der TiLV ergab, dass RT-qPCR 1.000 Mal empfindlicher als die Virus-Isolation-32. Obwohl jedes veröffentlichte PCR-Protokoll unterschiedliche Empfindlichkeit für den Nachweis von TiLV gemeldet hat, sind die meisten Tests sehr empfindlich mit der Nachweisgrenzen der viralen Kopien auf 7,5 Kopien33, 7 Kopien18 oder 2 Kopien32 pro Reaktion.
Diese Methoden Artikel soll erklären, im Detail, wie TiLV-Erkennung-Assays, beginnend mit Tilapia Gewebe Sammlung, total RNA-Extraktion, cDNA Synthese durchführen und dann TiLV spezifische PCR Assays basiert. Insbesondere wurden umfassende Protokolle von konventionellen RT-PCR und SYBR Green-basierte RT-qPCR Appell an eine Vielzahl von Wissenschaftlern mit dem Ziel, TiLV zu erkennen beschrieben. Erstere ist weniger empfindlich, aber ist in der Regel eine billigere Option Erkennung. Letzteres erfordert komplexere Infrastruktur wie eine quantitative PCR-Maschine und teurer Reagenzien, aber es hat die Vorteile der quantitativen, schnell und sehr empfindlich, was bedeutet, dass es für den Nachweis von TiLV im Sub klinisch verwendet werden kann infizierte Fische. Die RT-PCR und RT-qPCR Protokolle wurden in zwei verschiedenen Labors mit unterschiedlichen geographischen Isolaten von TiLV und die enthaltenen Ergebnisse Highlight die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit der hier beschriebenen Tests durchgeführt.

<table><tbody><tr><td>Gewebeentnahme</td><td></td><td></td><td>Schritt 1</td></tr><tr><td>Tricain-Methansulfonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Eine Alternative zu Nelkenöl.&nbsp; Schritt 1.1</td></tr><tr><td>RNAlater-Stabilisierungslösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; AM7020</td><td>Zur Lagerung von Geweben, wenn sie nicht sofort verarbeitet werden können Schritt 1.3</td></tr><tr><td>RNA-Extraktion</td><td></td><td></td><td>Schritt 2</td></tr><tr><td>TRIreagent</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td>Schritt 2.1</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>15596026</td><td>Schritt 2.1</td></tr><tr><td>GENEzol</td><td>Geneaid</td><td>GZR100</td><td>Schritt 2.1</td></tr><tr><td>Trisure</td><td>Bioline</td><td>BIO-38032</td><td>Schritt 2.1</td></tr><tr><td>Hausgemachte Lösung</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-</td><td>94,53 g/L (800 mM) Guanidinthiocyanat 30,45 g/L&nbsp; (400 mM) Ammoniumthiocyanat 8,20 g/L&nbsp; (100 mM) Natriumacetat 380 mL/L&nbsp; (38 % v/v) Phenol 50 mL/L (5 % v/v) Glycerin 1,0 g/l (0,1 % w/v) 8-Chinolol, pH 5,0 Bis zu 2 Jahre lagern bei 4oC Schritt 2.1</td></tr><tr><td>MagNA Lyser Green Beads</td><td>Roche</td><td>3358941001</td><td>Eine alternative Gewebehomogenisierungsmethode, die in Verbindung mit den unten beschriebenen Gewebelysemaschinen verwendet wird Schritt 2.2</td></tr><tr><td>Lysing Matrix D, 2 mL Röhrchen</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>116913050</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Schritt 2.3</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>RCI Labscan</td><td>AR1027E-G2.5L</td><td>Schritt 2.3</td></tr><tr><td>1-Brom-3-chlorpropan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9673</td><td>Eine weniger toxische Alternative zu Chloroform Stufe 2.3</td></tr><tr><td>Isopropanol (GC) > 99,8 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59300</td><td>Schritt 2.6</td></tr><tr><td>Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td><td>Merck KGaA (EMSURE)</td><td>1.09634.2500</td><td>Schritt 2.6</td></tr><tr><td>Glykogen, molekularbiologische Qualität (z.B. Sigma, Kat.-Nr. G1767)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)</td><td>R0551</td><td>Nützlicher Schritt, wenn das Ausgangsmaterial des Gewebes klein ist, um die RNA-Fällung zu maximieren optional</td></tr><tr><td>Ethanol (Reinheit (GC) &ge; 99,9 %</td><td>Sigma-Aldrich (EMD Millipore)</td><td>1.00983</td><td>Schritt 2.9</td></tr><tr><td>Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td><td>Merck (EMSURE)</td><td>1.00983.2500</td><td>Schritt 2.9</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Promega</td><td>P1193</td><td>Schritt 2.13</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Multicell</td><td>809-115-CL</td><td>Schritt 2.13</td></tr><tr><td>Ambion TURBO DNA-freies Kit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>AM1907</td><td>Kann am Ende des RNA-Extraktionsprotokolls durchgeführt werden optional</td></tr><tr><td>cDNA-Synthese</td><td></td><td></td><td>Step 4</td></tr><tr><td>Viva cDNA Synthesis Kit</td><td>Vivantis</td><td>cDSK01</td><td>Step 4.1 & 4.3</td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT MasterMix mit gDNA-Entferner</td><td>Toyobo</td><td>A1172K</td><td>Eine alternative Option&nbsp; siehe Diskussion</td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Kit</td><td>Toyobo</td><td>FSQ-101</td><td>Eine alternative Option&nbsp; siehe Diskussion</td></tr><tr><td>AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transkriptase&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>600107</td><td>Eine alternative Option&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR</td><td></td><td></td><td>Schritt 5</td></tr><tr><td>DNA-Polymerase-Systeme:</td><td></td><td></td><td>Schritt 5.2</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X) &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>14001012a</td><td>Schritt 5.2</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - GoTaq Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>Schritt 5.2</td></tr><tr><td>Getrennte Komponenten der PCR-Mischung:</td><td></td><td></td><td>Step 5.2</td></tr><tr><td>10mM dNTP Mix</td><td>Vivantis</td><td>NP2409</td><td>Step 5.2</td></tr><tr><td>25mM MgCl2</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific R0971</td><td>Step 5.2</td></tr><tr><td>10X Taq Puffer mit KCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00348114</td><td>Schritt 5.2</td></tr><tr><td>Taq-DNA-Polymerase</td><td>Vivantis</td><td>PL1202</td><td>Schritt 5.2</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - Verso 1-stufige RT-PCR ReddyMix mit ThermoPrime Taq</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AB1454</td><td>Einstufige RT-PCR am Beispiel in Abbildung 3B</td></tr><tr><td>Gel-Elektrophorese:</td><td></td><td></td><td>Zur Sichtbarkeit von PCR-Produkten aus den Schritten 5.1-5.4</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid-Lösung (10 mg/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17898</td><td>Schritt 5.5</td></tr><tr><td>Tris/Essigsäure/EDTA (TAE)-Puffer:</td><td></td><td></td><td>Schritt 5.5</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - Tris</td><td>Vivantis</td><td>PR0612-1KG</td><td>Stufe 5.5</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - Essigsäure (glazial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur)</td><td>Merck KGaA (EMSURE)</td><td>1.00063.2500</td><td>Schritt 5.5</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0729</td><td>Stufe 5.5</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Vivantis</td><td>PC0701-100G</td><td>Stufe 5.5</td></tr><tr><td>DNA-Leitern und Marker</td><td>Vivantis</td><td>NL1405</td><td>Stufe 5.5</td></tr><tr><td>DNA-Gelladefarbstoff (6X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Stufe 5.5</td></tr><tr><td>qPCR</td><td></td><td></td><td>Schritt 6</td></tr><tr><td>PowerUP SYBR Green Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>A25779</td> Am <td>Beispiel der Abbildungen 4-6B Schritt 6.2</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BIO-RAD</td><td>1725120</td> Am <td>Beispiel des Videos und in den Abbildungen 4-6A Schritt 6.2</td></tr><tr><td>Ausrüstung&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce Gewebeschleifer Stößel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1110</td><td>Protokoll 2</td></tr><tr><td>MagNA Lyser Instrument</td><td>Roche</td><td>3358976001</td><td>Eine alternative Gewebehomogenisierungsoption für Protokoll 2, die in Verbindung mit den oben beschriebenen Lysekügelchen verwendet werden Schritt 2.2</td></tr><tr><td>FastPrep-24 5G Homogenisator</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Gekühlte Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 5427R</td><td>Protokoll 2 Schritt&nbsp; 2.4, 2.7 & 2.10</td></tr><tr><td>Gekühlte Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 5418R</td><td></td></tr><tr><td>Heizbox</td><td>Labnet</td><td>AccuBlock Digital Dry Bath</td><td>Protocol 2 Schritt 2.13</td></tr><tr><td>Mikrovolumen-Spektralphotometer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>Nanodrop 2000</td><td>Protokoll 3 Schritt 3.1 - 3.4</td></tr><tr><td>PCR-Maschine</td><td>BIO-RAD</td><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Protokoll 5 Schritt 5.4</td></tr><tr><td>Stromversorgung</td><td>BIO-RAD</td><td>PowerPac HC</td><td>Protokoll 5 Schritt 5.5</td></tr><tr><td>Horizontale Gelelektrophorese</td><td>BIO-RAD</td><td>Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu</td><td>Protokoll 5 Schritt 5.5</td></tr><tr><td>Mini-Mikrozentrifuge</td><td>Corning</td><td>LSE 6766</td><td>Nützlich zum schnellen Schleudern von PCR-Reaktionsgefäßen in den Protokollen 4, 5 und 6 Schritt 6.5.1</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>LioFuge</td><td>LM-60</td><td>Schritt 6.5.1</td></tr><tr><td>qPCR-Maschine und Software</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7500 Schnelles Echtzeit-PCR-System mit 7500 Software v2.0</td><td>Protokoll 6 Schritt 6.6-6.8</td></tr><tr><td>qPCR-Maschine und Software</td><td>BIO-RAD</td><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System mit CFX Manager Software</td><td></td></tr><tr><td>General Materials&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mayo Schere</td><td></td><td></td><td>Stufe 1.1-1.2</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td>Stufe 1.1-1.2</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Rainin</td><td>Pipette-Lite XLS</td> Aerosolbarriere-Pipettenspitzen <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z333328, Z333336, Z333344</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreie 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erkennung von tilapia see virus mit konventionellen rt-pcr und sybr green rt-qpcr

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Das Ziel dieser Methode ist es, den schnellen, empfindlichen und spezifischen Nachweis von Tilapia See Virus (TiLV) in Tilapia Gewebe zu erleichtern. Dieses Protokoll kann im Rahmen der Überwachungsprogramme, Biosicherheitsmaßnahmen und in TiLV Grundlagenforschung Labors verwendet werden. Der Goldstandard der Virus-Diagnostik umfasst in der Regel gefolgt von ergänzenden Techniken wie Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur weiteren Überprüfung die Virusisolierung. Dies kann umständlich, zeitaufwendig und erfordert in der Regel Gewebeproben, die stark mit Virus infiziert. Die Verwendung von RT-quantitative (Q) PCR bei der Erkennung von Viren ist vorteilhaft wegen seiner quantitativen Natur, hohe Sensitivität, Spezifität, Skalierbarkeit und seiner schnellen Zeit zu führen. Hier basiert die gesamte Methode der PCR Ansätze für TiLV Erkennung beschrieben, von Tilapia Orgel strukturierendes, total Ribonukleinsäure (RNA) Extraktion mit einem Guanidium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Lösung, RNA-Quantifizierung, gefolgt von einer zweistufigen PCR wird Protokoll mit, ergänzende Desoxyribonukleinsäure (DNA) Synthese und Erkennung von TiLV durch konventionelle PCR oder quantitative Identifikation über qPCR mit SYBR grün färben ich. Konventionelle PCR Post-PCR-Schritten und wird einfach über das Vorhandensein des Virus zu informieren. Der zweite Ansatz für absolute Quantifizierung von TiLV bis auf weniger als 2 Kopien ermöglicht und somit eignet sich besonders für TiLV Diagnose in Sub-klinische Fälle. Eine detaillierte Beschreibung der beiden PCR-Ansätze, repräsentative Ergebnisse aus zwei Labors und eine gründliche Diskussion der kritischen Parameter beider wurden aufgenommen, um sicherzustellen, dass Forscher und Diagnostikern ihre geeignet und anwendbar finden Methode der TiLV-Erkennung.

Dieses Protokoll Diagnosen Tilapia See Virus (TiLV) in Tilapia Gewebe mit RT-PCR-Methoden. Die gesamte Methode ist von Gewebe Dissektion nach insgesamt RNA-Extraktion, gefolgt von cDNA Synthese und Erkennung von TiLV durch konventionelle PCR oder quantitative PCR mit DsDNA verbindlich einen Farbstoff Fluoreszenz Bindung beschrieben.

Erkennung von Tilapia See Virus mit konventionellen RT-PCR und SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Willkommen alle. Mein Name ist Win Surachetpong. Ich bin Assistenzprofessor für Veterinärmikrobiologie und Immunologie Fakultät für Veterinärmedizin an der Kasetstart University, Thailand.Ich und mein Team sind spezialisiert auf neu auftretende Viruserkrankung in Tilapia. Wir arbeiten jetzt an dem Tilapia-Seevirus, das eine hohe Sterblichkeit in Tilapia verursacht. Da Tilapia die zweitwichtigste Fischart ist, die Kultur weltweit ist, stellt sie Proteinquelle für eine Million Menschen und spielt eine wichtige Rolle für die Ernährungssicherheit.Der jüngste Ausbruch des Tilapia-Seevirus hat sozioökonomische Auswirkungen, die viele Wissenschaftler dazu veranlassten, eine Lösung für dieses Problem zu finden. Bisher brauchen wir eine sehr hochsensible, schnelle und genaue Methode, um das Virus zu erkennen. In diesem Video zeigen wir Ihnen Schritt für Schritt, um Tilapia-Seevirus im Fischgewebe zu erkennen, beginnend mit der Probenentnahme, der Probenpopulation und der Echtzeit-PCR-Analyse.Erstens, löslichdie Überdosierung von Stofföl in Wasser, um die Fische einzuschläfern. Legen Sie den toten Fisch auf ein Tablett, sterilisieren Sie das Gerät mit 95% Ethanol und verbrennen Sie dann mit einem Alkoholbrenner. Langsam den Fisch aus dem Unterbauch nach oben schneiden, um die Leber zu sammeln.Sammeln Sie einen Teil der Leber in ein 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr. Der erste Teil der RNA-Extraktion sollte in einer Laminar Flow Hood durchgeführt werden und Schutzausrüstung tragen. Fügen Sie einen Milliliter RNA-Extraktionsreagenz in die Röhre.Pulverisieren Sie die Leber mit einem Gewebestöße in homogen. 200 Mikroliter Chloroform in die Röhre geben. Dann vorsichtig mischen, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren.Drei Minuten bei Raumtemperatur beiseite stellen. Zentrifuge bei vier Grad Celsius bei 12 000 RCF für 15 Minuten. Sammeln Sie die Rohre vorsichtig aus der Zentrifuge.500 Mikroliter der farblosen oberen wässrigen Phase vorsichtig in ein neues Rohr übertragen. Fügen Sie ein Volumen Isopropanol in die Röhre. Erhitzen Sie bei minus 20 Grad Celsius für zwei Stunden oder bis über Nacht, um die RNA auszufällen.Zentrifugieren Sie die Lösung nach der Inkubation bei gleichem Zentrifugenzustand. Sammeln Sie die Rohre aus der Zentrifuge, dann entsorgen Sie den Überstand. Das RNA-Pellet kann durch den Pfeil als spitz gesehen werden.Fügen Sie einen Milliliter 75% Ethanol in die Röhre, um das RNA-Pellet zu waschen, und mehrmals invertieren. Zentrifuge bei vier Grad Celsius, bei 10 000 RCF für 15 Minuten. Sammeln Sie die Rohre aus der Zentrifuge, dann entsorgen Sie den Überstand.Ziehen Sie das übrig gebliebene Ethanol mit der Autopipette heraus und trocknen Sie bei Raumtemperatur fünf bis zehn Minuten. Fügen Sie 30 bis 60 Mikroliter RNase freies Wasser hinzu, das auf 55 bis 60 Grad Celsius vorgewärmt wird, um das RNA-Pellet zu sonlubilisieren. Verwenden Sie ein bis zwei Mikroliter RNA-Lösung, um die Konzentration mit einem Mikrovolumenspektrophotometer zu messen.Die Ergebnisse werden auf dem Bildschirm angezeigt. Verdünnen Sie die Konzentration auf 200 Nanogramm pro Mikroliter mit RNase-freiem Wasser. Führen Sie die cDNA-Synthese unter Verwendung der chemikalien- und wie folgt aufgeführten Chemikalien und Bedingungen durch.Verwenden Sie einen Thermocycler, um RNA in cDNA mit vorgeschlagenen Bedingungen umzuwandeln. Im Folgenden sind die Chemikalien und Bedingungen zur Bestimmung der TiLV-Last mit Echtzeit-PCR verwendet. Geben Sie sechs Milliliter des qPCR-Master-Mix in jede Durchstechflasche mit weißem qPCR-Streifenrohr.Anschließend werden vier Milliliter cDNA-Probe in den Brunnen geladen. In diesem Stadium muss in jedem einzelnen Brunnen eine neue Rohrspitze ausgetauscht werden, um eine Kontamination von Probe zu Probe zu vermeiden. Versiegeln Sie den qPCR-Streifen fest mit einer transparenten qPCR-Streifenkappe.Mischen Sie die Lösung vorsichtig, indem Sie an einer Spitze des Streifens flicken. Dann drehen Sie sich mit Mikrozentrifuge, um die gesamte Flüssigkeit am Boden der Gefäße zu sammeln. Verwenden Sie die zweistufige Bedingung, wie im Video gezeigt, wählen Sie den Brunnen in 96 Well-Platte, die Sie verwenden werden.Wählen Sie Cyber-Grün als Flora für Farbstoff. Wählen Sie unbekannt als Beispieltyp aus, und fügen Sie einen Namen in ein Beispielnamensfeld ein. Öffnen Sie den Deckel einer Echtzeit-PCR-Maschine und legen Sie den qPCR-Streifen in den zugewiesenen Brunnen.Schließen Sie dann den Deckel. Führen Sie das Gerät mit der ausgewählten Bedingung aus. Die Maschine startet und läuft, nachdem der Deckel die gewünschte Temperatur erreicht hat.Nach dem Ende der qPCR-Bedingungen wird die Verstärkungskurve angezeigt. Hier zeigt der Kurspfeil, wo der Schwellenwert zwischen der Exponentialphase und der linearen Phase abschneidet, was zu einem CT-Wert führt. Der CT-Wert wird dann in die Kopiernummer des Virusprotokolls extrapoliert, um eine Anzahl von Virusresten mithilfe der Standardkurve zu berechnen.Der Schmelzgipfel wird auch angezeigt, um festzustellen, ob das von qPCR entdeckte Virus tatsächlich TiLV ist, in dem die Schmelzspitzen im Allgemeinen zwischen 79,5 und 80,5 Grad Celsius liegen. Wir hoffen daher, dass diese Methode wichtige Instrumente für Landwirte und Organisationen auf der ganzen Welt sein wird, die möglicherweise eine Kontrolle durchführen und die Ausbreitung der TiLV-Infektion begrenzen müssen.

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Dieses Video demonstriert eine quantitative Methode zum Nachweis von Virusinfektionen mittels real-time reverse Transkriptions-PCR. Der reverse Transkriptionsschritt wandelt die RNA in cDNA um, die dann über PCR-Zyklen amplifiziert wird. Das Vorhandensein von viraler RNA in der Probe wird durch die Analyse der Amplifikations- und Dissoziationskurven der aus der PCR gewonnenen DNA bestätigt.

Quantitative reverse-Transkriptions-PCR in Echtzeit zur Diagnose von Virusinfektionen

Hier stellen wir ein Verfahren zur Quantifizierung von Enteroviren und Noroviren in Umwelt- und Trinkwassern mittels reverser Transkriptions-quantitativer PCR vor. Die mittlere Virusrückgewinnung aus dem Grundwasser mit diesem standardisierten Verfahren der EPA-Methode 1615 betrug 20 % für Polioviren und 30 % für murine Noroviren.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR

Aktuellen Multiplex Diagnostik Zika, Chikungunya und Dengue-Viren erfordern komplexe Probenvorbereitung und teure Instrumentierung, und sind in geringen Ressourcen Umgebungen geeignet zu erkennen. Wir zeigen eine Diagnose, mit denen Isotherme Verstärkung mit zielgruppenspezifischer Strang verschieblich Sonden zu erkennen und diese Viren mit hoher Sensitivität und Spezifität zu unterscheiden.

Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktion-Analyse kombiniert mit reversen Transkription (RT-qPCR) wurde weithin zur Messung der RNA-Virusinfektionen. Hier präsentieren wir Ihnen einen direkten RT-qPCR-Assay, erfordern keine RNA Reinigungsstufe, entwickelt für die Quantifizierung von mehreren RNA-Viren, einschließlich Dengue-Virus.

Messung der Dengue-Virus RNA im Kultur Überstand der infizierten Zellen durch Echtzeit-Quantitative Polymerase-Kettenreaktion

Wir präsentieren ein vollständiges Protokoll zur postmortalen Diagnose von Tiertollwut unter Feldbedingungen mit Hilfe eines schnellen immunchromatographischen diagnostischen Tests (RIDT), von der Probenahme der Hirnbiopsie bis zur endgültigen Interpretation. Wir beschreiben auch weitere Anwendungen mit dem Gerät für molekulare Analyse und virale Genotypisierung.

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographischer Diagnostischer Test für ressourcenbegrenzte Einstellungen mit weiteren molekularen Anwendungen

Wir präsentieren einen RT-LAMP-Test für den Nachweis von TiLV in Tilapia-Fischen mit einfachen Instrumenten über einen relativ kurzen Zeitraum im Vergleich zu herkömmlichen RT-PCR-Techniken. Dieses Protokoll kann dazu beitragen, die epidemische Ausbreitung von TiLVD, insbesondere in Entwicklungsländern, zu kontrollieren.

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay für die spezifische und schnelle Detektion von Tilapia Lake Virus

Hier stellen wir ein vollständiges Protokoll zur Standardisierung und Implementierung der Methode zum Nachweis des SARS-CoV-2-Virus in menschlichen Proben durch reverse Transkriptionsschleifen-vermittelte isotherme Amplifikation (RT-LAMP) zur Verfügung. Diese Methode, die innerhalb von 60 Minuten durchgeführt wird, kann kostengünstig und mit kostengünstigen Geräten an jedes Labor oder jeden Point-of-Care angepasst werden.

Nachweis des SARS-CoV-2-Virus durch reverse Transkriptionsschleifen-vermittelte isotherme Amplifikation

Wir präsentieren zwei sondenbasierte, einstufige RT-qPCR-Kits für gängige Atemwegsviren. Der erste Test ist für SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 und H3N2) und Influenza B. Die zweite ist für SARS-Cov-2 (N) und MERS (UpE und ORF1a). Diese Assays können in jedem spezialisierten Labor erfolgreich implementiert werden.

Entwicklung von Multiplex-Real-Time-RT-qPCR-Assays zum Nachweis von SARS-CoV-2, Influenza A/B und MERS-CoV

Eine Technik für Labor-Schätzung des Netto trophische Transfereffizienz von polychlorierten Biphenylen (PCB) Kongenere fischfressenden Fisch aus ihrer Beute wird vorgestellt. Anwendbarkeit der Laborergebnisse auf dem Gebiet maximieren, sollte die fischfressenden Fische Beutefische, die in der Regel im Feld gegessen werden zugeführt werden.

Labor Schätzung der Netto Trophic Transfereffizienz von PCB auf Seeforelle (<em&gt; Salvelinus namaycush</em&gt;) Von seiner Beute

See Eutrophierung ist eine Frage der Wasserqualität weltweit, so dass die Notwendigkeit zu erkennen und zu steuern Nährstoffquellen kritisch. Laborbestimmung von Phosphor-Freisetzungsraten aus Sedimentkernen ist ein wertvoller Ansatz für die Bestimmung der Rolle der internen Phosphorbelastung und Führungsmanagemententscheidungen.

Labor-Phosphor bestimmt Flux von Seesedimenten als Maß der internen Phosphorbelastung

Erfahren Sie die RT-PCR-basierte Detektion von Tilapia Lake Virus in Fischgeweben. Dieses Protokoll zeigt RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und quantitative PCR zur zuverlässigen Viruserkennung in der Aquakultur.

Erkennung von Tilapia See Virus mit konventionellen RT-PCR und SYBR Green RT-qPCR

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