Name: Immunofluoreszenz ermöglicht Höchstauflösung Bildgebung des FtsZ Ring in Cyanobacterium Prochlorococcus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Lernen Sie eine Photobleaching-Methode zur Reduktion von Autofluoreszenz in Cyanobakterien kombiniert mit STORM-Mikroskopie. Diese Technik ermöglicht dreidimensionale Superauflösungsbildgebung des FtsZ-Rings in Prochlorococcus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken für ihre technische Unterstützung und kommentiert das Manuskript Daiying Xu. Diese Studie stützt sich auf Zuschüsse aus der National Natural Science Foundation of China (Projektnummer 41476147) und der Forschung gewährt Rat von der Hong Kong Special Administrative Region, China (Projekt-Nummern 689813 und 16103414).

1. Probieren Sie Vorbereitung und Fixierung
<ol><li>1 mL axenic Prochlorococcus MED4 bis 5 mL des Meerwasser-basierte Pro99 mittlere12zu impfen. Wachsen Sie Prochlorococcus Kulturen bei 23 ° C unter dem Licht mit einer Intensität von 35 µmol Photonen/m2s. fünf Tage später, sammeln Sie 1 mL der Kultur in einer 1,5-mL-Tube. Hinweis: Fünf Tage nach der Inokulation, Prochlorococcus MED4 erreichen die späten Log-Phase mit etwa 108 Zellen/mL, die eignet sich für Sturm Bildgebung.</li>
	<li>Fügen Sie 100 µL frisch zubereitet aus 25 % Paraformaldehyd (PFA) (w/V) Formaldehyd und 2 µL 50 % Glutaraldehyd in der 1,5-mL-Tube, die Kultur zu beheben. Inkubieren Sie die Probe im Dunkeln bei Raumtemperatur für 20 min. Hinweis: Die Probe war im Dunkeln zur Fixierung gehalten weil Glutaraldehyd Licht empfindlich.</li>
	<li>Spin-down der Probe bei 13.500 X g für 1 min; dann entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Zellen in 100 µL der Pro99 mittlere12. Speichern Sie das Sample bei 4 ° C bis Immunostaining.</li>
</ol>(2) Anschwemmung des Deckglases mit Polystyrol-Kügelchen
Hinweis: Polystyrol Perlen gelten als die treuhändische Marker für Drift-Korrektur.
<ol><li>Wirbel der Original Fläschchen von Polystyrol-Kügelchen und bereiten eine Verdünnung von 1: 20.000 mit 50 % Ethanol als Gülle arbeiten.</li>
	<li>Schalten Sie die Herdplatte, stellen Sie die Temperatur auf 120 ° C und legen Sie Deckgläsern auf die heiße Platte.</li>
	<li>Laden Sie 100 µL arbeiten Gülle auf jeder Deckglas. Inkubieren Sie das Deckglas auf der Heizplatte für 10 min, und übertragen Sie dann sorgfältig die Deckgläsern, Petri-Schalen für die Lagerung bei Raumtemperatur. Hinweis: Sollte die Seite mit den Perlen befestigt, um es nach oben, und die Zellen sollten auf der gleichen Seite angebracht werden. Die Perlen sind auf den Deckgläsern immobilisiert und verwendet für die Korrektur der Probe-treiben in Echtzeit während der Sturm Bildgebung. Nach Immobilisierung der Perlen, können nicht die Deckgläsern geflammt.</li>
</ol>3. Beschichtung von Poly-L-Lysin auf der Wulst-beschichtete Deckglas
Hinweis: Dies geschieht für die Immobilisierung von Cyanobakterien Zellen.
<ol><li>Das Zentrum von dem Deckglas fügen Sie 100 µL der Poly-L-Lysin (1 mg/mL hinzu) mit der Wulst-beschichteten Seite nach oben. Lassen Sie es für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pipette, um sorgfältig streben die ungebundene Poly-L-Lysin und überträgt es auf eine 1,5-mL-Tube. Speichern Sie Poly-L-Lysin bei 4 ° C zur Wiederverwendung.</li>
	<li>Spülen Sie das Deckglas mit 10 mL Ultra-gefiltertes Wasser in einer 60 mm Petrischale und dann kurz trocknen Sie das Deckglas auf einem Papiertuch.</li>
	<li>Speichern Sie das Deckglas in eine Petrischale (100 mm) zur späteren Verwendung. Um die Anlage das Deckglas auf den Teller zu verhindern, säumen Sie die Petrischale mit einer Schicht aus Parafilm. Hinweis: Das Deckglas, vorbeschichteten mit Perlen und Poly-L-Lysin, kann für mindestens ein halbes Jahr bei Raumtemperatur gelagert werden. Daher wird dringend empfohlen, einen Stapel von Deckgläsern im Voraus vorbereiten.</li>
</ol>(4) Immobilisierung von Zellen auf das Deckglas
<ol><li>Übertragen Sie ein vorbeschichteten Deckglas auf eine neue Petrischale mit Parafilm an der Unterseite, die die Färbung Gericht fortan genannt wird. Laden Sie 100 µL der festen Probe auf dem Deckglas zu und lassen Sie es für 30 min um Zelle Anlage ermöglichen.</li>
	<li>Übertragen Sie das Deckglas zu einem Brunnen eine 12-Well-Platte, die die Wäsche-Schüssel fortan genannt wird. Fügen Sie 1 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl und 2,7 mM KCl, pH 7,4) zum Brunnen, um das Deckglas zu waschen. Entfernen Sie die PBS-Puffer zu und fügen Sie einen neuen PBS-Puffer um das Deckglas wieder waschen.</li>
</ol>5. Permeabilisierung der Cyanobakterien Zellen
<ol><li>Entfernen Sie die PBS-Puffer mit einer Pipette. Der Brunnen der Schale waschen, die 0,05 % nicht-ionische Waschmittel-100 (V/V), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8,0) und 0,2 mg/mL Lysozym enthält fügen Sie 1 mL frisch zubereitete Permeabilisierung Puffer hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Wäsche-Schüssel bei 37 ° C für 20 min. Entfernen Sie dann die Permeabilisierung Puffer.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL PBS-Puffer und einen Shaker, welcher sanft die Wasch-Schale schüttelt für 5 min. entfernen den PBS-Puffer setzen Sie waschen Schale auf. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 X das Deckglas zu waschen.</li>
</ol>6. Immunofluoreszenz des Chlorophylls Pigmente in einem Schritt blockieren
<ol><li>Übertragen Sie das Deckglas auf den befleckenden Gericht. Fügen Sie 50 µL blocking-Puffer, enthält 0,2 % (V/V) nichtionische Waschmittel-100 und 3 % (V/V) Ziegenserum, auf der Oberseite des Deckglases.</li>
	<li>Stelle das ganze Platte auf Eis Färbung und verschieben Sie es unter der Xenon-Lichtquelle für Immunofluoreszenz für mindestens 60 min, mit einer Lichtstärke bei 1.800 µmol Photonen/m2·s.</li>
	<li>Entfernen Sie nach Immunofluoreszenz und blockieren vorsichtig den blockierenden Puffer von am Rand von einem Papiertuch adsorbierenden. Hinweis: Die Intensität des Xenon-Lichts ist so hoch, dass ein paar richtige Sonnenbrille zum Schutz der Augen benötigt wird. Wickeln Sie unterdessen die Lichtquelle und die Platte mit Alu-Folie um zu vermeiden, das Austreten von Licht, die Augenschäden verursachen. Überprüfen Sie das Deckglas alle 15 min um sicherzustellen, dass das Deckglas feucht bleibt. Wenn das Deckglas trocken ist, fügen Sie 50 µL blocking-Puffer.</li>
</ol>7. die Antikörperbindung
<ol><li>Anti -Anabaena FtsZ Antikörper in 200 µL des Wassers entsprechend den Anweisungen des Herstellers zu lösen.</li>
	<li>Verdünnen Sie 1 µL Anti-FtsZ Antikörper in 99 µL blocking-Puffer. Fügen Sie 50 µL verdünnter Primärantikörper auf das Deckglas und bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie das Deckglas auf den Teller waschen. Fügen Sie 1 mL PBS-Puffer und legen Sie die Wäsche-Schüssel auf einen Shake. Schütteln Sie vorsichtig waschen Schale für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 X das Deckglas zu waschen.</li>
	<li>Übertragen Sie das Deckglas auf den befleckenden Gericht. Verdünnen Sie 1 µL eines sekundären Antikörpers in 500 µL blocking-Puffer. Fügen Sie 50 µL verdünnter Sekundärantikörper auf das Deckglas und 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie das Deckglas auf den Teller waschen. Waschen Sie es mit 1 mL PBS-Puffer in einen Shaker geben. Schütteln Sie vorsichtig waschen Schale für 5 min. wickeln die Wasch-Schale mit Aluminium Papier zu machen, lichtdicht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 X.</li>
	<li>Die gut fügen Sie 500 µL von Formaldehyd, frisch zubereitet aus 4 % Paraformaldehyd (PFA) (w/V hinzu). Inkubieren Sie das Deckglas für 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie das Formaldehyd und wiederholen Sie Waschschritt 3 X.</li>
	<li>Lagern Sie das Deckglas bis zur Bildgebung in PBS-Puffer bei 4 ° C im Dunkeln.</li>
</ol>8. Vorbereitung des Sturms Imaging-Puffer
<ol><li>Bereiten Sie 1 mL Puffer nach Tabelle 1, unmittelbar vor dem Sturm-Bildgebung imaging vor. Hinweis: Da die Haltbarkeit des Puffers bildgebenden ca. 2 h ist, bereiten Sie es frisch, direkt vor der Verwendung. Vermeiden Sie aufschütteln nach Zugabe von Glukose-Oxidase und Katalase. Achtung: Methyl-Viologen ist giftiges Material. Bitte gehen sie mit besonderer Sorgfalt. Cyclooctatetraene ist als Karzinogen der Katze eingestuft. 1 chemische. Bitte nicht einatmen und Hautkontakt und machen das Cyclooctatetraene Stammlösung und bildgebenden Puffer in einer chemischen Kapuze.</li>
</ol>9. Bild Erfassung von Sturm
<ol><li>Laden Sie das Deckglas in den Füllraum (Abbildung 1). Laden Sie die frisch zubereiteten bildgebenden Puffer sanft in die Kammer zu vermeiden, waschen Sie die Cyanobakterien Zellen. Legen Sie ein rechteckiges Deckglas auf der Oberseite der bildgebenden Puffer, seine Reaktion mit Sauerstoff in der Luft zu verhindern. Vermeiden Sie Trapping Luftblasen unter dem Deckglas.</li>
	<li>Schalten Sie die Kamera, das LED-Licht und Laser. Open-Sturm-Software für die Bildaufnahme, Schwerpunkt Positionsbestimmung und Probe driften Korrektur13.</li>
	<li>Tropfen Sie halb einen Immersionsöl auf der Linse. Die Kammer zu laden und darauf achten, dass die Linse des Objektivs nimmt Kontakt mit dem Deckglas.</li>
	<li>Untersuchen Sie das Signal mit einem 750-nm-Laser. Hinweis: Immer auch eine zweite Antikörper-Minus-Färbung Negativkontrolle um sicherzustellen, dass die Autofluoreszenz verringert wird.</li>
	<li>Identifizieren Sie einen Probe-Bereich, der Zellen und Kugelmarker enthält. Starten Sie die Software für Beispiel driften Korrektur. Hinweis: im allgemeinen Bereich ideale Beispiel 10-30 Zellen enthält. Unterdessen sollten die Zellen getrennt werden, auch um keine überlappenden Zellen zu vermeiden.</li>
	<li>Ein Weitfeld-Bild als Referenz zu erwerben, mit der Kamera Elektron Multiplikation (EM) gewinnen bei 300 und einer Belichtungszeit von 30 ms (Abbildung 2A).</li>
	<li>Erhöhen Sie die Laserstärke 750 nm Anregung zu einer höheren Macht, etwa 4,5 kW/cm2. Sobald die Fluorophore in ein spärlich blinkende Muster umgestellt wurden, erwerben Sie ein super-Auflösung durch das Sammeln von 10.000 Frames bei 33 Hz (Abb. 2 b). Hinweis: Wenn die Fluorophore nicht isoliert sind, warten Sie ein paar Minuten, bis weitere Fluorophore zu den dunklen Zustand geschaltet werden und die isolierte einzelne Moleküle sequenziell flackern. Die Anzahl der Frames, die hier beschriebenen eignet sich für unser Beispiel und für andere gezielte Strukturen optimiert werden muss.</li>
</ol>10. Umbau des Super-Resolution-Bilder aus den Rohdaten
<ol><li>Verwenden Sie eine Plugin namens QuickPALM (Table of Materials)14 in ImageJ, um ein 3-d-Höchstauflösung Farbbild zu rekonstruieren. Hinweis: Eine vorläufige chromatische Bild (Abbildung 2) zusammen mit einer farbcodierten Maßstabsleiste (Abbildung 2) erscheint. Die Farbe entspricht die Tiefe auf der z-Achse.</li>
	<li>Bilder mit z-Achse geschnitten um zu demonstrieren, die 3-d-Struktur in einem video, Konstrukt einen Stapel von Höchstauflösung alle 10 nm mit QuickPALM14. Stellen Sie die Helligkeit der Stapel und duplizieren Sie die Stapel von einer Zielzelle zu. Verwenden Sie eine Plugin namens 3D Viewer (Table of Materials)15 in ImageJ, um 3-d-Bild der Zelle zu erzeugen. Notieren Sie die Drehung der 3-d-Struktur zu Demonstrationszwecken.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+barrier%3A+Super-resolution+imaging+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells.</a> Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Wave+of+Cellular+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A New Wave of Cellular Imaging.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).</li>
<li>Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+Microscopy+in+Plant+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging.</a> Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).</li>
<li>Schubert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+Microscopy+-+Applications+in+Plant+Cell+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 531(2017).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Superresolution+Imaging+of+the+FtsZ+Ring+during+Cell+Division+of+the+Cyanobacterium+Prochlorococcus%5BTitle%5D)+AND+%22mbio%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus.</a> mbio. 8 (6), e00657(2017).</li>
<li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division%3A+assembly%2C+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).</li>
<li>Boer, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+E.+coli+cell+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding E. coli cell fission.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).</li>
<li>Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="https://aslopubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.4319/lo.2002.47.4.0989">Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus.</a> Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).</li>
<li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user-friendly+two-color+super-resolution+localization+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">A user-friendly two-color super-resolution localization microscope.</a> Optics Express. 23 (2), 1879(2015).</li>
<li>Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuickPALM%3A+3D+real-time+photoactivation+nanoscopy+image+processing+in+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ.</a> Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).</li>
<li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274(2010).</li>
<li>Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+photosynthesis+in+the+oceans%3A+The+origins+and+significance+of+divergent+light-harvesting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies.</a> Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).</li>
<li>Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prochlorococcus%3A+The+structure+and+function+of+collective+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).</li>
<li>Morel, A., Ahn, Y. -H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. <a target="_blank" href="https://www.ingentaconnect.com/content/jmr/jmr/1993/00000051/00000003/art00008">Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation.</a> Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).</li>
<li>Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+3D+super-resolution+microscopy+reveals+Caulobacter+crescentusin+vivo+Z-ring+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).</li>
<li>Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+multiple+biomarkers+in+captured+rare+cells+by+sequential+immunostaining+and+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching.</a> Methods. 64 (2), 108-113 (2013).</li>
<li>Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+photobleaching+necessary+for+Raman+imaging+of+bone+tissue+using+a+green+laser%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).</li>
<li>Haxo, F. T., Blinks, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic+Action+Spectra+of+Marine+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae.</a> The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).</li>
<li>Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycoerythrocyanin+and+Phycoerythrin%3A+Properties+and+Occurrence+in+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria.</a> Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Protokoll beschrieben wir ein Verfahren um die Autofluoreszenz des Cyanobacterium Prochlorococcus (Abbildung 3) deutlich zu reduzieren und dann Immunostain der Proteine in den Zellen, die ermöglicht, Sturm um die 3-d-FtsZ studieren nutzen Ring-Morphologien in Prochlorococcus (Abbildung 4). Dieses Protokoll könnte für Super-Resolution Imaging in anderen photosynthetischen Organismen verabschiedet werden.
Frü...

Super-Resolution Microscopies können brechen die Beugungsgrenze des Lichts und Bilder innerhalb Sub Beugung Auflösungen (< 200 nm). Sie haben in vielen Organismen verbreitet, um Protein-Lokalisierung und subzelluläre Strukturen zu studieren. Großen Höchstauflösung Mikroskopieverfahren umfassen strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM), stimulierte Emission Depletion Mikroskopie (STED), Sturm und photoaktiviert Lokalisierung Mikroskopie (PALM). Die Mechanismen und Anwendungen diese Super-Resolution Mikroskope wurden überprüft an anderer Stelle1,2.
Sturm erreichen eine Auflösung bis zu 10 nm durch räumliche Trennung3,4. Für Sturm nur ein Molekül in einer Beugung begrenzte Region ("on") aktiviert ist und der Rest der Moleküle sind inaktivierte ("off") gehalten. Durch eine Anhäufung der schnellen ein- und - Ausschalten einzelner Moleküle kann ein "Beugung-unlimited" Bild generierten3sein. Inzwischen sind viele Arten von organischen Farbstoffen und fluoreszierende Proteine anwendbar im Sturm, so dass ein einfaches Upgrade von regelmäßigen Fluoreszenzmikroskopie hochauflösender Mikroskopie5,6.
Sturm ist nicht weit in den photosynthetischen Zellen, wie z. B. Cyanobakterien, Algen, angewendet und pflanzlichen Zellen mit Chloroplasten7,8, die aufgrund der Tatsache, dass Sturm ist erfordert hohe Laserintensität auf Laufwerk Photoswitching. Hochintensive Laser ungünstig reizt stark Autofluoreszenz Hintergrund in photosynthetischen Zellen und stört die Einzelmolekül-Lokalisierung in der Sturm-Bildgebung. Um mit Sturm der subzellulären Strukturen oder Protein-Interaktionen in photosynthetischen Zellen untersuchen, entwickelten wir ein Immunofluoreszenz-Protokoll, um den Hintergrund Autofluoreszenz Signale9zu stillen. In eine Routine immunofluorescent Färbeverfahren sind Exemplare weißes Licht von hoher Intensität während der Blockierungsschritt ausgesetzt, die die Autofluoreszenz des photosynthetischen Zellen zu den Anforderungen für Sturm senkt. So, dieses Protokoll macht es möglich, pigmentierte Organismen mit Sturm zu untersuchen.
Hier beschreiben wir das Protokoll Sturm zu verwenden, um die FtsZ Ring-Organisation in der einzelligen Picocyanobacterium ProchlorococcusBild. FtsZ ist ein hoch konservierte Tubulin-ähnliche Zellskelett Protein die polymerisiert um eine Ringstruktur (Z-Ring) um den Umfang einer Zelle10 zu bilden und ist wichtig für die Zellteilung11. Erhalten Prochlorococcus Zellen sind die ersten Photobleached zur Verringerung der Autofluorescent Hintergrund und Immunostained mit einem primären Anti-FtsZ Antikörper, und dann eine Sekundärantikörper Anti-Kaninchen-IgG (H + L) ist mit einem Fluorophor konjugiert (z.B. , Alexa Fluor 750). Schließlich wird Sturm verwendet, um die detaillierte FtsZ Ring Organisationen in Prochlorococcus in verschiedenen Zellzyklus Phasen zu beobachten.

<table><tbody><tr><td>Polystyrol-Partikel</td><td>Spherotech</td><td>PP-20-10</td><td>2.0-2.4 &micro; m</td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Marienfeld</td><td>0111580</td><td>18 mm & leer, Dicke Nr. 1</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Scharlau</td><td>ET00021000</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysinhydrobromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9155</td><td>mol wt 70.000-150.000</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehydlösung, 50%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Dinatriumsalz, 2-Hydrat</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>E-210-500</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Anti- Anabaena FtsZ-Antikörper</td><td>Agrisera</td><td>AS07217</td><td></td></tr><tr><td>Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A-21039</td>, <td>konjugiert mit Alexa Fluor 750</td></tr><tr><td>D-Glucose wasserfrei</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Viologen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>856177</tr><tr><td>Cyclooctatetraen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Glukoseoxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>XD-300 Xenon-Lichtquelle</td><td></td><td></td><td>250 W</td></tr><tr><td>STORM Mikroskop</td><td>NBI</td><td>SRiS Mikroskop</td><td></td></tr><tr><td>Rohdea</td><td>NBI</td><td>SRiS 3.0</td><td>Software für die Bildaufnahme</td></tr><tr><td>Luna</td><td>NBI</td><td>SRiS 3.0</td><td>Software für die Driftkorrektur</td></tr><tr><td>QuickPALM</td><td></td><td></td><td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td></tr><tr><td>3D Viewer</td><td></td><td></td><td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home</td></tr></tbody></table>

immunofluoreszenz ermöglicht höchstauflösung bildgebung des ftsz ring in cyanobacterium prochlorococcus

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Höchstauflösung Mikroskopie hat am meisten benutzt, um Protein-Interaktionen und subzelluläre Strukturen in vielen Organismen zu studieren. In photosynthetischen Organismen ist die laterale Auflösung des Super-Auflösung jedoch nur ~ 100 nm. Die geringe Auflösung ist vor allem aufgrund des hohen Autofluoreszenz Hintergrundes der photosynthetischen Zellen verursacht durch hochintensive Laser, die für die Super-Resolution Imaging, wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm) erforderlich sind. Hier beschreiben wir eine Immunofluoreszenz-gestützte Sturm Methode, die entwickelt wurde vor kurzem für die marine Picocyanobacterium Prochlorococcusimaging. Nach Immunofluoreszenz, die Autofluoreszenz Prochlorococcus wird effektiv reduziert, sodass dieser Sturm mit einer lateralen Auflösung von ~ 10 erfolgen kann nm. Mit dieser Methode wir die Organisation in Vivo dreidimensionale (3D), der das Protein FtsZ erwerben und vier verschiedene FtsZ Ring Morphologien während des Zellzyklus Prochlorococcuscharakterisieren. Die Methode, die wir hier beschreiben könnte für die Super-Resolution Imaging anderer photosynthetischen Organismen verabschiedet werden.

Sturm erreicht Höchstauflösung Bildgebung durch Aktivierung einzelner photoschaltbare Fluorophore stochastisch. Die Position des jeden Fluorophor aufgezeichnet und ein super-Resolution-Bild wird dann basierend auf diesen Standorten4konstruiert. Daher ist die Genauigkeit des Standortes Fluorophor wichtig für die Höchstauflösung Bildrekonstruktion. Die Absorptionsspektren von Prochlorococcus peak bei 447 nm und 680 nm,und Prochlorococcus hat eine mi...

Hier beschreiben wir eine Immunofluoreszenz-Methode, um die Autofluoreszenz der Cyanobakterien zu reduzieren. Nach Immunofluoreszenz wird stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie verwendet, um dreidimensionale Höchstauflösung Bilder der Cyanobakterien FtsZ Ring zu erhalten.

Immunofluoreszenz ermöglicht Höchstauflösung Bildgebung des FtsZ Ring in Cyanobacterium Prochlorococcus

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Proteinlokalisierung und der Dynamik in photosynthetischen Organismen zu beantworten. Durch die Kombination der Photobleichmethode mit dem hochauflösenden Mikroskop sind wir in der Lage, die Proteindynamik von photosynthetischen Organismen in einem bemerkenswerten Detail zu erkennen. Diese Methode gibt nicht nur Einblick in die Proteindynamik von Prochlorococcus.Es kann auch auf viele andere Organismen angewendet werden, die Radio-Re-Dop-Sing und Bacteriochlorophyll enthalten. Demonstriert wird dieses Verfahren von Yanxin Liu, einem Doktoranden aus meinem Labor. Zunächst fügen Sie fünf Milliliter Pro99-Medium auf Seewasserbasis zu einem Kulturkolben hinzu und impfen Sie ihn mit einem Milliliter Prochlorococcus MED4.Wachsen Sie die Prochlorococcus bei 23 Grad Celsius unter einem Licht mit einer Intensität von 35 Mikromol-Photonen pro Quadratmeter. Nach fünf Tagen einen Milliliter der Kultur in eine 1,5-Milliliter-Röhre sammeln. Fügen Sie 100 Mikroliter frisch zubereitetes Formaldehyd in die Röhre, um die Kultur zu fixieren.Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Drehen Sie dann die Probe bei 13, 500 mal G für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter Pro99 Medium wieder aus.Bewahren Sie die Probe bei vier Grad Celsius im Dunkeln auf, bis sie bereit ist, eine Immunfärbung durchzuführen. Zuerst wirbeln die Durchstechflasche mit Polystyrolperlen. Mit 50% Ethanol eine Ein-zu-20.000 Verdünnung als Arbeitsschlämme zubereiten.Schalten Sie die Kochplatte ein und stellen Sie die Temperatur auf 120 Grad Celsius ein. Als nächstes legen Sie die Deckel auf die Kochplatte. 100 Mikroliter der Arbeitsschlämme auf jeden Deckelschlupf laden und 10 Minuten lang die Deckel auf die Kochplatte inkubieren.Dann die Abdeckungen vorsichtig auf Petri-Schalen Perlenseite nach oben für die Lagerung bei Raumtemperatur übertragen. Wenn Sie bereit sind, die Abdeckungen zu beschichten, rufen Sie eine ab, um sicherzustellen, dass sie perlenseitig nach oben ist. Fügen Sie 100 Mikroliter einer Poly-L-Lysin-Lösung mit einem Milligramm pro Milliliter in die Mitte des Deckels und lassen Sie ihn 30 Minuten bei Raumtemperatur sitzen.Danach verwenden Sie eine Pipette, um unbefestigtes Poly-L-Lysin sorgfältig zu saugen und in ein 1,5-Milliliter-Rohr zu übertragen. Bewahren Sie dieses Poly-L-Lysin bei vier Grad Celsius für die spätere Verwendung auf. Spülen Sie den Deckelrutsch mit 10 Milliliterultralitern ultragefiltertem Wasser in einer 60-Millimeter-Petrischale und trocknen Sie ihn dann kurz mit einem Papiertuch.Übertragen Sie den beschichteten Deckel auf eine neue Petrischale mit Parafilm an der Unterseite, die als Färbeschale verwendet wird. 100 Mikroliter der festen Probe auf den Deckelschlupf laden und 30 Minuten sitzen lassen, um eine Zellbefestigung zu ermöglichen. Als nächstes verwenden Sie ein Papiertuch, um die restliche Lösung zu absorbieren und dann den Deckelinin in eine 12-Well-Platte zum Waschen auf einen Brunnen zu übertragen.Fügen Sie einen Milliliter PBS-Puffer in den Brunnen, um den Deckelzuschlag zu waschen. Entfernen Sie dann die PBS und fügen Sie einen Milliliter frische PBS, um den Deckel ein zweites Mal zu waschen. Verwenden Sie eine Pipette, um die PBS zu entfernen und ersetzen Sie sie durch einen Milliliter frisch zubereiteten Permeabilisationspuffer.Die Waschschale bei 37 Grad Celsius 20 Minuten bebrüten. Entfernen Sie dann den Permeabilisierungspuffer. Beginnen Sie den Waschvorgang, indem Sie einen Milliliter frischen PBS-Puffer hinzufügen.Legen Sie die Waschschale auf einen Shaker, um die Schale für fünf Minuten sanft zu rühren. Entfernen Sie danach die PBS und wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal. Den gewaschenen Deckelaufschub in die Färbeschale geben.Fügen Sie 50 Mikroliter Sperrpuffer oben auf dem Coverslip hinzu. Legen Sie die gesamte Färbeschale auf Eis und bewegen Sie sie dann mindestens 60 Minuten unter die Xenon-Lichtquelle zum Photobleichen. Nach dem Photobleichen und Blockieren verwenden Sie den Rand eines Papiertuchs, um den Sperrpuffer zu entfernen.Verdünnen Sie zunächst einen Mikroliter Anti-FtsZ-Antikörper in 99 Mikroliter Blockierpuffer. 50 Mikroliter des verdünnten Primärantikörpers auf den Deckelschlupf legen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Übertragen Sie den Deckelaufschlag auf einen Brunnen der Waschschüssel.Um mit dem Waschen zu beginnen, fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu. Dann die Waschschale auf einen Shaker geben und fünf Minuten lang vorsichtig schütteln. Entfernen Sie die PBS und wiederholen Sie den gesamten Waschvorgang dreimal.Als nächstes übertragen Sie den Deckelaufschub auf die Färbeschale. 50 Mikroliter des verdünnten Sekundärantikörpers auf den Deckelschlupf legen und 30 Minuten lang im Dunkeln und bei Raumtemperatur bebrüten. Den Deckelrutsch zurück auf die Waschschüssel geben.Um mit dem Waschen zu beginnen, fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu. Wickeln Sie die Waschschale in Aluminiumfolie, um sie vor Licht zu schützen. Übertragen Sie die Platte auf den Shaker und schütteln Sie sie vorsichtig für fünf Minuten.Entfernen Sie die PBS und wiederholen Sie den gesamten Waschvorgang dreimal. Bereiten Sie unmittelbar vor der STORM-Bildgebung einen Milliliter Bildgebungspuffer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie den Deckelinlegin in die Ladekammer ein.Fügen Sie den frisch vorbereiteten bildgebenden Puffer hinzu, der sanft ist, um das Abwaschen der cyanobakteriellen Zellen zu vermeiden. Legen Sie anschließend einen rechteckigen Deckelschlupf auf den Bildgebungspuffer, um zu verhindern, dass er mit dem Sauerstoff in der Luft reagiert. Schalten Sie die Kamera, das LED-Licht und den Laser ein, und öffnen Sie die STORM-Software.Fügen Sie einen halben Tropfen Tauchöl auf die Linse. Laden Sie die Kammer, um sicherzustellen, dass die Objektivlinse mit dem Deckelinin in Kontakt kommt. Und untersuchen Sie das Signal mit einem 750-Nanometer-Laser.Identifizieren Sie einen Stichprobenbereich, der sowohl Zellen als auch Treuhandmarker enthält. Starten Sie dann die Software für die Probendriftkorrektur. Erfassen Sie ein breit gelegtes Bild als Referenz, wobei die Kameraelektronenmultiplikation bei 300 und einer Belichtungszeit von 30 Millisekunden liegt.Erhöhen Sie die Anregungslaserintensität von 750 Nanometern auf ca. 4,5 Kilowatt pro Quadratzentimeter. Sobald die Fluorophore in ein spärliches Blinkenmuster übergegangen sind, erhalten Sie ein Superauflösungsbild, indem Sie 10.000 Bilder bei 33 Hertz sammeln. Rekonstruieren Sie dann die Bilder mit Superauflösung aus den Rohdaten, wie im Textprotokoll beschrieben.In dieser Studie wird STORM verwendet, um eine hochauflösende Bildgebung zu erreichen, indem einzelne fotoschaltbare Fluorophore stochastisch aktiviert werden. Die Position jedes Fluorophors wird aufgezeichnet, und auf der Grundlage dieser Standorte wird dann ein Bild mit super Auflösung erstellt. Während die Absorptionsspektren von Prochlorococcus bei 447 und 680 Nanometern liegen und eine minimale Absorption von mehr als 700 Nanometern aufweisen, emittieren Prochlorococcus MED4-Zellen immer noch eine hohe Autofluoreszenz, wenn sie einer extrem hohen Intensität des 750-Nanometer-Lasers ausgesetzt sind, die für die STORM-Bildgebung erforderlich ist.Nach der Hier beschriebenen Photobleichmethode für 30 Minuten nimmt die Autofluoreszenz der Zellen ab, obwohl mehrere Zellen mit Autofluoreszenz noch nachgewiesen werden. Die Dehnung der Photobleiche auf 60 Minuten führt dazu, dass die Mehrheit der Zellen ihre Autofluoreszenz verliert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die entwickelte Photobleichmethode in der Lage ist, die Autofluoreszenz photosynthetischer Organismen stark zu reduzieren.Nach dem Photobleichen wird STORM verwendet, um das Zellteilungsprotein FtsZ in den Zellen zu visualisieren. Mit STORM wird eine detaillierte Morphologie des FtsZ-Rings aufgedeckt. Durch Drehen der 3D STORM-Bilder wurden vier verschiedene Arten von Morphologien identifiziert, Cluster, ein unvollständiger Ring, ein kompletter Ring und Doppelringe.Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Lichtintensität und Dauer der Photobleichmittel für verschiedene Organismen unterschiedlich sein kann. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Methode den Weg für Forscher, die die Proteinorganisation und die potenzielle Funktion in photosynthetischen Zellen im Detail untersuchen wollen.

photobleaching-enables-super-resolution-imaging-ftsz-ring

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Weber, N. et. al., Natürliche Transformation, Proteinexpression und Kryokonservierung des filamentösen Cyanobakteriums Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt einen fokussierten LED-basierten Assay zur Untersuchung von Phototaxis in filamentösen Cyanobakterien. Die Bakterien wandern in Richtung der Lichtquelle und bilden eine dichte Anhäufung im beleuchteten Zentrum, die durch eine Pixelintensitätsanalyse des aufgenommenen Bildes visualisiert und quantifiziert wird.

Phototaxis-Assay von filamentösen Cyanobakterien mittels fokussierter Lichtbeleuchtung

Quelle: Zhan, Y., et al. Photobleaching ermöglicht eine Superauflösungsbildgebung des FtsZ-Rings im Cyanobacterium prochlorococcus. J. Vis. Exp. (2018).Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Photobleachung von Pigmenten in cyanobakteriellen Zellen unter Verwendung von Xenonlicht unter kalten Bedingungen, um die Fluoreszenzbildgebung wachstumsregulierender Proteine zu verbessern.

Photobleaching cyanobakterieller Pigmente zur Bildgebung wachstumsregulierender Proteine

Wir beschreiben eine super-resolution imaging Methode, um die strukturelle Organisation des bakteriellen FtsZ-Ring, ein wesentlicher Vorrichtung zur Zellteilung zu untersuchen. Diese Methode basiert auf quantitativen Analysen von photoaktivierten Lokalisierungs-Mikroskopie (PALM) Bilder und kann auf andere bakterielle Proteine ​​des Zytoskeletts angewendet werden.

Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Raumzeitliche Informationen über dynamische Proteine in lebenden Zellen sind entscheidend für das Verständnis der Biologie. Eine Art von hochauflösender Mikroskopie, die als schnelle 3D-strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (f3D-SIM) bezeichnet wird, enthüllt einzigartige Informationen über den zytokinetischen Z-Ring in Bakterien: sowohl sein kügelchenartiges Aussehen als auch die schnelle Dynamik von FtsZ innerhalb des Rings.

Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Studien von Biomolekülen in vivo sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Funktion in einem biologischen Kontext. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die es ermöglicht, fluoreszierende Biomoleküle, wie DNA oder Proteine, in lebende Mikroorganismen zu internalisieren. Die Analyse von in vivo-Daten, die durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, wird ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Isolierung von Phycobilisomen aus Cyanobakterien durch Zentrifugation durch einen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten. Die Fraktionen intakter Phycobilisomen werden durch 77K-Fluoreszenzemissionsspektrum und SDS-PAGE-Analyse bestätigt. Die resultierenden Phycobilisom-Fraktionen eignen sich für die negative Färbung von TEM und die massenspektrometrische Analyse.

Isolierung und Charakterisierung intakter Phycobilisomen in Cyanobakterien

Das vorliegende Protokoll beschreibt die schrittweise Autofluoreszenz-Bildgebung und Bewertung von Phycobiliprotein-Veränderungen in Rotalgen auf der Grundlage einer Spektralanalyse. Dies ist eine markierungsfreie und zerstörungsfreie Methode, um die zelluläre Anpassung an extreme Lebensräume zu bewerten, wenn nur knappes Material verfügbar ist und Zellen unter Laborbedingungen langsam oder gar nicht wachsen.

Autofluoreszenz-Bildgebung zur Bewertung der Rotalgenphysiologie

Wir stellen eine einfache und zugängliche Methode zur Visualisierung filamentöser Cyanobakterien in der XY-Ebene vor. Es wurde eine Agarosematrix mit niedrigem Schmelzpunkt verwendet, die die Aufnahme von Bildern von Proteinen, die an der Teilung beteiligt sind, in vertikaler Ausrichtung ermöglicht. Daher kann diese Methodik auf jeden fadenförmigen Organismus und verschiedene Arten von Proteinen angewendet werden.

Vertikale Immobilisierungsmethode für die zeitraffermikroskopische Analyse in filamentösen Cyanobakterien

In diesem Artikel wird ein umfassendes Protokoll für PmbExM vorgestellt, eine Expansionsmikroskopietechnik, die speziell für Proteus mirabilis-Biofilme entwickelt wurde. PmbExM nutzt eine schrittweise enzymatische Behandlung von Biofilmproben, um eine isotrope, 4,3-fache Expansion zu erreichen, die eine hochauflösende Analyse der räumlichen Organisation zellulärer und subzellulärer Strukturen innerhalb dieser sitzenden mikrobiellen Gemeinschaften ermöglicht.

Superhochauflösende Bildgebung des Biofilms von Proteus mirabilis mittels Expansionsmikroskopie

In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Lernen Sie eine Photobleaching-Methode zur Reduktion von Autofluoreszenz in Cyanobakterien kombiniert mit STORM-Mikroskopie. Diese Technik ermöglicht dreidimensionale Superauflösungsbildgebung des FtsZ-Rings in Prochlorococcus.

Immunofluoreszenz ermöglicht Höchstauflösung Bildgebung des FtsZ Ring in Cyanobacterium Prochlorococcus

Weitere Videos entdecken