Name: Quasi-metagenomischen Analyse Salmonella aus Lebensmitteln und Umweltproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Lernen Sie die quasimetagenomische Analyse von Salmonella aus Lebensmitteln und Umweltproben. Diese Methode kombiniert Immunomagnetische Separation und Multiple Displacement Amplification für eine schnelle Detektion.

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Die Autoren möchten Danke Mark Harrison und Gwen Hirsch von der University of Georgia freundlicherweise dafür den Bakterienstamm und sonstige Unterstützung zu dieser Studie.

1. die Probenvorbereitung
Hinweis: Lebensmittelproben auf Voranreicherung nach Mikrobiologie Labor Guidebook (MLG) der US-Abteilung Landwirtschaft Lebensmittelsicherheit und Inspection Service (USDA-FSIS)11 und bakteriologische analytische Handbuch (BAM) der U.S. Food vorbereitet sind und Drug Administration (FDA)12.
<ol><li>Aseptisch legen Sie eine 25 g Portion Schnupperprobe wie schwarzer Pfeffer, Hähnchenbrust, Hackfleisch, und Alfalfasprossen oder eine ökologische Tupfer in einen sterilen Labor-Mixer-Beutel mit einem eingebauten Filter. Bereiten Sie eine ökologische Tupfer von aseptisch Befeuchtung einen Schwamm mit Anreicherung Brühe (Rappaport Vassiliadis, RV). Dann ziehen Sie den Tupfer über vollflächig oder vorgegebenen Bereich und legen Sie sie in ein Labor-Mixer-Tasche.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58612/58612fig1.jpg"> Abbildung 1: repräsentative Lebensmitteln und Umweltproben für quasi-Metagenomik Erkennung und Subtypisierung von Salmonellen. Proben werden in Sterilfilter Stomacher Beutel zusammen mit RV Brühe gelegt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58612/58612fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="2"><li>Mischen Sie jede 25 g Probe mit 225 mL RV Bereicherung Brühe mit einer Labor-Mixer oder Hand-Massage für 30 s. Hinweis: Varianten der RV Brühe von MLG und BAM können je nach Art der Probe verwendet werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie Probe-Anreicherung-Brühe-Gemisch in einem Labor-Inkubator für 4-24 h bei 42 ° C.</li>
	<li>Nach der Inkubation sammeln Sie eine 50 mL Teilstichprobe der Bereicherung Brühe aus der gefilterten Seite der Tasche in eine separate 50 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr 100 X g für 10 min bis zum festen Ablagerungen in der Homogenat zu entfernen.</li>
	<li>Wiederherstellen Sie den Überstand sorgfältig, um eine neue 50 mL Röhrchen Zentrifugieren und Zentrifugieren der Rohre bei 3.000 – 6.000 x g für 10 min. Zelle Pellet wiederherstellen.</li>
	<li>(Optional) Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet durch Resuspension in 5 mL des gepuffert Pepton Wasser (BPW) und Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3.000 – 6.000 × g für 10 min. Hinweis: BPW können von auflösenden 10 g Pepton, 5 g Natrium-Chlorid, 3,5 g Binatrium Phosphat, und 1,5 g Monopotassium Phosphat in 1 L von destilliertem Wasser. Der endgültige pH-Wert sollte angepasst werden, um 7,2 ± 0,2 bei 25 ° C. Autoklaven bei 121 ° c für 15 min. im Handel erhältlichen BPW kann auch verwendet werden.</li>
	<li>Verwerfen Sie überstand und erneut aussetzen Sie das Pellet in 5 mL von BPW.</li>
</ol>2. Immunomagnetic Separation (IMS) und mehrere Displacement Amplification (MDA)
Hinweis: Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen zwischen Proben arbeiten in eine biologische Kabinett, Pipettenspitzen für jedes Rohr zu ändern, berühren Sie das Rohr mit der Pipette und stellen nicht Rohre dicht beieinander im Magnetstativ während der Waschschritt.
<ol><li>Tauen Sie den Probenpuffer und der Reaktion Puffer aus dem MDA-Kit auf Eis oder bei 4 ° C im Voraus.</li>
	<li>Mix 1 mL neu suspendierten Zelle pellet in BPW mit 20 μl Anti -Salmonellen Perlen in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie es auf der rotierenden Mischer für 30 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Wettbewerbsfähige Flora, Fett Partikel und Proteine im Pellet resuspendierte IMS stören. Verdünnung der neu suspendierten Zelle Pellet in BPW ist hilfreich, den Verlust der Wulst -Salmonellen -komplexe aus Magnetstativ während Waschschritten zu verringern.</li>
	<li>Stecken Sie die Rohre in die Magnetstativ und erlauben Sie 3 min für die ordnungsgemäße Verwertung von Perlen durch Umdrehen des Racks mehrmals, die Perlen in einem Pellet auf der Seite der Röhre zu konzentrieren.</li>
	<li>Halten Sie die Rohre auf die Magnetstativ. Aspirieren Sie und entsorgen Sie des Überstands aus jedem Röhrchen sowie die restliche Flüssigkeit in jedem Röhrchen Kappe. Hinweis: Achten Sie darauf, das Pellet von IMS Perlen an der Seitenwand des Rohres gegen den Magneten stören.</li>
	<li>Entfernen Sie den Schlauch aus der Magnetstativ und fügen Sie 1 mL Waschpuffer (PBS mit 0,05 % (V/V) Polysorbat 20) und invertieren Sie mehrmals zu unspezifisch bindende Bakterien aus der Anlage zu entfernen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2,3 bis 2,5 zweimal.</li>
	<li>Führen Sie nach der Wäsche 3rd die endgültige magnetische Trennung der Perlen durch Wiederholen der Schritte 2,3 – 2,4. Rohre aus magnetischen Rack entfernen und legen Sie sie in eine Microfuge für 1 s, Perlen zu spinnen. Dann setzen Sie die Rohre in die magnetische Rack für 3 min vor dem Entfernen Rückstände Waschpuffer.</li>
	<li>Wieder aussetzen Sie der Wulst -Salmonellen -komplexe in 9 μl Probenpuffer und inkubieren Sie bei 95 ° C für 3 min für Denaturierung.</li>
	<li>Nach dem Abkühlen auf 4 ° C auf dem Eis, kombinieren mit 9 μL der Reaktion Puffer plus 1 μL des Enzyms mischen und halten Sie auf dem Eis.</li>
	<li>Inkubieren Sie in einem Thermocycler Rohre bei 30 ° C für 2 h für Verstärkung, gefolgt durch Erhitzen bei 65 ° C für 10 min um inaktivieren das Enzym und auf 4 ° C auf Eis abkühlen.</li>
	<li>Die Quantität und Qualität der MDA-Produkte durch Messen der DNA-Konzentration und Reinheit (260/280 Verhältnis &gt; 1.8) auf ein Fluorospectrometer Instrument zu beurteilen. Hinweis: Wegen der unspezifischen Bindung von IMS Perlen, genomischer DNA aus anderen Organismen als Salmonellen ist wahrscheinlich in den MDA-Produkten präsent zu sein, aber es hat keinen Einfluss auf nachgelagerte Analyse.</li>
	<li>Speichern Sie die Endprodukte (20 μl) bei-20 ° C bis zum Einsatz für Real-Time PCR und/oder Bibliothek Vorbereitung für Quasimetagenomics-Sequenzierung.</li>
</ol>(3) Real-Time PCR
Hinweis: Dieser Schritt ist optional für 1) Erkennung von Salmonellen ohne Subtypisierung, und (2) Bewertung von Sample-Qualität vor Quasimetagenomics Sequenzierung.
<ol><li>Vorbereitung 18 μl des PCR Mischung pro Probe, mit Universal PCR Master Mix (10 μl), die nach vorne Grundierung (2 μL, 900 nM), reverse Primer (2 μL, 900 nM), Sonde (2 μl, 250 nM), und molekulare Grade Wasser (2 μL). Hinweis: Salmonellen-spezifische Oligonukleotid-Primer (nach vorne: CTCACCAGGAGATTACAACATGG, Rückseite: AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC) und Sonde wurden konzipiert, um verstärken eine 94-bp-Sequenz im Ttr -gen (GenBank Beitritt nein. AF 282268)13.</li>
	<li>Mischen Sie das MDA-Produkt aus Schritt 2.12 durch sanft nach oben und unten Wulst -Salmonellen komplexe zusammen mit Flüssigkeit zu einer Suspension pipettieren. Fügen Sie 2 μL der Suspension in 18 μl des PCR Mischung.</li>
	<li>Real-Time PCR mit eine optimierte Echtzeit-PCR-Protokoll ausführen, Angabe von zwei Haltefristen, bei 50 ° C für 2 min und bei 95 ° C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 60 s.</li>
	<li>Berechnen Sie den Schwellenwert-Zyklus (Ct), ist die Anzahl der Zyklen für die Fluoreszenz der amplifizierten DNA erforderlich, um die Schwelle-Linie zu kreuzen. Hinweis: Die Schwelle-Linie befindet sich in der linearen Phase zwischen Grundlinie und Plateau der Verstärkung Grundstücke von Proben. Negative Ergebnisse entsprechen Ct-Werte über 40 oder Proben mit Ct-Werte höher als die der Negativkontrolle.</li>
</ol>(4) Bibliothek Vorbereitung für Quasimetagenomic-Sequenzierung
Hinweis: Die MDA-Produkte können sowohl kurze und lange gelesen (Nanopore) Sequenzierung Plattformen sequenziert werden. Verwenden Sie die neueste Version von DNA Bibliothek Prep-Kits zur Verfügung gestellt von den Herstellern der Sequenzierung Plattformen. Durchführen Sie DNA-Bibliothek Vorbereitung nach Hersteller Anleitung. Verwenden Sie das 2D Low-Eingang genomische DNA-Protokoll Bibliothek Vorbereitung für die lange lesende Sequenzierung Plattform5. Für die Bibliothek Vorbereitung für die kurze lesende Sequenzierung-Plattform sind geringfügige Änderungen des Herstellers Protokolls unten angegeben.
<ol><li>Folgen Sie Standardbibliothek Zubereitungsmethoden durch Zugabe von Reagenzien und Pufferlösungen, MDA-Produkte. Übertragen Sie 40 μl der Sequenzierung vorbereitet MDA Produkte auf eine neue Platte zu, und fügen Sie 20 μl des PCR-Reinigung-Perlen in jede Vertiefung.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10 min ohne schütteln.</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen mit 80 % igem Ethanol und trocknen Sie die Perlen für 12 min.</li>
	<li>Wieder getrocknete Perlen in 53 μL der Wiederfreisetzung Puffer und 2 min inkubieren Sie, ohne schütteln.</li>
	<li>Verdünnen und Bibliotheken nach Anweisungen des Herstellers zu bündeln. Hinweis: Ein 22:00 gebündelt und denaturierte Bibliothek ist nun bereit, sequenziert werden.</li>
</ol>

<ol><li>Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., Cutter, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercially+Available+Rapid+Methods+for+Detection+of+Selected+Food-borne+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).</li>
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<li>Malorny, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+real-time+PCR+for+detection+of+Salmonella+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).</li>
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<li>Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+effectiveness+of+selenite+cystine+broth%2C+tetrathionate+broth%2C+and+Rappaport-Vassiliadis+medium+for+the+recovery+of+Salmonella+spp.+from+foods+with+a+low+microbial+load%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load.</a> Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).</li>
<li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kraken%3A+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), R46(2014).</li>
<li>Davis, S., Pettengill, J. B., Luo, Y., Payne, J., Shpuntoff, A., Rand, H., Strain, E. <a target="_blank" href="https://peerj.com/articles/cs-20/?utm_source=TrendMD&utm_campaign=PeerJ_TrendMD_0&utm_medium=TrendMD">CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data.</a> PeerJ Computer Science. 1 (e20), (2015).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+serotype+determination+utilizing+high-throughput+genome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).</li>
<li>Rodrigue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+amplification+and+de+novo+assembly+of+single+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells.</a> PLoS One. 4 (9), e6864(2009).</li>
<li>Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., Shinoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Perspectives+on+Viable+but+Non-Culturable+%28VBNC%29+Pathogenic+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria.</a> Front Public Health. 2, 103(2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Aufgrund der oft niedrigen Fülle und in homogenen Vorkommen von Salmonellen in Lebensmitteln und Umweltproben ist Kultur Bereicherung vor IMS-MDA zum Nachweis von Salmonellen und Subtypisierung weiterhin erforderlich; Es ist daher ein wichtiger Schritt des Protokolls. Um optimale Bedingungen für die Fülle von Salmonellen relativ zum Beispiel Hintergrund Flora erhöhen zu identifizieren, können verschiedene Bereicherung Medien für bestimmte Proben ausgewertet werden. Nach MLG und BAM selektiven M...

Metagenomik Sequenzierung ermöglicht theoretisch abgestimmte Erkennung und Subtypisierung von lebensmittelbedingten Krankheitserregern. Jedoch Herausforderungen Lebensmittelproben auf die Analyse der Erreger durch direkte Sequenzierung von Essen Microbiome. Erstens sind lebensmittelbedingten Krankheitserregern häufig auf einem niedrigen Niveau in Lebensmittelproben. Die meisten im Handel erhältlichen Schnellnachweis Methoden noch benötigen 8 – 48 h Kultivierung Erreger Zellen nachweisbar Ebene1zu bereichern. Zweitens: viele Lebensmittel enthalten reichlich Mikroflora Zellen und/oder Essen DNA, damit durch Lebensmittel übertragene Erreger-DNA einen kleinen Bruchteil der Nahrung Metagenom und ein schwer erreichbares Ziel für Erkennung und Subtypisierung durch metagenomische Sequenzierung direkte.
Änderung der Nahrung Mikrobiome wurde berichtet, dass erhebliche Konzentration Foodborne pathogens DNA-Sequenzierung-basierte Erkennung von Shiga Toxin-produzierenden Escherichia coli2,3 und zu erleichtern Salmonella Enterica4. Weil Essen geändert Mikrobiome sind noch Mischungen aus verschiedenen Mikrobenarten, ihre Sequenzierung wird als quasi-metagenomischen Analyse4bezeichnet. Microbiome Modifikation kann durch Kultur Bereicherung allein2,3 oder in Kombination mit Immunomagnetic Trennung (IMS) und mehrfache Verschiebung Verstärkung (MDA)4,5durchgeführt werden. IMS können selektiv Erreger Zellen aus der Bereicherung Kultur über Antikörper-beschichtete magnetische Beads erfassen. MDA kann ausreichende Mengen von genomischer DNA Sequenzierung durch die hocheffiziente ɸ29 DNA-Polymerase6generieren. IMS-MDA hat kulturunabhängig Erregernachweis aus klinischen Proben7, und Verkürzung der Kultur Bereicherung für quasi-metagenomische Erkennung und Subtypisierung von Salmonellen in Lebensmitteln Proben4erlaubt.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, quasi metagenomic DNA von Lebensmittelproben erlauben gezielte Konzentration von Salmonellen genomischer DNA und anschließenden Erkennung und Subtypisierung von Salmonellen Verunreinigung durch Sequenzierung vorzubereiten. Im Vergleich zu standard-Methoden für Salmonellen Erkennung8,9 und10Subtypisierung, kann der Quasimetagenomic Ansatz die Bearbeitungszeit von kontaminierten Lebensmitteln und Umweltproben, erheblich verkürzen. molekularen Subtypen des Erregers durch die Vereinheitlichung der beides in der Regel getrennt Analysen in einem Workflow. Diese Methode eignet sich besonders für Anwendungen wie lebensmittelbedingten Ausbrüchen und andere Spur zurück Untersuchungen, wo robuste Erreger Subtypisierung neben Erregernachweis erforderlich ist und schnelle analytische Turnaround ist wichtig.

<table><tbody><tr><td>Labor-Mixerbeutel mit Filter</td><td>VWR</td><td>10048-886</td><td></td></tr><tr><td>Gepuffertes Peptonwasser</td><td>Oxoid Micorbiology Products</td><td>CM0509</td><td></td></tr><tr><td>Rappaport Vassiliadis Bouillon</td><td>Neogen Acumedia</td><td>7730A</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbat 20&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9416</td><td>Tween 20</td></tr><tr><td>Stomacher Mixer</td><td>Seward&nbsp;</td><td></td><td></td>30010108</tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>75005194</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Techne Prime</td><td>EW-93945-13</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Real-Time Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4.76357</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Kügelchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>PCR-Reinigungskügelchen; Vor Gebrauch gut mischen; Bei 4 & Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Nextera XT Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Lagern bei -80 &deg; C</td></tr><tr><td>MinIon Library Prep Kit</td><td>Oxford Nanopore</td><td>SQK-LSK108</td><td>Lagern bei -80 &deg; C</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Dynabead Anti-Salmonellen-Kügelchen</td><td>Applied Biosystems</td><td>71002</td><td>Vortex weit vor der Verwendung</td></tr><tr><td>Illustra GenomiPhi V2 DNA-Amplifikationskit (MDA-Kit) -Probenpuffer -Reaktionspuffer -Enzymmischung</td><td>GE Healthcare</td><td>25-6600-30</td><td>Bei -80 μg lagern; C</td></tr><tr><td>HulaMixer</td><td>Invitrogen</td><td>15920D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag Magnetgestell</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Mastermix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td>Vor Gebrauch gut mischen; bei 4 & Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Mikrofuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr></tbody></table>

quasi-metagenomischen analyse salmonella aus lebensmitteln und umweltproben

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-Metagenomik Sequenzierung bezieht sich auf die Sequenzierung basierende Analyse der veränderten Mikrobiome von Lebensmitteln und Umweltproben. In diesem Protokoll soll Microbiome Modifikation genomischer DNA ein Ziel durch Lebensmittel übertragene Erreger Kontaminanten, die Erkennung zu erleichtern und Subtypisierung des Erregers in einem Workflow zu konzentrieren. Hier, wir erklären und zeigen die Probe Vorbereitungsschritte für die quasi-Metagenomik Analyse Salmonella Enterica aus repräsentativen Lebensmitteln und Umweltproben einschließlich Alfalfasprossen, gemahlener schwarzer Pfeffer, Hackfleisch, Hähnchen Brust und ökologischen Tupfer. Proben werden zuerst die Kultur Anreicherung von Salmonellen für eine verkürzte und einstellbare Dauer (4 – 24 h) unterzogen. Salmonellen -Zellen sind dann selektiv aus der Bereicherung Kultur von Immunomagnetic Trennung (IMS) erfasst. Zu guter Letzt wird mehrere Verschiebung Verstärkung (MDA) durchgeführt, um DNA aus IMS erfasst Zellen verstärken. Die DNA-Ausgabe dieses Protokolls kann von Hochdurchsatz-Sequenzierung Plattformen sequenziert werden. Eine optionale quantitativen PCR-Analysen kann durchgeführt werden, um Sequenzierung für Salmonellen -Nachweis zu ersetzen oder die Konzentration von Salmonellen DNA vor der Sequenzierung zu bewerten.

Vor Quasimetagenomic Sequenzierung können die allgemeine Menge und Reinheit der IMS-MDA-Produkte von Fluorospectrometer (Tabelle 1) ausgewertet werden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Anreicherung-Zeit (h)</td>
			<td>CT-Wert</td>
			<td>Konzentration (ng/Ul)</td>
			<td>Reinheit (260/280)</td>
		</tr>
<tr>
<td><st...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um DNA-Proben von Lebensmitteln und ökologischen Mikrobiome abgestimmte Erkennung und Subtypisierung von Salmonellen durch Sequenzierung Quasimetagenomic vorzubereiten. Der kombinierte Einsatz von Kultur Bereicherung, Immunomagnetic Separation (IMS) und mehrfache Verschiebung Verstärkung (MDA) ermöglicht wirksame Konzentration der Salmonellen genomische DNA aus Lebensmitteln und Umweltproben.

Quasi-metagenomischen Analyse Salmonella aus Lebensmitteln und Umweltproben

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Diese Methode kann verwendet werden, um Salmonellen aus Lebensmittelproben zu erkennen und den Erreger durch genetische Fingerabdrücke auf die Stammebene zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Salmonellen-Erkennung und Subtypisierung in einem einzigen Workflow kombiniert und die Bearbeitungszeit von salmonellaverseuchten Lebensmittelproben bis zum Fingerabdruck des Erregers erheblich verkürzt. Zunächst legen Sie aseptisch eine 25-Gramm-Probe von Lebensmitteln in einen sterilen Labormixerbeutel mit einem eingebauten Filter oder bereiten optional einen Umwelttupfer vor, indem Sie einen Schwamm mit Anreicherungsbrühe aseptisch befeuchten, ihn über eine vorbestimmte Oberfläche ziehen und in einen Mixerbeutel legen.Mit einem Labormixer jede Probe mit 225 MilliliterRV-Anreicherungsbrühe gründlich vermischen. Dann die Mischung bei 42 Grad Celsius für vier bis 21 Stunden inkubieren. Danach eine 50-Milliliter-Unterprobe der Anreicherungsbrühe von der gefilterten Seite des Beutels sammeln.Zentrifugieren Sie dann die Unterprobe 10 Minuten lang bei 100 mal g. Den Überstand vorsichtig auf ein neues 50 Milliliter Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge mit 3.000 b

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Klebeband-basierten Ansatz für die Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen durch schnelles ganze Zelle Erkennung...

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

Wir beschreiben eine Multiplex-PCR zum schnellen Nachweis von Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium. Spezifische Salmonella-Serovare können, indem sie auf einer Multiplex-PCR, um Gene und Sequenzen einzigartig für die O-Antigen-Biosynthese-Cluster und Flagellin eines bestimmten Serovar identifiziert werden. Serovar wird dann auf eine Salmonellen zugeordnet isolieren über das Auftreten von bestimmten, Größe Amplikons (PCR-Produkt), entsprechend dem Ziel...

Ein Allelotyping PCR zur Identifizierung Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium

Dieses Manuskript beschreibt ein detaillierte standardisierte Protokoll von Hochdurchsatz-16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung. Das Protokoll stellt eine integrierte, uniformierte Machbare und preiswerte Protokoll Kotprobe Sammlung durch Datenanalysen ab. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse einer großen Anzahl von Proben mit strengen Standards und mehrere Steuerelemente.

Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

Salmonella SPP /Shigella spp. sind häufige Erreger Durchfall zugeschrieben. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp., mittels Real-Time PCR kombiniert mit geführten Kultur.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Dieser molekulare Ansatz zur Bestimmung der bakteriellen Fitness ermöglicht die präzise und genaue Detektion von Mikroorganismen mithilfe einzigartiger genomischer DNA-Barcodes, die über digitale PCR quantifiziert werden. Das Protokoll beschreibt die  Berechnung des Wettbewerbsindex für Salmonellenstämme; Die Technologie ist jedoch leicht an Protokolle anpassbar, die eine absolute Quantifizierung jedes genetisch verformbaren Organismus erfordern.

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

Chromatin-Immunpräzipitation in Verbindung mit der Sequenzierung der nächsten Generation (ChIP-seq) ist eine Methode, die verwendet wird, um Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren und den von ihnen kontrollierten genomischen Sequenzen herzustellen. Dieses Protokoll skizziert Techniken zur Durchführung von ChIP-seq mit bakteriellen Biofilmen, wobei Salmonella enterica serovar Typhimurium bakterieller Biofilm als Beispiel verwendet wird.

Entdeckung von CsgD-Regulierungszielen im Salmonellen-Biofilm mit Chromatin-Immunpräzipitation und Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Loop-vermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) ist ein isothermer Nukleinsäure-Amplifikationstest (iNAAT), der ein breites Interesse am Nachweisvon Erreger geweckt hat. Hier präsentieren wir ein multilaboriertes Salmonella LAMP-Protokoll als schnelle, zuverlässige und robuste Methode zum Screening von Salmonellen in Tierfutter und zur Bestätigung mutmaßlicher Salmonellen aus der Kulturisolierung.

Loop-vermittelte isotherme Amplifikation zum Screening von Salmonellen in Tierfutter und Bestätigung von Salmonellen aus der Kulturisolierung

Diese analytische Berechnungsplattform bietet praktische Anleitungen für Mikrobiologen, Ökologen und Epidemiologen, die sich für die Genomik der Bakterienpopulation interessieren. Insbesondere zeigte die hier vorgestellte Arbeit, wie man Folgendes durchführt: i) phylogenie-geführte Kartierung hierarchischer Genotypen; ii) frequenzbasierte Analyse von Genotypen; iii) Verwandtschafts- und Klonalitätsanalysen; iv) Identifizierung der Abstammungsdifferenzierung der akzessorischen Loci.

Heuristisches Mining von hierarchischen Genotypen und akzessorischen Genomloci in Bakterienpopulationen

Salmonellen dringen in intestinale Epithelzellen ein und replizieren sich sowohl in Salmonellen-spezifischen Vakuolen als auch frei im Zytosol (Hyperreplikation). Hier wird ein auf Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie basierendes Protokoll beschrieben, um die intrazellulären Phänotypen von Salmonellen durch zwei komplementäre Bildanalysen durch ImageJ zu quantifizieren, um Einzelzellauflösung und Scoring zu erreichen.

Automatisierte Analyse intrazellulärer Phänotypen von Salmonellen mit ImageJ

Die Machbarkeit von Gesamtgenomsequenzierungsstrategien (WGS) mit Tischgeräten hat die Genomabfrage jeder Mikrobe von Relevanz für die öffentliche Gesundheit in einer Laborumgebung vereinfacht. Eine methodische Anpassung des Workflows für bakterielle WGS wird beschrieben und eine bioinformatische Pipeline zur Analyse vorgestellt.

Charakterisierung eines pathogenen Escherichia coli-Stammes aus Oreochromis spp. Farmen mit Ganzgenomsequenzierung

Lernen Sie die quasimetagenomische Analyse von Salmonella aus Lebensmitteln und Umweltproben. Diese Methode kombiniert Immunomagnetische Separation und Multiple Displacement Amplification für eine schnelle Detektion.

Quasi-metagenomischen Analyse Salmonella aus Lebensmitteln und Umweltproben

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