Saugfähige Microbiopsy Probenahme und RNA-Extraktion für Minimal-Invasive, gleichzeitige Blut und Hautanalyse

Diese Methode kann die Etablierung von Biomarkern für Hautkrankheiten erleichtern und auch das Risiko für klinische Forschungsteilnehmer verringern. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie kein intensives Training erfordert und keine Narben hinterlässt. Fünf Minuten vor der Mikrobiopsie ein leeres Zwei-Milliliter-Zentrifugenrohr fünf Minuten lang auf Trockeneis legen.

Tragen Sie Einweghandschuhe, sprühen Sie die Hände und Werkzeuge mit 70% Ethanol, bevor Sie die Applikationsstelle auf dem Gegenstand mit einem Alkoholtuch desinduzieren. Entfernen Sie die Mikrobiopsie aus dem sterilisierten Gammastrahlungspaket, ohne die Mikronadel zu berühren, und ziehen Sie den Kolben, bis ein Klick zu hören ist und der Kolben an Ort und Stelle verriegelt ist. Zielen Sie das geladene Gerät in einem etwa senkrechten Winkel zur zu beprobenden Haut an, wobei darauf zu achten ist, dass sich der Probenahmebereich in einer festen Position befindet, und das Gerät innerhalb von mindestens einem Kilogramm Kraft auf die Haut auftragen.

Drücken Sie dann den Auslöser und halten Sie das Gerät mindestens zehn Sekunden lang an Ort und Stelle. Wenn das Gerät vor zehn Sekunden freigesetzt wird, gibt es eine höhere Wahrscheinlichkeit einer Variation der Blutabsorption und auch der anschließenden Analyse. Wenn die Probe absorbiert wurde, ziehen Sie vorsichtig den Kolben und die saugfähige Mikronadel aus dem Gehäuse und verwenden Sie sterile Zangen, um sie an den beiden Löchern der Mikronadel zu ziehen, um sie aus dem Kolben zu entfernen.

50 Mikroliter Extraktionspuffer auf Trockeneis in die Röhre geben und die intakte Mikronadel auf der Trockeneisnadelseite in das Rohr legen. Achten Sie darauf, dass die Spitze der Mikronadel während des Entfernungsprozesses nichts berührt. Wirbeln Sie das Rohr für drei bis fünf Sekunden, um etwas beprobtiertes Material von der Mikronadelspitze zu sammeln und das Rohr in einem Wärmeblock oder Wasserbad für 30 Minuten bei 42 Grad Celsius zu inkubieren.

Verwenden Sie am Ende der Inkubation sterile Zangen, um das hintere Ende der Mikronadelebene mit der Oberkante des Mikrofugenrohrs zu platzieren und den Deckel des Rohres so zu schließen, dass die Oberseite der Mikronadel zwischen der Kappe und dem Rohr gehalten wird. Zentrifugieren Sie das Rohr, um das entnommene Material aus der saugfähigen Schicht des Geräts zu sammeln, und verwenden Sie die Zange, um die Mikronadel vorsichtig zu entfernen, ohne die Spitze wieder in die Pufferlösung einzutauchen. Zentrifugieren Sie die Probe erneut und übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Mikrozentrifugenrohr.

Als nächstes 250 Mikroliter Konditionierungspuffer auf eine Reinigungssäulenfiltermembran für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur geben und den Puffer durch Zentrifugation verdünnen. 50 Mikroliter 70% Ethanol in die extrahierte RNA-Probe mit sanftem Mischen geben und das Gemisch in die vorkonditionierte Reinigungskolonne übertragen. Zentrifugieren Sie das Rohr sofort zweimal, um den Durchfluss zu entfernen, gefolgt von einer Wäsche in hundert Mikroliter Waschpuffer eins.

Für die DNA-Verdauung 40 Mikroliter frisch zubereitete DNAs-Inkubationsmischung direkt auf die Reinigungssäulenmembran für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Wäsche mit 40 Mikroliter Waschpuffer eins. Am Ende der Zentrifugation die Säule mit 100 Mikroliter Waschpuffer zwei waschen und die Reinigungskolonne auf Restwaschpuffer überprüfen. Übertragen Sie die Reinigungskolonne in ein 0,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr, das im RNA-Extraktionskit enthalten ist, und legen Sie die Spitze der Pipette direkt auf die Membran der Reinigungssäule, um der Säule 11 Mikroliter RNA sPRE-Wasser hinzuzufügen.

Nach einer zweiminütigen Inkubation bei Raumtemperatur zentrieren Sie die Säule einmal, um das RNA-sPRE-Wasser über die Spalte zu verteilen, und einmal, um die RNA zu löschen. Dann speichern Sie die gesamte RNA-Probe bei minus 80 Grad Celsius, wenn die cDNA-Synthese nicht sofort durchgeführt wird. Die saugfähige Mikrobiopsie-Mikronadel besteht aus zwei Schichten Stahlplatte mit einer saugfähigen Schicht dazwischen zur gleichzeitigen Probenahme von Haut und Blut.

Die Verwendung einer saugfähigen Mikrobiopsie induziert nur geringfügiges Erythem, das nach 48 Stunden nicht spürbar ist. Nach der Punktion werden in der Nähe der Spitze der Mikronadel ein paar winzige Hautstücke eingefangen und Blut in das Filterpapier aufgenommen. Wenn die saugfähige Mikronadel unmittelbar nach der Punktion entfernt wird, ist das Probenvolumen und die anschließende Menge der extrahierten mRNA deutlich niedriger als die, die nach dem Halten für zehn Sekunden nach der Punktion erhalten wurde.

Ähnliche Konzentrationen der Hautmarker-Expression werden nach der Verwendung der saugfähigen Mikrobiopsie und ihrer Vorgänger-Hautmikrobiopsie durch quantitative PCR-Analyse nachgewiesen. Aber ein signifikant höheres Maß an weißer Blutkörperchen Bio-Marker-Expression wird nach absorbierenden Mikrobiopsie Probenahme erkannt, was darauf hindeutet, dass die absorbierende Mikrobiopsie Mikronadel besser für die Blutentnahme unter Beibehaltung der gleichen Kapazität für die Hautprobenerfassung wie bei der HautMikrobiopsie. Bei der Anwendung der Technik ist es daher wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Anwendung des Geräts gemäß dem, was wir vorschlagen, wichtig ist, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie Echtzeit-PCR, für relativ Genexpressionsprofiling befolgt werden. Obwohl wir das Gerät noch entwickeln, sind wir zuversichtlich, dass die Technik den Weg für klinische Forschungen für die Durchführung von Proben, für dermatologische kosmetische oder pädiatrische Anwendung geebnet hat, weil es einfach ist und minimal invasiv ist.