Name: Fluorimetrischen Techniken für die Beurteilung der Spermien Membranen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Erfahren Sie fluorimetrische Techniken zur Bewertung der Spermienmembranintegrität mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie. Diese Methoden ermöglichen präzise Analysen für die reproduktionsbiologische Forschung.

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Die Autoren möchten "SION" israelische Gesellschaft für künstliche Befruchtung und Zucht (Hafetz-Haim, Israel) Danke für ihre Hilfe und Zusammenarbeit und Frau Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, Frankreich) für die Unterstützung bei der Inbetriebnahme und Schulung.

Alle Experimente wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den israelischen Leitlinien von 1994 für den Tierschutz. Bovine Sperma geliefert wurde von israelischen Handelsgesellschaft für künstliche Befruchtung und Zucht. Ejakuliert 11 Bullen wurden in dieser Studie ausgewertet.
1. Sperma Probenaufbereitung
Hinweis: Das Verfahren basiert auf der Roth Labor Protokoll1,3.
<ol><li>Erhalten Sie ca. 1 – 6 mL von Rindersperma in einer 15 mL Tube bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Zu je 1 mL des Samens 6 mL (bei 37 ° C) vorgewärmte NKM Puffer (110 mM NaCl, KCl, 5 mM 20 mM MOPS [3-N-Morphilino-Propanesulfonic Säure; pH 7.4]) zugeben und Zentrifugieren für 8 min bei 600 X g, 1 – 2 Mal bis der Überstand ist klar. Hinweis: Wenn Samenzellenkonzentration oder des Ausgangsvolumens aufgeteilt in zwei Rohre bei der ersten Wäsche sehr hoch sind.</li>
	<li>Sofort entfernen und entsorgen des klare Überstands und lassen Sie etwa 1 cm Überstand über die Pellets.</li>
	<li>Lehnen Sie sich sorgfältig die Röhren in einem 30°-Winkel erhöhen die Fläche für Spermien schwimmen und warten 20-30 min um Spermien schwimmen Sie bei 37 ° c zu ermöglichen Hinweis: Trübung kann gesehen werden.</li>
	<li>Mit einer Mikropipette sorgfältig entfernen der oberen 1 mL der Überstand enthält die bewegliche Spermien zu einem neuen 1,5 mL-Tube.</li>
	<li>Halten Sie das Sperma bei 37 ° C bis zur Verwendung.</li>
	<li>Schätzen Sie die Anzahl der Spermien mit einem Neubauer Hemocytometer. Hinweis: Stattdessen ein anderes Zählkammer verwendet werden, aber die Zählung ist anders.<ol>
<li>Um Samenzelle Bewegung zu verhindern, 100 µL der bewegliche Spermien mit doppelt destilliertem Wasser (DDW) (1: 100 Verdünnung) in einem 15 mL Röhrchen 10 mL verdünnen und vorsichtig mischen.</li>
		<li>Laden Sie 10 µL der Probe in jeder Seite des Hemocytometer und Deckglas. Achten Sie darauf, Blasenbildung im Inneren der Kammer zu vermeiden, da dies zu einer ungenauen Spermienzahl führen kann.</li>
		<li>Unter einem Compound Mikroskop mit einem 20 X Objektiv beobachten. Hinweis: Das vollständige Raster auf eine Hemocytometer enthält 9 große Quadrate, jeweils 1 mm2und das Deckglas liegt 0,1 mm über dem Boden der Kammer. So ist das Volumen über Zählung Zentralbereich 0,1 mm3 oder 0,1 µL. Der zentrale Bereich des die Hemocytometer enthält 25 mittlere Plätze und jedes mittlere Quadrat hat 16 kleinere Quadrate mit Einzelleitungen.</li>
		<li>Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in 4 mittlere Eckquadrate und dem zentralen Platz gefunden. Zählen Sie für höhere Präzision zwei Kammern (beidseitig Neubauer Hemocytometer) und mit dem Durchschnitt Zellkonzentration berechnen.</li>
		<li>Berechnen Sie die Anzahl der Spermien durch Multiplikation der durchschnittlichen Anzahl erhalten durch 5 (um die Anzahl der Zellen pro Bereich zählen zu erhalten) und 10.000 (um die Anzahl der Zellen pro 1 mL der verdünnten Probe zu erhalten). Dann multiplizieren Sie die Anzahl die erhaltenen mit den Verdünnungsfaktor (1: 100). Hinweis: Zum Beispiel ist eine durchschnittliche Anzahl von Spermien gezählt in 5 der 25 mittlere Plätze innerhalb des zentralen zählen zwei Kammern 150 ([152 + 148] / 2). So ist die mittlere Anzahl der Spermien pro Kammer (oder 0,1 µL) 150 x 5 = 750. Multiplizieren Sie 750 von 10.000 um zu erhalten die Anzahl der Zellen pro 1 mL der verdünnten Probe (7.500.000) und multiplizieren Sie dann mit 100 (Verdünnungsfaktor), 75 x 107 Zellen pro mL original Samenprobe zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Technik #1: Gleichzeitige Beurteilung der Spermien Membranen mit mehreren fluoreszierende Sonden
Hinweis: Sperma-Membranen (Plasma, acrosomal und Mitochondrien) wurden bewertet, wie oben beschrieben durch Celeghini Et Al.10, mit einigen Änderungen. Epifluorescent Mikroskopie wurde verwendet, kombiniert mit einer Digitalkamera mit Erregung bei 450-490 nm und Emission bei 515-565 nm mit einem dreifach-Filter.
<ol><li>
Stammlösungen vorzubereiten.
	<ol>
<li>Bereiten Sie 0,1 mg/mL Stammlösung DAPI durch Auflösen von 5 mg DAPI in 50 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS vor). 50 µL-Aliquots Vorbereitung und Lagerung bei-20 ° C. Vor Gebrauch Verdünnen der Stammlösung mit PBS bei 01:10 (Arbeitslösung; 10 µg/mL).</li>
		<li>Bereiten Sie 1 mg/mL Stammlösung FITC – PSA durch Auflösung 1 mg FITC – PSA in 1 mL PBS vor. 50 µL-Aliquots Vorbereitung und Lagerung bei-20 ° C. Vor Gebrauch Verdünnen der Stammlösung mit PBS bei 01:10 (Arbeitslösung; 100 µg/mL).</li>
		<li>Bereiten Sie 1 mg/mL JC-1-Vorratslösung durch Auflösen von 1 mg JC-1 in 1 mL Dimethyl Sulfoxid (DMSO vor). 10 µL-Aliquots Vorbereitung und Lagerung bei-20 ° C. Vor Gebrauch Verdünnen der Stammlösung mit DMSO bei 01:10 (Arbeitslösung; 0,1 mg/mL).</li>
		<li>Bereiten Sie die PI-Stammlösung durch 10 mg PI in 400 µL PBS (mit 2,5 mg/mL) auflösen. Bei + 4 ° C. Lager 1 mit PBS bei 01:20 (Arbeitslösung, 0,125 mg/mL) verdünnen. Als eine Stammlösung bei + 4 ° C lagern. Achtung: PI ist ein potenzieller Mutagen und sollten mit Vorsicht behandelt werden. Der Farbstoff muss sicher und entsprechend den geltenden örtlichen Vorschriften entsorgt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>133 µL bewegliche Spermien (Schritt 1.5) auf eine neue 1,5 mL Tube (25 x 106 Spermien/mL) übertragen. Hinweis: Wenn die Probenkonzentration höher ist, verdünnen Sie es im Puffer, NKM um die gewünschte Konzentration zu erreichen; Wenn die Probenkonzentration die Swim-up Probe niedriger ist, Zentrifugieren Sie die erhaltenen überstand nach dem Schwimmen bis 1.000 x g für 5 min, entfernen Sie 0,5 mL des Überstands zu und zählen Sie das Sperma wieder.</li>
	<li>17 µL DAPI (Arbeitslösung) hinzufügen und 10 Minuten bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Bei 1.000 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.</li>
	<li>Das Pellet fügen Sie 100 µL NKM Puffer hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL FITC-PSA, 2 µL des JC-1 und 3 µL von PI (funktionierende Lösungen) und 10 min bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Bei 1.000 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand zu entfernen.</li>
	<li>Das Pellet 40 µL NKM Puffer hinzugeben und Aufschwemmen durch pipettieren.</li>
	<li>Übertragen Sie 10 µL der Probe auf einem Objektträger, Abstrich und Deckglas.</li>
	<li>
Visualisieren Sie sofort durch Epifluoreszenz Mikroskopie (Nutzung 40 X Objektiv) mit einem dreifachen Filter, ausgestattet mit einer digitalen Kamera und Aufnehmen eines Bildes separat für jeden Filter. Hinweis: Es gibt keine Bedeutung Reihenfolge Filter visualisiert.<ol>
<li>Visualisieren Sie unter DAPI Kanal mit Erregung bei 358 nm und Emission bei 461 nm.</li>
		<li>Unter FITC Kanal für grüne Monomere mit Erregung bei 450-490 nm und Emission bei 515 – 565 nm zu visualisieren.</li>
		<li>Visualisieren Sie unter PI-Kanal für rote Aggregate mit Erregung bei 488 nm und Emission bei 590 nm.</li>
		<li>Visualisieren Sie unter JC-1 rote Aggregate mit Erregung bei 559 nm und Emissionen im Bereich von 574 – 627 nm; JC-1 grüne Monomere mit Erregung bei 488 nm und Emissionen im Bereich von 500 – 535 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verbinden Sie die drei Bilder von den Filtern im JPG/JPEG-Format, mit der Option "Zusammenführen" der Kamerasoftware erhalten.</li>
	<li>Das zusammengefügte Bild mit "Paint" Werkzeug zu öffnen und die Option Pinsel gezählte Spermien zu markieren.</li>
	<li>
Spermien, die basierend auf der von jeder Sonde emittierte Fluoreszenz zu klassifizieren:
	<ol>
<li>In der Regel mindestens 200 Spermien pro Folie zu bewerten – alle Zellen erscheinen blau (DAPI).</li>
		<li>Bewertung die Tragfähigkeit durch abgestorbene Zellen zählen, die erscheinen violett (PI [rot] + [blau] DAPI) und Berechnung des Prozentsatzes von abgestorbenen Zellen (Tote Zellen/Gesamt gezählt Zellen X 100).</li>
		<li>Werten Sie Akrosom Status mit den Mustern der fluoreszierende Färbung (FITC – PSA aus). Berechnen Sie die Prozentsätze der unterschiedlichen Muster (intakt, beschädigten oder reagierte Akrosom Zellen/Gesamt gezählt Zellen X 100). Hinweis: Beschädigte acrosomal Membran wirkt wie eine Kappe voll gefärbt, grüne Akrosom; reagierte acrosomal Membran zeigt verbleibende grünen äquatorialen oder oberen Färbung; Zellen mit intakten acrosomal Membran werden nicht aufweisen, eine grüne Färbung der acrosomal Region.</li>
		<li>Bewerten Sie ΔΨm durch die Unterscheidung von Spermien mit hohen ΔΨm, die einen rot gefärbten Midpiece aufweisen und Spermien mit niedrigen ΔΨm, die einen grün gefärbten Midpiece aufweisen. Zählen, rot und grün Midpieces separat und berechnen ihre Ratio (rot/grün).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Technik #2: Beurteilung der Spermien Membranen mit Ready-To-Use-Kits und Durchflusszytometrie
Hinweis: Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen Plasmamembran, Mitochondrien-Membran Potenzial und acrosomal Membran Integrität wurde mit Ready-to-Use Flow Cytometry Bausätze mit lyophilisierten Fluorochromes in jede Vertiefung durchgeführt. Der Eingriff war nach Angaben der Hersteller mit einigen Änderungen durchgeführt.
<ol><li>
Plasmamembran Integrität Bewertung
	<ol>
<li>Nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Brunnen aus dem Paket der Lebensfähigkeit und Konzentration-Kit (PI und SYbr14), übertragen Sie sie auf die Arbeitsgrundlage und die Abdeckung mit einem flexiblen Deckel (vor Licht schützen).</li>
		<li>Fügen Sie 199 µL gepufferten Lösung für Zytometrie pro Bohrloch.</li>
		<li>Fügen Sie 1 µL homogene Sperma am 57 x 106/mL (57.000 Zellen pro Well) und Homogenisieren von pipettieren.</li>
		<li>Die Platte mit den schwarzen Deckel abdecken.</li>
		<li>Inkubieren Sie für 10 min bei 37 ° C, vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Führen Sie das Beispiel mit der Einstellung "Lebensfähigkeit" durch das Durchflusszytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mitochondriale Membranpotential
	<ol>
<li>Nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Brunnen aus dem Paket der mitochondrialen Aktivität Kit (JC-1), übertragen Sie sie auf die Arbeitsgrundlage und die Abdeckung mit einem flexiblen Deckel (vor Licht schützen).</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL von absoluten Ethanol pro Bohrloch und pipette, um das Pulver vorhanden innerhalb der Brunnen aufzuwirbeln.</li>
		<li>Fügen Sie 190 µL PBS pro Bohrloch und Homogenisieren von pipettieren.</li>
		<li>Fügen Sie 0,75 µL homogene Sperma am 57 x 106/mL (50.000 Zellen pro Well) und Homogenisieren von pipettieren.</li>
		<li>Die Platte mit den schwarzen Deckel abdecken.</li>
		<li>Inkubieren Sie für 30 min bei 37 ° C, vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Führen Sie das Beispiel durch das Durchflusszytometer mit der Einstellung ʽmitochondrial Tätigkeit ".</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Acrosomal Membran Integrität Hinweis: FITC – PSA Färbung (siehe Technik #1) ermöglicht die Bewertung der 3 Akrosom Kategorien (intakt Akrosom, reagierte Akrosom und beschädigte Akrosom). Mit dem Durchflusszytometer und Lebensfähigkeit & Akrosom Integrität Kit (PI und FITC-PNA), sind die Spermien in diesen 3 Kategorien unterteilt.<ol>
<li>Nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Brunnen aus dem Paket der Lebensfähigkeit & Akrosom Integrität Kit, übertragen Sie sie auf die Arbeitsgrundlage und die Abdeckung mit einem flexiblen Deckel (vor Licht schützen).</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL der gepufferten Lösung für Zytometrie pro Bohrloch.</li>
		<li>Fügen Sie 0,7 µL homogene Sperma am 57 x 106/mL (40.000 Zellen pro Well) und Homogenisieren von pipettieren.</li>
		<li>Die Platte mit den schwarzen Deckel abdecken.</li>
		<li>Inkubieren Sie für 45 min bei 37 ° C, vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Führen Sie das Beispiel durch das Durchflusszytometer mit der Einstellung ʽInCyte ".</li>
		<li>Analysieren das resultierende Histogramm durch drei Marker-Bereiche nach Fluoreszenzintensität gating, stellvertretend für vernachlässigbar, niedrig-fluoreszierenden Zellen mit intakten, ungefärbten Akrosom (R1), niedrig-fluoreszierenden Zellen mit Restwert gebeizt Bestandteil der Akrosom (R2) und stark fluoreszierende Zellen mit gestörten Akrosom (R3). Hinweis: Verwenden Sie den "Analyse von Dateien mit anderen Modulen erworbenen" Abschnitt im Benutzerhandbuch Instrument um die drei Regionen (R1, R2, R3) zu schaffen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Technik #3: Beurteilung der Spermien Membranen mit fluoreszierenden Sonden und Durchflusszytometrie
Hinweis: Nutzung von annexin V kombiniert mit PI Fluorochromes ermöglicht Apoptose Bewertung und Berechnung des apoptotischen Spermien (Apoptose-Index).
<ol><li>Bereiten Sie 1 x annexin V Bindung Puffer von 20 x Stammlösung (verdünnte 500 µL annexin V Bindung Puffer 20 x Stammlösung mit 9,5 mL sterilem destilliertem Wasser vor).</li>
	<li>Schätzen Sie die Anzahl der Spermien mit einem Neubauer Hemocytometer, wie in Abschnitt 1.7 beschrieben.</li>
	<li>Waschen Sie 106 Spermien in 1 mL 1 x annexin V Bindung Puffer und Zentrifuge bei 300 X g für 10 min.</li>
	<li>Den Überstand vollständig abzusaugen.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie das Pellet in 100 µL 1 x annexin V Bindung Puffer.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL annexin V, FITC konjugiert.</li>
	<li>Gut mischen und 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie Spermien durch Zugabe von 1 mL 1 X annexin V Bindung Puffer pro 106 Zellen und Zentrifuge bei 300 X g für 10 Minuten.</li>
	<li>Den Überstand vollständig abzusaugen.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 µL 1 X annexin V Bindung Puffer pro 106 total Zellen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 µg/mL PI unmittelbar vor der Analyse mit einem Durchflusszytometer.</li>
	<li>Führen Sie das Beispiel durch das Durchflusszytometer am ʽInCyte ".</li>
</ol>

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<li>Beltrán, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ion+Channels+in+the+Sperm+Acrosome+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Embryol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte gibt.

Sperma Befruchtung potenzielle hängt von mehrere Faktoren die Qualität widerspiegelt. Eine hohe Konzentration der Spermien und einen hohen Anteil an sehr progressiv bewegliche Spermien könnte qualitativ hochwertige Samen betrachtet werden. Dennoch, eine solche Bewertung nicht berücksichtigt andere zelluläre und funktionelle Parameter. Die Verwendung von "Bench-Top" Microcapillary Durchflusszytometer kann zur Bewertung der verschiedenen Spermien Strukturen mit fluoreszierenden Sonden, wie zuvor von anderen<sup class="xref...

Integrität und Funktionalität der Spermien Membranen sind einige der Angabe Lebensfähigkeit der Spermien und Befruchtung mögliche Faktoren. Die Plasmamembran wirkt wie eine Barriere zwischen den intrazellulären und extrazellulären Abteilen, damit Aufrechterhaltung der zellulären osmotische Gleichgewicht1. Stress, die Schäden an der Plasmamembran Integrität induziert möglicherweise beeinträchtigen Homöostase, Lebensfähigkeit und Düngung Kapazität reduzieren und Zelltod zu erhöhen. Beispielsweise reduziert Kryokonservierung Lebensfähigkeit der Spermien durch zu Schäden an der Plasmamembran infolge Temperaturänderungen und osmotischen Stress2. Wir berichteten bereits, dass auszusetzen Bullensperma niedrigen Konzentrationen von lebensmittelbedingten Schadstoffe wie Pestizide Atrazin, seine wichtigsten Metaboliten Diaminochlorotriazine oder Mykotoxine Aflatoxin B1, reduziert Spermien Rentabilität1,3 . Dies wurde durch Kennzeichnung der doppelsträngigen DNS mit DAPI in Kombination mit PI, die bindet an die DNA von Zellen mit einer beschädigten Plasmamembran bestimmt.
Akrosom Reaktion (AR) beinhaltet Verschmelzung der äußeren Akrosom Membran und die darüber liegende Plasmamembran, was die Auflösung von acrosomal Enzymen4,5. Dies sind wesentliche Ereignisse für die Zona Pellucida eindringen und weitere Zusammenführung der Samenzellen mit der Eizelle6. Bewertung der acrosomal Membran Integrität somit einen nützlichen Parameter zur Bewertung der Qualität des Spermas und männliche Ergiebigkeit7,8,9. Verschiedene fluoreszierende Techniken eignen sich für die Überprüfung der Integrität von Akrosom, FITC-PNA oder FITC-PSA8,10. In unseren früheren Studien mit den Mustern der FITC-PSA Färbung1,3wir versehen genaue Definitionen für (i) intakt Akrosom, (Ii) Akrosom Membran beschädigt und (Iii) reagierten Akrosom. Im aktuellen Bericht wir bewerten Akrosom Status mithilfe von Spermien gewidmet Durchflusszytometrie und vergleichen Sie die Ergebnisse mit denen mit Fluoreszenz-Mikroskopie.
Die Mitochondrien sind multifunktionale Organellen beteiligt, unter anderem ATP Synthese, reaktiven Sauerstoff-Spezies-Produktion, Kalzium-Signalisierung und Apoptose. Physiologische Störungen, einschließlich der männlichen und weiblichen Unfruchtbarkeit sind veränderte Funktion der Mitochondrien11zugeordnet. Spermien Mitochondrien sind in der Midpiece angeordnet und spielen eine entscheidende Rolle in der Spermien-Motilität-12. Es wird gut angenommen, dass hohe mitochondriale Membranpotential (ΔΨm) normale Motilität und hoher Düngung Kapazität13zugeordnet ist. Im Gegensatz dazu niedrig ΔΨm ist verbunden mit einer erhöhten Niveau von reaktiven Sauerstoffspezies und Befruchtung Rate14reduziert. Dennoch können verschiedene ökologische Verbindungen, z.B. endokrine Disruptoren zellulären Stress auslösen und führen zu einem vorübergehenden Anstieg der ΔΨm, Hyperpolarisation1,3, erhöhte Produktion von freien Radikalen und schließlich, Apoptose-15. Die fluoreszierende Sonde 5, 5', 6, 6'-Tetra-Chloro-1, 1', 3, 3'-Tetraethylbenzimidazolyl Carbocyanine Jodid (JC-1) ermöglicht die Untersuchung beispielsweise die Auswirkungen der Foodborne Giftstoffe auf Sperma ΔΨm1,3.
Standard Spermiograms, basierend auf physiologische und morphologische Parameter sind nicht gut genug, um die Qualität des Spermas vorherzusagen. Genauere Methoden sind erforderlich, um Spermien-Qualität zu gewährleisten. Hier bieten wir zwei praktikable Methoden zur Bestimmung Spermienqualität basierend auf Bewertungen von Spermien Membranen: gleichzeitige vierfach Färbung mit speziellen fluoreszierenden Sonden und Fluoreszenz-Mikroskopie, beschrieben in unserem Studien-1,-3 und erweiterte Spermien gewidmet Durchflusszytometrie, vor kurzem in unserem Labor und bereits von anderen verwendet16,17,18.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>MOPS [3-N-morphilino-Propansulfonsäure]</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Neubauer Germany</td><td></td><td>Hämozytometer</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Fluoreszenzsonde</td></tr><tr><td>PI (Propidiumiodid)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>Fluoreszenzsonde</td></tr><tr><td>FITC-PSA (Fluoresceinisothiocyanat-konjugiertes Pisum sativum Agglutinin)</td><td>Sigma</td><td>L0770</td><td>Fluoreszenzsonde</td></tr><tr><td>JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyaniniodid)</td><td>ENZOBiochem, New York, NY, USA</td><td>ENZ52304</td><td>Fluoreszenzsonde</td></tr><tr><td>Annexin V konjugiert an FITC</td><td>MACS, Miltenyi Biotec</td><td>130-093-060</td><td>Fluoreszenzsonde</td></tr><tr><td>Annexin V Bindungspuffer 20x Stammlösung</td><td>MACS, Miltenyi Biotec</td><td>130-092-820</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td><td>Nikon, Tokio, Japan</td><td></td><td>Inverses Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Nis Elements</td><td>Nikon, Tokio, Japan</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Nikon DXM1200F</td><td>Nikon, Tokio, Japan</td><td></td><td>Digitalkamera</td></tr><tr><td>Guava EasyCyte Plus</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Frankreich</td><td></td><td>Mikrokapillar-Spermien-Durchflusszytometer</td></tr><tr><td>CytoSoft</td><td>Guava Technologies Inc., Hayward, Kalifornien, USA; vertrieben von IMV Technologies</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Gepufferte Lösung für die Zytometrie</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Frankreich</td><td>023862</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Viabilitäts- und Konzentrationskit</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Frankreich</td><td>024708</td><td>Kit zur Beurteilung der Lebensfähigkeit</td></tr> Kit <tr><td>für die mitochondriale Aktivität Kit für die Mitochondrienaktivität</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Frankreich</td><td>024864</td><td>Kit für die mitochondriale Aktivität Bewertung</td></tr><tr><td>Viehfähigkeit & Akrosom Integrität Kit</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Frankreich</td><td>025293</td><td>Kit zur Bewertung der Akrosom</td></tr><tr><td>Integrität JMP-13</td><td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Rindersperma</td> <td>"SION", israelisches Unternehmen für künstliche Befruchtung und Entwässerung, Hafetz-Haim, Israel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorimetrischen techniken für die beurteilung der spermien membranen

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Standard Spermiograms beschreiben Spermienqualität basieren meist auf die physiologischen und visuelle Parameter wie Ejakulatvolumen und Konzentration, Motilität und progressive Motilität und Morphologie der Spermien und Lebensfähigkeit. Keiner dieser Bewertungen ist jedoch gut genug, um die Qualität des Spermas vorherzusagen. Da die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Spermien und potenzielle Befruchtung Membran Integrität und intrazellulären Funktionalität abhängt, könnte Bewertung dieser Parameter eine bessere Vorhersage der Spermien Befruchtung Kompetenz ermöglichen. Hier beschreiben wir drei machbare Methoden zur Beurteilung der Spermienqualität mit spezifischen fluoreszierende Sonden kombiniert mit Fluoreszenz-Mikroskopie oder Flow-Zytometrie-Analysen. Analysen beurteilt Plasmamembran Integrität mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und Propidium Jodid (PI), acrosomal Membran Integrität mit Fluorescein erfolgt konjugiert Pisum Sativum Agglutinin (FITC-PSA) und Mitochondrien-Membran Integrität mit 5, 5', 6, 6'-Tetra-Chloro-1, 1', 3, 3'-Tetraethylbenzimidazolyl Carbocyanine Jodid (JC-1). Kombinationen dieser Methoden werden ebenfalls vorgestellt. Zum Beispiel kombinierten Einsatz von annexin V mit PI Fluorochromes ermöglicht Apoptose Bewertung und Berechnung des apoptotischen Spermien (Apoptose-Index). Wir glauben, dass diese Methoden, die bei der Prüfung der Samenzelle Membranen basieren, sehr nützlich für die Bewertung der Qualität der Spermien sind.

Abbildung 1 zeigt simultan fluorimetrischen Beurteilung der Spermien Membranen (Plasma, acrosomal und Mitochondrien) mithilfe von PI, DAPI, FITC-PSA und JC-1. Beurteilung der Spermien Membranen mit gleichzeitiger Färbung mit vier fluoreszierende Sonden ermöglicht beispielsweise Bewertung des Anteils der Spermien in den einzelnen Kategorien – Leben vs. tot; hohe vs. niedrige ΔΨm; intakte Vs. Akrosom beschädigt – gleichzeitig für jede...

Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zur Spermatozoan Membran Integrität, eine zelluläre Funktion verbunden mit Sperma Befruchtung Kompetenz zu bewerten. Wir beschreiben drei Techniken für die fluorimetrischen Beurteilung der Spermien Membranen: gleichzeitige Färbung mit spezifischen fluoreszierende Sonden, Fluoreszenz-Mikroskopie und erweiterte Spermien gewidmet Durchflusszytometrie. Beispiele für die Kombination der Methoden werden ebenfalls vorgestellt.

Fluorimetrischen Techniken für die Beurteilung der Spermien Membranen

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Das Ziel dieser Verfahren ist es, die Integrität der Spermienmembranen mithilfe spezifischer Fluoreszenzsonden in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrieanalyse zu bewerten. Diese Techniken könnten helfen, schlüsselhafte Fragen auf dem Gebiet der Reproduktion zu beantworten, wie die Vorhersage des Befruchtungspotenzials und die Qualität der Spermienprobe. Der Hauptvorteil dieser Techniken ist, dass sie eine präzise Auswertung mehrerer Spermienmembranen ermöglichen, von denen bekannt ist, dass sie mit dem Befruchtungspotenzial von Spermien in Verbindung gebracht werden.Die Implikationen dieser Techniken reichen bis zur Diagnose der Ejakulatqualität, da sie eine genauere Bewertung des Spermienplasmas und der Akrosomenmembranintegrität sowie des mitochondrialen Membranpotenzials ermöglicht. Um dieses Verfahren zu beginnen, erhalten Sie etwa ein bis sechs Milliliter Bullensamen in einem 15 Milliliter Rohr bei Raumtemperatur. Fügen Sie sechs Milliliter NKM-Puffer vorgewärmt auf 37 Grad Celsius zu jedem Milliliter Samen.Zentrifuge bei 600 mal g für acht Minuten. Wiederholen Sie die Zentrifugation ein- oder zweimal, bis der Überstand klar ist. Danach sollten Sie den größten Teil des Überstandes sofort entsorgen und etwa einen Zentimeter Überstand über dem Pellet zurücklassen.Lehnen Sie die Röhren vorsichtig in einem 30-Grad-Winkel im Inkubator und warten Sie 20 bis 30 Minuten, damit die Spermatozoen nach oben schwimmen können. Mit einer Mikropipette den restlichen 1 Milliliter Überstand, der nun die motile Spermatozoe enthält, vorsichtig entfernen und in eine frische 1,5-Milliliter-Röhre übertragen. Halten Sie das Sperma bei 37 Grad Celsius, bis sie einsatzbereit sind.Bereiten Sie zunächst alle erforderlichen Bestandslösungen vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes übertragen Sie 133 Mikroliter der motilen Spermatozoen in einer Konzentration von 25 Millionen Spermien pro Milliliter auf eine neue 1,5 Milliliter Tube. 17 Mikroliter der DAPI-Arbeitslösung hinzufügen und bei 37 Grad Celsius 10 Minuten brüten.Zentrifuge bei 1 000 mal g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie dem Pellet 100 Mikroliter NKM-Puffer hinzu. Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter FITC-PSA, zwei Mikroliter JC-1 und drei Mikroliter PI hinzu. Bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren.Zentrifuge bei 1 000 mal g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 40 MikroliterN NKM-Puffer wieder auf. Dann 10 Mikroliter der Probe auf eine Glasrutsche übertragen.Verschmieren Sie die Probe, und fügen Sie einen Deckzettel hinzu. Danach beginnen Sie sofort mit der Visualisierung der Probe durch Epifluoreszenzmikroskopie mit einem 40-fachen Objektiv und einem Dreifachfilter, wie im Textprotokoll beschrieben, mit einer Digitalkamera, um ein separates Bild für jeden Filter zu erfassen. Verwenden Sie die Seriendruckoption in der Kamerasoftware, um die drei von den Filtern empfangenen Bilder zusammenzuführen und die neue Datei im JPEG-Format zu speichern.Öffnen Sie das zusammengeführte Bild mit dem Malwerkzeug und verwenden Sie die Pinseloption, um die gezählte Spermatozoe zu markieren. Als nächstes klassifizieren Sie die Spermatozoen basierend auf der fluoreszenz emittierten Fluoreszenz von jeder Sonde, um sicherzustellen, dass mindestens 200 Spermatozoen pro Folie ausgewertet werden. Alle Zellen sollten aus der DAPI blau angezeigt werden.Zählen Sie die abgestorbenen Zellen, die violett erscheinen, um die Lebensfähigkeit zu bewerten. Verwenden Sie dann die Muster der Fluoreszenzfärbung, um den Akrosomenstatus zu bewerten. Abschließend, bewerten Sie das mitochondriale Membranpotenzial, indem Sie die Spermatozoen mit hohem mitochondrialen Membranpotential unterscheiden, die ein rot gefärbtes Mittelstück von der Spermatozoen mit niedrigem mitochondrialen Membranpotenzial aufweisen, die ein grün gefärbtes Mittelstück aufweisen.Zählen Sie rote und grüne Mittelstücke separat und berechnen Sie ihr Verhältnis. Um die Plasmamembranintegritätsbewertung zu beginnen, nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Brunnen aus dem Lebensfähigkeits- und Konzentrationskit. Übertragen Sie die Brunnen auf die Arbeitsbasis und bedecken Sie sie mit einem flexiblen Deckel, um sie vor Licht zu schützen.Fügen Sie 199 Mikroliter gepufferte Lösung für Zytometrie zu jedem Brunnen hinzu. Dann fügen Sie einen Mikroliter homogenen Samen in einer Konzentration von 57 Millionen Zellen pro Milliliter zu jedem Brunnen und homogenisieren durch Pipettieren. Bedecken Sie die Platte mit dem Deckel und brüten bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten.Führen Sie anschließend die Probe mithilfe der Lebensfähigkeitseinstellung durch das Durchflusszytometer. Um mit der Bewertung des mitochondrialen Membranpotentials zu beginnen, nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Brunnen aus dem mitochondrialen Aktivitätskit heraus. Übertragen Sie sie an die Arbeitsbasis.Fügen Sie 10 Mikroliter absolutes Ethanol in jeden Brunnen und verwenden Sie eine Pipette, um das Pulver im Brunnen wieder aufzuhängen. 190 Mikroliter PBS pro Brunnen hinzufügen und durch Pipettieren homogenisieren. Fügen Sie 0,75 Mikroliter homogenen Samens mit einer Konzentration von 57 Millionen Zellen pro Milliliter zu jedem Brunnen hinzu und homogenisieren Sie ihn durch Pipettieren.Bedecken Sie die Platte mit dem Deckel und brüten bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Führen Sie anschließend die Probe durch das Durchflusszytometer mit der Einstellung für die mitochondriale Aktivität. Um mit der Bewertung der akrosomalen Membranintegrität zu beginnen, nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Brunnen aus dem Machbarkeits- und Akrosomenintegritätskit heraus.Übertragen Sie die Brunnen auf die Arbeitsbasis und bedecken Sie sie mit einem flexiblen Deckel, um sie vor Licht zu schützen. Fügen Sie 200 Mikroliter gepufferte Lösung für Zytometrie zu jedem Brunnen. Dann fügen Sie 0,7 Mikroliter homogenen Samen sinieren mit einer Konzentration von 57 Millionen Zellen pro Milliliter zu jedem Brunnen und homogenisieren durch Pipettieren.Bedecken Sie die Platte mit dem Deckel und brüten Bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten. Führen Sie anschließend die Probe mithilfe der Einsichtseinstellung durch das Durchflusszytometer. In dieser Studie wird die Samenqualität mit verschiedenen Techniken bewertet, von denen eine Spermienmembranen mit fluorometrischen Sonden bewertet.Es ist möglich, die Unterschiede in der Qualität der Spermienprobe in Bezug auf die Membranintegrität zu bewerten. Zum Beispiel hatte das Ejakulat von Bullen Nummer sieben einen relativ niedrigen Prozentsatz abgestorbener Zellen, einen geringen Anteil an Spermien mit pseudo-reagiertem Akrosom und ein höheres mitochondriales Membranpotenzial im Vergleich zum Ejakulat von Stier Nummer eins. Die Proben werden dann auf Ihre Lebensfähigkeit und mitochondriale Aktivität untersucht.Die Histogramme für diese repräsentativen Beispiele stellen die ungebiose Spermatozoe und Trümmer und die gated spermatozoa dar. Diese Histogramme stellen auch die lebensfähigen und abgestorbenen Zellen und die Verteilung von Spermatozoen auf polarisierte und depolarisierte mitochondriale Membran dar. Die Akrosomenintegrität wird dann mit einem gebrauchsfertigen Kit ausgewertet und mit Durchflusszytometrie gelesen, wobei der Bereich in drei Markerbereiche unterteilt wird, die vernachlässigbare niedrige Fluoreszenzzellen mit intakten, nicht befleckten Akrosomzellen, niedrig fluoreszierenden Zellen mit Restfärbung des Akrosoms und hochfluoreszierenden Zellen mit gestörtem Akrosom darstellen.Beim Versuch dieser Verfahren, Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die erste Spermienprobe richtig vorzubereiten. Diese Techniken können Einblicke in die Bewertung der Spermienqualität geben und können auf verschiedene Organismen wie Rinder, Geflügel und Menschen angewendet werden. Ein Vergleich zwischen den beiden Techniken, vierfache Färbung und Durchflusszytometrie zeigte keine signifikanten Unterschiede in Derkotolierung, mitochondriale Membranpotenzial, und die Akrosome-Integrität zeigt, dass die beiden Techniken matching Ergebnisse produziert.

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Fluorimetrischen Techniken für die Beurteilung der Spermien Membranen

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