Name: Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Lernen Sie die extrazelluläre Flux-Analyse zur Messung von Glykolyse und oxidativer Phosphorylierung in explantiertem Mäusenetzgewebe. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Beurteilungen des Energiestoffwechsels unter pharmakologischen Bedingungen.

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Wir danken Dr. Alexander Kolesnikov und Dr. Vladimir Kefalov für die Bereitstellung von Gnat1/ -Mäuse, für hilfreiches Feedback und Beratung, und das Manuskript zu lesen.
Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH EY025269 (RR), der Diabetes Research Center an der Washington University - NIH DK020579 (JRM und RR), ein Career Development Award von der Forschung zu verhindern, dass Blindheit (RR), der Horncrest Stiftung (RR), ein Career Development Award von JDRF ( JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) und DK114233 (JRM).

Protokolle folgte der Association for Research in Vision und Augenheilkunde-Anweisung für die Nutzung von Tieren und von der Washington University angenommen wurden.
(1) tierische Vorbereitung
<ol><li>Halten Sie Tiere in Standardgehäuse mit 12 Stunden dunkel bis 12 Stunden Licht-Zyklus. Begin Experimente an standardisierten Zeiten zu vermeiden circadiane Effekte in der Regel am Morgen kurz nach Lichter eingeschaltet sind.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Lösung
<ol><li>Bereiten Sie base Medien durch Auflösen von 8,4 mg pulverförmige Medien in bidestilliertem H2O (DdH2O) und pH auf 7,4 mit HCl oder NaOH einstellen, zu einem Endvolumen von 1 L. Filter sterilisieren diese Lösung mit einem 0,22 µm Gewebekultur Filter.<ol>
<li>Fügen Sie 1 M Glukose und 100 mM Natrium Pyruvat zu den Medien zu Endkonzentrationen von 5 mM Glucose zu erreichen und 1 mM Pyruvat.</li>
		<li>Ort eine 50 mL Aliquot der Basis Medien in einem 37 ° C-Wasserbad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifizierung der Gewebe am Ende der Flux-Analyse durch Zugabe von Tris-base, 10 mM, Polyethylenglykol Tert-Octylphenyl Äther auf 0,2 % (V/V) und EDTA, 1 mM, alle in DdH2O. mischen, bis alle Komponenten vollständig aufgelöst und passen bereiten Sie Lyse Lösung vor pH bis 8.0.</li>
	<li>Bereiten Sie für das Protokoll mitochondrialer Stress ein 11 µM-Lager von Oligomycin, ein ATP-Synthase-Inhibitor, aufgelöst in base Medien auf eine Endkonzentration von 1 µM im Brunnen. Bereiten Sie einen 11 µM Vorrat an Carbonyl Zyanid - 4-(Trifluoromethoxy) Phenylhydrazone (FCCP), ein abkoppeln Agent in base Medien, eine Endkonzentration von 1 µM im Brunnen Ziel aufgelöst. Bereiten Sie einen Cocktail der Elektronentransport-Kette-Inhibitoren, Rotenon und Antimycin A (RAA) durch Zugabe von Rotenon bis 11 µM und Antimycin A bis 22 µM, aufgelöst in base Medien auf eine Endkonzentration von 1 µM Rotenon und 2 µM Antimycin A in das gut.</li>
	<li>Bereiten Sie für die Glykolyse Protokoll 220 mM Lager in base Medien, um eine Endkonzentration von 20 mM in den Brunnen Ziel gelöster Glukose. Auch bereiten Sie ein 1,1 M Lager 2-Deoxyglucose (2-DG), als kompetitiver Inhibitor von Glukose und glykolytische Antagonist, durch Auflösen in base Medien. Dies wird eine Endkonzentration von 100 mM 2-DG in der gut ausgerichtet sein.</li>
</ol>3. Kalibrierung
<ol><li>Um die Instrumentierung für eine extrazelluläre Flux-Assay zu kalibrieren, fügen Sie 1 mL der Kalibrierlösung in jede Vertiefung der Sensorkassette (insgesamt 24 Vertiefungen) und Inkubation bei 37 ° C in einer CO2-frei Inkubator über Nacht (oder mindestens 8 Stunden).</li>
	<li>Laden Sie Additive für die mitochondriale Stress-Protokoll oder das Protokoll Glykolyse in jeder Injektor Port A bis D, auf der Sensorkassette, bereinigt um Volumenänderungen im Brunnen. Hinweis: Beispielsweise würde ein typische Assay gehören 45 µL eines Zusatzstoffes in der erste Injektor-Port, 49,5 µL in die zweite, 54,5 µL in der dritten und 60 µL in den letzten gut Anfangslautstärke von 450 µL vorausgesetzt.</li>
	<li>Während der ersten mehrere Experimente laden Sie base Medien in Port A zu beurteilen, wie viel Gewebe Bewegung/Artefakt nach einer Port-Injektion erfolgt.</li>
	<li>Lassen Sie die geladenen Sensorplatte bei 37 ° C in einem nicht-CO2 -Inkubator für mindestens 60 min inkubieren.</li>
</ol>4. Isolierung von Netzhautgewebe frische Maus
Hinweis: Dieser Schritt ist von der Technik von Dr. Barry Winkler15angepasst.
<ol><li>Nach der Verabreichung Tiefe Narkose mit einem standard Ketamin/Xylazin-Cocktail, einschläfern Sie Mäuse durch zervikale Dislokation.</li>
	<li>Verwenden Sie ein paar mittlere gebogene Pinzetten, fassen Sie den hinteren Globus auf den Sehnerv und sanft nach vorne Druck auf Proptose des Auges (Abbildung 1A).<ol>
<li>Erstellen Sie mit einer sauberen Rasierklinge einen Limbus, Limbus-Schnitt in die Hornhaut mit einem einzigen, absichtliche Pass der Klinge.</li>
		<li>Mit feinen, Kneifen abgewinkelte McPherson-Stil Zangen den hinteren Globus, die Objektiv und vorderen hyaloid Membranen aus der Hornhaut Schnitt auszudrücken. Entsorgen Sie diese Gewebe.</li>
		<li>Wiederholen Sie das Kneifen Manöver mit der Pinzette die neuronale Netzhaut zum Ausdruck bringen.</li>
		<li>Mit der Zange wie ein Löffel auf die Netzhaut zu heben, anstatt, das Gewebe zu erfassen, die Netzhaut von der Hornhaut Schnitt und direkt in warmen Medien in einer 3-cm-Schüssel oder eine 6-Well-Zellkultur-Cluster-Platte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie zwei Paare von feinen, gewinkelte McPherson-Stil Zange sanft verbleibenden Glaskörpers von der Netzhaut zu sezieren. Dies geschieht am besten durch den Glaskörper an der Peripherie der Netzhaut Cup greifen und ziehen in Richtung Zentrum, mit einer endgültigen Disinsertion des Glaskörpers von der Mitte als Ganzes. Mit der Pinzette, entfernen Sie alle verbleibenden retinalen Pigmentepithels von der Oberfläche der Photorezeptoren der Netzhaut.<ol>
<li>Schneiden Sie eine P1000 Pipettieren Spitze mit einer Rasierklinge zum Erstellen einer ~ 4 mm Öffnung um unnötige Trauma auf die empfindliche Netzhaut-Gewebe während der Übertragung Manöver zu verhindern.</li>
		<li>Übertragen Sie die isolierten Netzhautgewebe in frische Medien mit einer geschnittenen P1000 Pipettieren Spitze.</li>
		<li>Schneiden Sie 1 mm Schläge der Netzhaut um den Sehnerv mit einem 1 mm-Biopsie Punsch mit einem Kolben ausgestattet, um das Gewebe zu verdrängen, für den Fall, dass sie in die Bohrung (Abbildung 1 b) erhoben wird. Legen Sie die Netzhaut Schläge beiseite in sauberen Medien auf einem Block 37 ° C gehalten oder Heizkissen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Test-Protokoll
<ol><li>Übertragen Sie einzelne Schläge auf einer 24-Well Inselchen Erfassung Mikrotestplatte mit einer geschnittenen P1000 Spitze, Absaugen von 450 µL der Medien zusammen mit dem Gewebe.</li>
	<li>Verwenden Sie fein, gerade Pinzette sanft Schläge in die Mitte der Mikrotestplatte manipulieren. Halten Sie die Schläge in die gleiche Richtung (z.B. Ganglion Zelle Seite nach oben) ausgerichtet.<ol>
<li>Ruhen Sie die Capture-Platte auf ein Heizkissen oder Heizung Block auf 37 ° C eingestellt, da diese Schritte für die restlichen Proben wiederholt werden. Hinweis: Für jedes Experiment beiseite 3-4 leere Brunnen mit 450 µL base Medien als negative Kontrollen dienen. Testen Sie in den verbleibenden 20-21-Brunnen jede biologische replizieren in dreifacher Ausfertigung. Daher wird jede 24-Well-Platte für die Aufnahme von 6-7 verschiedene Tiere oder Behandlungsbedingungen erlauben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vermeidung von Luftblasen, sanft Position die Insel Mesh-Einsätze in jeder gut mit Pinzette zu erfassen und die Einsätze zu sichern, mit einem metallischen Kolben oder mit geschnittenen P1000 Pipettieren Spitze (Abb. 1 C). Hinweis: Vermeiden Sie übermäßige Gewebe Bewegung während dieses Schrittes, retinale Lochposition in der Mitte der Probe Microchamber beizubehalten. Luftblasen verfälschen stark OCR Lesungen. Obwohl die Microchamber ausreichende Tiefe, typische Maus Netzhaut (Abbildung 1) unterzubringen ist, verursachen gelegentlich Bearbeitung-Fehler in der Mesh-Einsätze Gewebe zu übermäßig beim Bildschirm einfügen komprimiert werden. In diesem Fall einfach notieren Sie das zerkleinerte Gewebe und letzten Endes schließen Sie dieser Probe aus.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Gewebe-Platte in einem 37 ° C CO2-frei Inkubator für mindestens 60 min..</li>
	<li>Programm den extrazellulären Flux-Analyzer mit Mix, warten, Maßnahme, und wiederholen Sie Befehle. Als Beispiel, ein typisches Experiment mit Netzhautgewebe kann Folgendes beinhalten: Mischen Sie 2 Minuten, warten Sie 2 Minuten und 5 Minuten zu messen. Wiederholen Sie das Experiment mit diesen drei zwischen Schritten 5-8 Mal (Zyklen) für eine Aufnahme der Grundlinie und nach Injektion von jeder Verbindung getestet während des Laufs.</li>
	<li>Drücken Sie die Programm-START-Taste auf der extrazellulären Flux-Analyzer und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Sensor-Steckmodul für Kalibrierung einfügen.</li>
	<li>Am Ende der Kalibrierung befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Platte mit der Netzhaut Proben die Kalibrator Platte ersetzen.</li>
	<li>Lassen Sie das Programm ausführen, wie programmiert. Am Ende des Laufs befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Gewebe-Platte auswerfen. Zeigen Sie die Ergebnisse des Laufes und speichern Sie die Datei zu.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einem gebogenen 20 Gauge-Nadel und Pinzette alle Mesh-Einsätze aus dem Brunnen, den Netzhaut Stempel hinterlassen.</li>
	<li>Vorsichtig aspirieren Sie die Medien aus dem Gewebe und waschen Sie das Gewebe zweimal mit 0,5 mL kalte Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Aspirieren Sie die PBS, nach dem Waschen.</li>
	<li>Jeder Brunnen und Pipettieren rauf und runter, um Gewebe zu homogenisieren fügen Sie 100 µL der Lyse Puffer hinzu.</li>
	<li>Quantitate basierend auf insgesamt doppelsträngige DNA (DsDNA) oder Gesamtproteingehalt Eingangspegel. Hinweis: Folgendes basiert auf einem handelsüblichen DsDNA-Assay.</li>
	<li>Lysierten Proben 1:1 durch Zugabe von 100 µL Tris-EDTA (TE)-Puffer verdünnen und 100 µL der verdünnten Probe auf einer 96-well-Platte übertragen.<ol>
<li>Fügen Sie 100 µL der Detektionspuffer in jede Vertiefung. Nach dem Mischen für 2-5 Minuten, quantitate Fluoreszenz nach Anregung bei 480 nm und Emission bei 520 nm, im Vergleich zu einer standard-Kurve.</li>
		<li>Die rohen extrazelluläre Flux-Tracing auf DNA-Gehalt in den Brunnen zu normalisieren. Hinweis: In der hier vorgestellten Ergebnisse sind Proben auf 50 ng DsDNA - eine typische Menge in einen 1 mm retinalen Schlag normalisiert. Daher kann Absolute Werte, die hier vorgestellten Studien, die Darstellung von Daten "Pro Retina Punch" verglichen werden. Normalisieren Sie Kurven mit einem internen Standard, wie die Basislinie laufen bei einer Glukosekonzentration von 5 mM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+the+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+and+brain%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye and brain. 2, 99-116 (2010).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+rabbit+retina+as+related+to+function%3A+high+cost+of+Na%2B+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li>
<li>Wubben, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+metabolic+reprogramming+provides+survival+advantage+in+acute+stress+while+causing+chronic+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration.</a> Scientific reports. 7 (1), 17863(2017).</li>
<li>Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Metabolism+in+the+Intact+Retina+Using+Stable+Isotope+Tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers.</a> Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).</li>
<li>Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Combined+Retinal+Vascular+and+Tissue+Oxygen+Tension+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging.</a> Scientific reports. 7 (1), 10622(2017).</li>
<li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%2C+lactate%2C+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li>
<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+and+oxidative+metabolism+in+relation+to+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+physiology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function.</a> The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).</li>
<li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).</li>
<li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li>
<li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li>
<li>Pearsall, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARalpha+is+essential+for+retinal+lipid+metabolism+and+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biology%22%5BJournal%5D)">PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival.</a> BMC biology. 15 (1), 113(2017).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of visualized experiments. (46), (2010).</li>
<li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroretinogram+of+the+isolated+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+research%22%5BJournal%5D)">The electroretinogram of the isolated rat retina.</a> Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).</li>
<li>Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+proton+and+electron+leaks%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial proton and electron leaks.</a> Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+Influences+Metabolic+Flux+and+Nucleotide+Metabolism+in+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

OCR und ECAR werden ohne weiteres in explantierten Netzhautgewebe mit einem Bioanalyzer mit den beschriebenen Techniken gemessen. Diese Methode weicht von denen anderer Gruppen in mehreren kritischen Schritten. Retinalen Gewebe sind durch einen großen Hornhaut Schnitt isoliert ohne enucleating der ganzen Welt, wie ursprünglich von Winkler15beschrieben. Diese Methode der Netzhaut Isolierung ermöglicht eine schnelle Übertragung von lebenden Auge in die Gewebe-Capture-Platte (oft innerhalb von 5 Minu...

Die Netzhaut gehört zu den anspruchsvollsten Energie Geweben in das zentrale Nervensystem1. Wie den meisten Geweben generiert es Adenosintriphosphat (ATP) über Glykolyse im Zytosol oder durch Oxidative Phosphorylierung in den Mitochondrien. Der energetische Vorteil Oxidative Phosphorylierung über Glykolyse ATP aus einem Molekül Glucose herzustellen ist klar: 36 Moleküle ATP generiert aus der ehemaligen vs 2 Molekülen ATP aus letzterer erzeugt. Entsprechend, Netzhaut Neuronen hängen in erster Linie mitochondriale Atmung für Energieversorgung und dies spiegelt sich durch ihre hohe Dichte der Mitochondrien2. Allerdings stützt sich die Netzhaut auch auf glykolytischen Maschinen auch wenn Sauerstoff reichlich vorhanden ist. Dieser Prozess der aeroben Glykolyse wurde ursprünglich in Krebszellen durch Otto Warburg3, der einmal darauf hingewiesen, dass die Netzhaut nur Post-mitotische Gewebe in der Lage, diese Form der Stoffwechsel4beschrieben. Seit dieser ersten Beobachtungen sind viele Post-mitotische Gewebe beschrieben worden, um in unterschiedlichem Ausmaß der Glykolyse neben Oxidative Phosphorylierung zu engagieren, um ihre ATP-Anforderungen zu erfüllen.
Phototransduction, recycling, Sehpigment Biosynthese der Photorezeptor Außensegmenten und synaptische Aktivität sind alle anspruchsvollen Energieprozesse in Photorezeptoren, die vorherrschende neuronalen Unterklasse in der Netzhaut. Aber die Notwendigkeit, aktiv Ionen gegen ihre elektrischen und Konzentration Steigungen zu transportieren ist bei weitem die meisten energetisch raubender Prozess in Neuronen1. Photorezeptoren sind eigentümliche Neuronen in dem Sinne, dass sie in Ermangelung der Stimulation (d. h. im Dunkeln), depolarisiert werden während ein Lichtreiz Kanal Schließung und anschließende Hyperpolarisation auslöst. Daher im Dunkeln verbraucht die Netzhaut große Mengen an ATP zur Aufrechterhaltung seiner Depolarisation oder "Dunkelstrom", wie es gewöhnlich genannt wird. Aus Sicht der adaptiven ist eine große Herausforderung bei der Versorgung dieser Unmengen von ATP die Notwendigkeit für Organismen, visuellen Klarheit durch die optische Achse beizubehalten. Die umgekehrte Netzhaut Architektur in modernen Kreaturen gesehen ist die dominante Lösung, da hält es die dichten Kapillarnetzes Versorgung Photorezeptoren vom Weg des Lichts. Aber dieses Wunderwerk der Natur Bioengineering die Netzhaut am Abgrund in Bezug auf die metabolische Reserve. Auch kleine Beleidigungen der Netzhaut können potenziell stören das empfindliche Gleichgewicht der Energie-Angebot und Nachfrage, und visuellen Dysfunktion oder offene Blindheit kann schnell erfolgen.
Angesichts der einzigartigen energetischen Anforderungen der neuronale Netzhaut, gepaart mit seiner engen Beschränkung der Gefäßversorgung, hätte genaue Messung des ATP-Verbrauch in der Netzhaut und seine Veränderungen während der Krankheit tiefgreifende Auswirkungen bei Verständnis und Behandlung von blendende Voraussetzungen wie Retinitis Pigmentosa und diabetische Retinopathie. Traditionell, erfordern diese Messungen kostspielig, speziell angefertigte Geräte mit den meisten Studien aus einer Handvoll von Laboratorien, die ausschließlich mit Messungen der metabolische Aktivität2,5,6, 7,8. Techniken umfassen einzelne Assays für die spezifischen Metaboliten, Tracer-Studien mit Radio-markierten Vorstufen, Sauerstoffverbrauch Aufnahme mit Clark Elektroden und Metabolomic Profilerstellung9.
Mit Fortschritten im Hochdurchsatz-Technologie und eine höhere Verfügbarkeit von kommerziellen Geräten sind Techniken zur Aufzeichnung retinalen Stoffwechsel immer zugänglich und erschwinglich. Die hier beschriebene Methode misst sowohl Oxidative Phosphorylierung und Glykolyse in der Netzhaut mit isolierten Gewebe und einen handelsüblichen extrazelluläre Flussmittel Analyzer9,10,11,12. Dieser Analysator zeichnet separat Sauerstoff-Verbrauch (OCR) und die extrazelluläre Übersäuerung Rate (ECAR), dient als indirekte Indikatoren für die Oxidative Phosphorylierung und Glykolyse, bzw.13. Diese Messungen erfolgt durch eine Sonde eingetaucht in ein Microchamber über das Gewebe von Interesse erstellt. Diese Anpassung der zuvor veröffentlichten Methoden verwendet eine Capture-Platte ursprünglich für Bauchspeicheldrüsenkrebs Langerhans-Inseln um metabolische Aktivität in kleinen, kreisförmigen Abschnitten der Maus Netzhaut aufzuzeichnen. Pharmakologische Mehrfachbelichtungen können geliefert werden, das Gewebe im Laufe einer einzigen Aufnahme, weil das System gut 4 Injektion Ports für jede Probe enthält. Mit diesem System mit getrennter Protokolle für ECAR und OCR-Aufnahmen optimiert, die Reaktionen der Wildtyp Netzhaut sind vergleichbar mit Netzhaut fehlen transducin (Gnat1- / -), eine Ursache für kongenitale stationäre Nachtblindheit in Menschen-14.

<table><tbody><tr><td>Seahorse XF24 Extrazellulärer Flussmittelanalysator</td><td>Agilent, Santa Clara, Kalifornien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF24 Insel-Capture-FluxPak (enthält: Insel-Capture-Mikrotiterplatte, Sensorkartusche und Calibrant-Lösung)</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td>101174-100</td><td>Enthält Insel-Capture-Mikrotiterplatte, Sensor-Kartusche und Kalibrierlösung</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medien (pulverförmiges Medium)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R1383</td><td>RPMI 1640 Medien mit L-Glutamin und ohne Glukose oder Natriumbicarbonat</td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G8270</td><td>1M D-Glukose gefiltert, für die Medienvorbereitung</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Corning</td><td>25000CI</td><td>100 mM Natriumpyruvat</td></tr><tr><td>Antimycin-A</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A8674</td><td>Mitochondriale Stressprotokollkomponente</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C2920</td><td>Mitochondriale Stressprotokollkomponente</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R8875</td><td>Mitochondriale Stressprotokollkomponente</td></tr><tr><td>2-Desoxyglucose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D6134</td><td>Glykolyseprotokollkomponente</td></tr><tr><td>1 mm Hautbiopsiestempel mit Kolben</td><td>Integra-Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td>Explantierendes Netzhautgewebe</td></tr><tr><td>Werkzeug Dumont Mini-Pinzette Gerade</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td>11200-10</td><td>Explantation von Netzhautgewebe</td></tr><tr><td>Dumont Medical #5/45 Pinzette - Abgewinkelt 45 Grad</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-25</td><td>Explantation von Netzhautgewebe</td></tr><tr><td>Tool Dumont #7 Pinzette - Gebogen</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td>Explantation von Netzhautgewebe Tool</td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>P7589</td><td>Ladenormalisierungsassay</td></tr><tr><td>Trizma-Base (Tris-Base)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T6066</td><td>Bestandteil des Lysepuffers</td></tr><tr><td>Triton X-100 (Polyethylenglykol tert-octylphenylether)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>X100</td><td>Bestandteil des Lysepuffers</td></tr><tr><td>0,5M EDTA pH 8,0</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td>Bestandteil des Lysepuffers</td></tr><tr><td>C57BL/6J Mäuse&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>&nbsp; Stamm 000664</td><td>Tiere</td></tr><tr><td>Gnat1-/- und Hintergrund-angepasster Gnat1+/+&nbsp;</td><td>Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of</td><td>Medicine Tiere</td><td></td></tr></tbody></table>

messung des energiestoffwechsels in explantierten netzhautgewebe extrazelluläre flux-analyse

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Hohe Schärfe Vision ist ein stark energieverbrauchender Prozess, und die Netzhaut hat mehrere einzigartige Anpassungen um genau solche Anforderungen unter Beibehaltung der Transparenz von der Sehachse entwickelt. Störungen auf dieses empfindliche Gleichgewicht führen blendende Erkrankungen wie diabetische Retinopathie. Daher ist das Verständnis Energie-Stoffwechsel-Veränderungen in der Netzhaut bei Erkrankung zwingend notwendig, um die Entwicklung rationaler Therapien für verschiedene Ursachen von Vison Verlust. Den letzten Aufkommen von handelsüblichen extrazelluläre Flussmittel Analysatoren hat die Untersuchung der Netzhaut Energiestoffwechsel zugänglicher gemacht. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung solch eines Analyzers, Beiträge zur Netzhaut Energieversorgung durch seine zwei Prinzip Arme - Oxidative Phosphorylierung und Glykolyse - messen durch Quantifizierung von Steuersatzänderungen Sauerstoff Verbrauch (OCR) und extrazellulären Versauerung Preise (ECAR) als Stellvertreter für diese Wege. Diese Technik ist ohne weiteres in explantierten Netzhautgewebe, Erleichterung der Bewertung der Antworten auf mehrere pharmakologische Wirkstoffe in einem einzigen Experiment durchgeführt. Metabolische Signaturen in Netzhaut von Tieren fehlt Stab Photorezeptor Signalisierung sind im Vergleich zu Wildtyp Steuerelemente, die mit dieser Methode. Eine große Einschränkung bei dieser Technik ist die mangelnde Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Licht angepasst und angepassten Energieausnutzung, einen wichtigen physiologischen Gesichtspunkt Netzhautgewebe.

Netzhaut Explantaten von 8 Wochen alten Wildtyp (WT) Mäusen wurden mit den beschriebenen Techniken (zusammengefasst in Abbildung 1), im Vergleich zu Alter und Hintergrund abgestimmt transducin null Mäuse (Gnat1- / -). Weil Gnat1- / - Tiere die Maschinerie, in der Nähe fehlt zyklische Nukleotid gated Ionenkanäle in Reaktion auf Lichtreize, ihre Rute Photorezeptoren bleiben auch in leichten14</s...

Dieses Verfahren beschreibt Echtzeit Aufnahme von Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung Preise in explantierten Maus retinalen Gewebe mit einer extrazellulären Flux-Analyzer.

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, wie energiestoffwechsel im Netzhautgewebe unterscheidet sich zwischen biologischen Proben, oder nach der Exposition gegenüber pharmakologischen Mitteln. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie explantiertes organotypisches Netzhautgewebe nutzt, um die Raten sowohl der Glykolyse als auch der oxidierten Phosphorylierung zu messen und die Beurteilung von Echtzeitinterventionen in vitro ermöglicht. Um die Instrumentierung für einen extrazellulären Flusstest zu kalibrieren, fügen Sie zunächst einen Milliliter Kalibrierlösung zu jedem Brunnen der 24 Well-Sensorpatrone hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem Co2-freien Inkubator über Nacht.Belasten Sie Additive für das mitochondriale Spannungsprotokoll oder das Glykolyseprotokoll in jeden Injektoranschluss der Sensorpatrone, um Volumenänderungen im Brunnen einzustellen. Bei einem anfänglichen Brunnenvolumen von 450 Mikrolitern würde ein typischer Test 45 Mikroliter eines Additivs in den ersten Injektoranschluss, 49,5 Mikroliter in den zweiten, 54,5 Mikroliter in den dritten und 60 Mikroliter in den letzten enthalten. Während der ersten Experimente, Laden Basismedium in Port A, um zu messen, wie viel Gewebebewegung Artefakt nach einer Port-Injektion auftritt.Lassen Sie die geladene Sensorplatte mindestens 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Nicht-Co2-Inkubator brüten. Beginnen Sie die Isolierung von frischem Maus-Retinagewebe mit einer frisch eingeschläferten Maus. Verwenden Sie ein Paar mittelgroße gekrümmte Zangen, um den hinteren Globus am Sehnerv zu erfassen, und ziehen Sie sanft Vorwärtsdruck an, um das Auge zu stützen.Mit einer sauberen Rasierklinge, erstellen Sie einen Limbus zu Limbus Schnitt über die Hornhaut mit einem einzigen, absichtlichen Pass der Klinge. Mit fein abgewinkelten McPherson-Zangen, kneifen Sie die hintere Kugel, um die Linse und vordere Hyloidmembranen aus dem Hornhautschnitt auszudrücken. Wiederholen Sie das Kneifmanöver mit Zangen, um die neuronale Netzhaut auszudrücken.Dann verwenden Sie die Zange wie ein Löffel, um die Netzhaut weg von der Hornhauteinschnitt zu heben. Legen Sie die Netzhaut direkt in das warme Medium in einer drei Zentimeter großen Schale oder einer sechs Brunnengewebe-Kultur-Clusterplatte. Als nächstes verwenden Sie zwei Paare von fein abgewinkelten McPhersons Style Zangen, um die verbleibenden Glaskörper sanft von der Netzhaut zu sezieren.Dies geschieht am besten, indem man den Glaskörper an der Peripherie des Netzhautbechers erfasst und in Richtung Zentrum zieht, mit einer endgültigen Disinsertion des Glaskörpers aus dem Zentrum als Ganzes. Entfernen Sie dann alle verbleibenden retinalen Pigmentepithel von der Photorezeptoroberfläche der Netzhaut. Schneiden Sie eine P1000 Pipettenspitze mit einer Rasierklinge, um eine ungefähre Öffnung von vier Millimetern zu schaffen, um ein ungebührliches Trauma des empfindlichen Netzhautgewebes bei Transfermanövern zu verhindern.Dann verwenden Sie die geschnittene Pipettenspitze, um das isolierte Netzhautgewebe in ein frisches Medium zu übertragen. Schließlich verwenden Sie einen ein Millimeter Biopsie-Punch mit einem Kolben ausgestattet, um Schläge der Netzhaut um den Sehnerv zu schneiden. Stellen Sie die Netzhautschläge in sauberem Medium beiseite, halten Sie auf einem 37 Grad Celsius Block oder Heizkissen.Sobald die gewünschte Anzahl von Schlägen gesammelt wurde, verwenden Sie die süße P1000-Spitze, um einen individuellen Stempel in 450 Mikrolitern Medium zu aspirieren, und übertragen Sie ihn auf eine 24 well ösen Capture Mikroplatte auf einem 37 Grad Celsius Heizpad oder Wärmeblock. Verwenden Sie feine, gerade Zangen, um Schläge in die Mitte der Mikroplatte sanft zu manipulieren. Halten Sie Schläge in die gleiche Richtung orientiert.Zum Beispiel mit der Ganglienzellseite nach oben. Für jedes Experiment beiseite drei bis vier leere Brunnen mit 450 Mikroliter Basismedium als Negativkontrollen dienen. Unter Vermeidung von Luftblasen oder übermäßiger Bewegung, positionieren Sie die Ösen sanft Die Mesh-Einsätze in jedem Brunnen, und sichern Sie die Einsätze mit einem Metallkolben oder mit einer geschnittenen P1000 Pipettenspitze.Obwohl die Mikrokammer über eine ausreichende Tiefe verfügt, um die typische Mausnetzhaut aufzunehmen, führen gelegentlich Maschinendefekte in den Netzeinsätzen dazu, dass Gewebe während des Einsetzens des Bildschirms übermäßig komprimiert werden. Wenn dies geschieht, notieren Sie sich einfach dieses zerkleinerte Gewebe und schließen Sie diese Probe von der endgültigen Analyse aus. Inkubieren Sie die Gewebeplatte in einem 37 Grad Celsius kohlendioxidfreien Inkubator für mindestens 60 Minuten.Programmieren Sie den zusätzlichen Zellflussanalysator mit Mix-, Gewichts-, Mess- und Wiederholungsbefehlen. Ein typisches Experiment mit Netzhautgewebe kann beispielsweise Folgendes umfassen. Zwei Minuten mischen, zwei Minuten warten und fünf Minuten messen.Wiederholen Sie das Experiment mit diesen drei Schritten zwischen fünf und acht Mal für die Basislinienaufzeichnung und nach der Injektion jeder getesteten Verbindung. Drücken Sie die Starttaste des Programms am extrazellulären Flussanalysator, und befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Sensorpatrone zur Kalibrierung einzulegen. Befolgen Sie am Ende der Kalibrierung die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Kalibrierplatte durch die Platte zu ersetzen, die die Netzhautproben enthält, und lassen Sie dann das Programm wie programmiert laufen.Befolgen Sie nach Abschluss des Laufs die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Gewebeplatte auszuwerfen. Zeigen Sie die Ergebnisse der Ausführung an, und speichern Sie die Datendatei. Mit einer gebogenen 20-Meter-Nadel und Zange, entfernen Sie alle Netzeinsätze aus den Brunnen, so dass die Netzhaut Punsch hinter.Saugen Sie das Medium vorsichtig aus dem Gewebe und waschen Sie das Gewebe zweimal mit 0,5 Milliliter kaltephosphat gepufferte Saline. Nach dem Angieren der zweiten PBS-Wäsche 100 Mikroliter Lysepuffer zu jeder Wäsche und Pipette nach oben und unten hinzufügen, um Gewebe zu homogenisieren. Schließlich quantitieren Sie die Eingangswerte auf der Grundlage des gesamten Doppelsträngigen-DNA-Gehalts, indem Lysed-Proben eins zu eins mit 100 MikroliterTris-EDTA-Puffer verdünnt und 100 Mikroliter der verdünnten Probe auf eine 96-Well-Platte übertragen werden.Fügen Sie dann 100 Mikroliter Detektionspuffer zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie sie zwei bis fünf Minuten lang. Schließlich quantitieren Sie die Blütenstand nach Anregung bei 480 Nanometern und die Emission bei 520 Nanometern im Vergleich zu einer Standardkurve. Normalisieren Sie die rohe extrazelluläre Flussverfolgung zu DNA-Inhalten innerhalb des Brunnens.An der Basislinie, in Gegenwart von fünf Milli-Muller-Glukose und in Gegenwart von 10 Milli-Muller-Pyruvat, gibt es keinen signifikanten Unterschied in den Raten des sauren Efluxes, gemessen an der extrazellulären Versauerungsrate. Zwischen Netzhautgeweben von Wildtieren oder Ausstoßmäusen, denen die Maschinerie fehlt, um zyklische Nukleotid-Gated-Ionen-Kanäle als Reaktion auf leichte Reize zu schließen. Ähnliche Muster sind nach Zugabe von 20 Milli Muller Glukose und dem glykolytischen Inhibitor 2DG zu sehen.Diese Daten können mathematisch transformiert werden, um bruchstückhafte Veränderungen ab dem Ausgangswert darzustellen, ein Format, das einen besseren Vergleich zwischen verschiedenen experimentellen Interventionen ermöglichen kann. Die absolute Sauerstoffverbrauchsrate zu Beginn ist auch gleichwertig zwischen Kontrolle und mutiertem Netzhautgewebe. Die Zugabe von 20 Milli Muller Glukose erhöht die mitochondriale Atmung, aber keine Veränderung der beobachteten zwischen den Gruppen in Bezug auf absolute Quantifizierung oder in Bezug auf die Veränderung von DerAusgangsbasis.Die Zugabe von einem Milli-Muller FCCP, einem Entkopplungsmittel, um maximale mitochondriale Atemfrequenzen zu demonstrieren, erhöht OCR nicht signifikant über dem Niveau, das mit hoher Glukose in der Kontrolle und mutiertem Netzhautgewebe beobachtet wurde. Allerdings sinken die Signale beider Mäuse nach dem Zusatz des RAA-Cocktails drastisch. Abschließend zeigen wir eine Technik zur Quantifizierung der Raten der oxidierten Phosphorylierung und Glykolyse in organotypischen Explanten der Mausnetzhaut.Durch die effiziente Isolierung des Netzhautgewebes liefert die Technik zuverlässige und reproudierbare Messungen. Echtzeiteffekte von Expositionen, wie z. B. Entkopplungsmittel, können bewertet werden. Zusätzlich zu diesem Verfahren können andere Methoden, wie quantitative RTPCR und Western Blotting, auf dem überschüssigen Gewebe durchgeführt werden, das im Sezierschritt isoliert wurde, um parallele Informationen zu erhalten, die für Studien des Netzhautstoffwechsels relevant sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll bietet einen biochemischen Ansatz zur Messung der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) und der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von primären leukämischen Zellen mit einem extrazellulären Fluss-Assay. Die Beurteilung des metabolischen Profils dieser Zellen hilft, ihre Bedürfnisse zu charakterisieren, was zu einer personalisierten Therapie führt.

Extrazellulärer Flux-Assay: Eine Methode zur Messung des metabolischen Profils von Zellen

Dieses Video demonstriert die Methode zur Analyse des Energiestoffwechsels in aktivierten menschlichen NK-Zellen mit einem extrazellulären Flussanalysator. Verschiedene Inhibitoren der Elektronentransportkettenkomplexe beeinflussen die ATP-Synthese, die über die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) gemessen wird und Einblicke in den Zellstoffwechsel und die Bioenergetik gibt.

Echtzeit-Überwachung des Energiestoffwechsels in humanen NK-Zellen mit einem extrazellulären Flussanalysator

Metabolische Reprogrammierung ist ein Merkmal und eine Voraussetzung für die Polarisation von M1- und M2-Makrophagen. Dieses Manuskript beschreibt einen Assay zur Messung grundlegender Parameter der Glykolyse und der mitochondrialen Funktion in aus dem Knochenmark der Maus stammenden Makrophagen. Mit diesem Werkzeug kann untersucht werden, wie bestimmte Faktoren den Stoffwechsel und den Phänotyp des Makrophagen beeinflussen.

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Dieses Protokoll bietet eine kostengünstige Möglichkeit zu isolieren und zu charakterisieren Maus primäre renale tubuläre Zellen, die anschließend südlich kultiviert werden können, um renale biologischen Funktionen ex Vivo, einschließlich der mitochondrialen Bioenergetik zu beurteilen.

Isolierung, Charakterisierung und hohem Durchsatz extrazelluläre Flux-Analyse der Maus primäre renale tubuläre Epithelzellen

Hier beschrieben ist ein detailliertes Protokoll zur Durchführung eines mitochondrialen Stresstests und eines Glykolytika-Rate-Assays in ex vivo Netzhautgewebeproben unter Verwendung eines kommerziellen Bioanalytikers.

Bestimmung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse in Ex-vivo-Netzhautgewebeproben

Die hier vorgestellte Methode fasst optimierte Protokolle zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen (HSPCs) der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator zusammen, um die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von HSPCs in Echtzeit zu messen.

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

Diese Protokolle werden den Benutzern helfen, den mitochondrialen Energiestoffwechsel in 3D-Krebszelllinien-abgeleiteten Sphäroiden mithilfe der extrazellulären Flussanalyse von Seepferdchen zu untersuchen.

Erforschung des mitochondrialen Energiestoffwechsels einzelner 3D-Mikrogewebesphäroide mittels extrazellulärer Flussanalyse

Der Stoffwechselstatus menschlicher retinaler Pigmentepithelzellen (H-RPE) spiegelt deren Gesundheit und Funktion wider. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Untersuchung des Echtzeit-Stoffwechselflusses von H-RPE mittels hochauflösender Respirometrie vorgestellt.

Echtzeitanalyse der Bioenergetik in primären humanen retinalen Pigmentepithelzellen mittels hochauflösender Respirometrie

Hier beschreiben wir detailliert Methoden zur Extraktion von Makrophagen aus dem Knochenmark, der Milz und dem infarktierten Herzen und zur anschließenden Bestimmung des metabolischen Flusses in lebenden Zellen.

Analyse des ex vivo metabolischen Flusses in Milz- und Herzmakrophagen und Knochenmarkmonozyten

Dieses Protokoll beschreibt eine kosteneffiziente Methode zur Durchführung eines Glykolyse-Stresstests zur Quantifizierung der metabolischen Umprogrammierung in primären Maus-Mikroglia. Nach Isolierung und entzündlicher Stimulation wird die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) mit frisch hergestellten, pH-angepassten Reagenzien gemessen, gefolgt von einer Proteinnormalisierung, um eine genaue und reproduzierbare Bewertung glykolytischer Verschiebungen zu ermöglichen.

Untersuchung der Glykolyse in primären Mikroglia mittels extrazellulärem Flussassay

In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung der Sauerstoffverbrauchsrate und der extrazellulären Versauerungsrate der ex-vivo erwachsenen Zebrafischventrikel, um deren oxidative und glykolytische Stoffwechselkapazität zu charakterisieren.

Bewertung der Stoffwechselaktivität ganzer regenerierender Zebrafischventrikel ex vivo mittels eines extrazellulären Flusstests

Lernen Sie die extrazelluläre Flux-Analyse zur Messung von Glykolyse und oxidativer Phosphorylierung in explantiertem Mäusenetzgewebe. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Beurteilungen des Energiestoffwechsels unter pharmakologischen Bedingungen.

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

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