Name: Flow durchflusszytometrischen Erkennung von neu gebildeten Stammzellen-wie Brustkrebszellen nach Apoptose Umkehr (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung apoptotischer Brustkrebszellen mittels FACS zur Untersuchung der Transition zu stammzellähnlichen Zellen nach Apoptose-Umkehr. Diese Methode ermöglicht reine Zellpopulationen für Krebsforschung.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Innovative Technologie der Innovation Technologie Kassenkommission: Finanzierung Unterstützung durch den Staat Schlüssel Labor der Agrobiotechnologie (CUHK), Lo Qixi-Seong Biomedical Research Fund und Lee Hysan Foundation. Y.X. wurde von der postgradualen Zugehörigkeit aus der CUHK unterstützt.

1. Vorbereitung der Brust nicht-Stamm Krebszellen
<ol><li>Kultur MCF-7 und MDA-MB-231 Zellen in 10 mL Phenol Rotfrei-Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) in einer 100 mm Schale ergänzt. Kultur T47D in 10 mL Phenol Rotfrei RPMI 1640 Medium ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, Hitze-inaktivierten 10 % FBS und 1 % V/V Penicillin-Streptomycin (PS) in einer 100 mm Schale. Zellkulturen bei 37 ° C in einem 5 % CO295 % Luft Zelle Kultur Inkubator. Hinweis: Phenol-rot wirkt Fluoreszenz-basierte Erkennung jedoch auch einen potenzielle Einfluss auf das Wachstum von Brustkrebszellen durch die Östrogen-ähnliche Effekte31. Phenol rot könnte beispielsweise Progesteron-Rezeptor und das Wachstum von MCF-7 Zellen31anregen. Es könnte auch das Wachstum von T47D Zellen31stimulieren.</li>
	<li>Wash-Zellen mit 2 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zweimal. Fügen Sie 2 mL 0,05 % Trypsin-EDTA, MCF-7 und MDA-MB-231 oder 2 mL 0,25 % Trypsin-EDTA, T47D Zellen. Hinweis: Die Konzentration der Trypsin-EDTA benötigt für die Trennung von Zellen unter verschiedenen Brust Krebs Zelle Arten variieren, während eine unangemessene Konzentration der Expressionsmuster von einigen Zelle Oberflächenmarker wie CD44 und CD2432beeinträchtigen kann.</li>
	<li>Kultur der Gerichte für 5 min bei 37 ° C unter einer Atmosphäre des 5 % CO295 % Luft. Überprüfen Sie regelmäßig die Loslösung der Zellen unter dem Mikroskop zu verhindern, dass Zellen von übermäßigen Verdauung durch Trypsin-EDTA.</li>
	<li>Wenn mehr als 90 % Zellen loslösen, die Schüssel 5 mL fertige RPMI Medium hinzu und pipette es über die Zelloberfläche Schicht mehrere Male.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen auf eine 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 300 X g und 4 ° C für 5 min. Hinweis: In der Regel etwa 6 x 106 Zellen aus einem 100 mm Schale erhalten Sie wenn die Konfluenz 70 % erreicht.</li>
	<li>Den Überstand verwerfen und die Pellets auf 106 Zellen/100 μL der FACS-Puffer (PBS mit 0,5 % BSA und 0,1 % Natriumazid) in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch aufzuwirbeln.</li>
	<li>Teilen Sie die Zellen in mehreren Rohren. Für MCF-7 Zellen teilen sich die Zellen in 4 Röhren: zwei für Isotype steuert, eine für einzelne CD24 Färbung als Positivkontrolle CD24 und eine für dual Färbung.</li>
	<li>Für T47D Zellen, teilen sich die Zellen in 3 Röhren: zwei für Isotype Kontrollen und eine für dual Färbung.</li>
	<li>Die Zellen in 4 Röhren für MDA-MB-231 Zellen unterteilen: zwei für Isotype steuert, eine für CD44 einheitliche Färbung als Positivkontrolle CD44 und für dual Färbung.</li>
	<li>Zentrifuge, die Rohre wieder bei 300 x g und 4 ° C für 5 min. überstand verwerfen, und dann fügen Sie Fc Block 01:50 in FACS-Puffer verdünnt.</li>
	<li>Brüten die Proben auf Eis für 20 min in der Dunkelheit vor Zentrifugation bei 300 X g und 4 ° C für 5 min. Überstands verwerfen.</li>
	<li>Fügen Sie Fluorochrom-konjugierten monoklonalen Antikörper gegen menschliche CD44 (PerCP-Cy5.5) und CD24 (PE) bei 01:40 und 01:10 Verdünnungen (in FACS Puffer) im Dual Färbung Gruppen. Für positive Steuerelemente hinzufügen CD44 (PerCP-Cy5.5), MDA-MB-231 und bzw. MCF-7 Zellen in der gleichen Konzentration CD24 (PE) hinzufügen. Hinweis: Die Kombination von CD44 und C24 hat in Brust CSC Studie26,27,28,29,30verbreitet worden.</li>
	<li>Für die Isotype Kontrollgruppen hinzufügen PerCP-Cy5.5 Maus IgG2b, κ bei einem 01:40 Verdünnung als die Isotype-Steuerung für CD44 Antikörper und PE Maus IgG2a, κ bei einem 01:10 Verdünnung als die Isotype-Steuerung für CD24 Antikörper bei 106 Zellen/100 μL. Hinweis: Isotype Steuerelemente für die Antikörper von Interesse sind als Negativkontrollen33empfohlen.</li>
	<li>Brüten die Proben (aus Schritt 1.12 und 1.13) bei 4 ° C im Dunkeln für 30 min. Zentrifuge bei 300 X g und 4 ° C für 5 min. Überstands verwerfen.</li>
	<li>Waschen Sie das Pellet zweimal mit 500 μl PBS und Zentrifuge bei 300 X g und 4 ° C für 5 min.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie das Pellet in 0,5 mL PBS und Filter durch eine 40 µm-Nylon-Mesh vor der Ausführung auf ein Fluoreszenz-activated Cell Sorter.</li>
	<li>Zwecken der gating und Entschädigung Fleck MCF-7 Zellen mit PE-konjugierten Anti-CD24-Antikörpern und MDA-MB-231 Zellen mit PerCP-Cy5.5-konjugierten Anti-CD44 Antikörper als Positivkontrollen Fleck. Verwenden Sie Zellen befleckt mit Isotype Steuerelemente als Negativkontrollen (Abbildung 1).</li>
	<li>Sammeln Sie Zellen mit CD44–/CD24+ Marker im Rundboden Polystyrol 12 x 75 mm Röhrchen mit 1 mL der Sammlung Medium (Phenol Rotfrei RPMI 1640 Medium mit 20 % Hitze-inaktivierten FBS und 2 % V/V PS ergänzt). Die Rohre bei 300 x g und RT für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Hinweis: CSC-wie Zellen in Brustkrebszellen sind definiert als CD44+/CD24– Zellen26,27,28,29,30und Brustkrebs Krebszellen-Stamm sind definiert als CD44–/CD24+ Zellen18 (Abbildung 1).</li>
	<li>Platte der sortierten-Stamm Brustkrebszellen in der Kulturschale mit frischen Kollektion Medium für weitere Kultur bei 37 ° C in 5 % CO2 Zelle Kultur Inkubator.</li>
</ol>(2) Apoptose-Induktion und Erkennung
<ol><li>Bereiten Sie 1 mM Staurosporine12,34 in DMSO. Fügen Sie für die behandelten MCF-7-Gruppe 25 μl 1 mM Staurosporine auf das fertige Medium von MCF-7 Zellen um bis zu 10 mL Endvolumen (2,5 μM Staurosporine) in einem 15 mL konische Röhrchen zu machen hinzu. Pipette auf den Inhalt gleichmäßig zu mischen.</li>
	<li>Das Kulturmedium aus den Zellen zu entfernen, die Zellen mit 2 mL PBS einmal waschen. Fügen Sie die 10 mL Medium mit 2,5 μM Staurosporine MCF-7 Zellen für 6 h, Apoptose zu induzieren, wenn Zelldichte 70 % Konfluenz erreicht.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 mM Paclitaxel35,36 in DMSO. Fügen Sie für die behandelten T47D Gruppe 12,5 μl 1 mM Paclitaxel das fertige Medium der T47D Zellen zu einem Endvolumen von 10 mL (5 μM Paclitaxel) in einem 15 mL konische Röhrchen zu machen hinzu. Pipette auf den Inhalt gleichmäßig zu mischen.</li>
	<li>Das Kulturmedium aus den Zellen zu entfernen, und die Zellen mit 2 mL PBS einmal waschen. Fügen Sie die 10 mL Medium mit 5 μM Paclitaxel zu den T47D Zellen für 10 h, Apoptose zu induzieren, wenn Zelldichte 70 % Konfluenz erreicht. Hinweis: Die Induktionszeit und die Konzentration der Induktoren, die Apoptose induzieren sollte optimiert werden, wenn eine neue Zell-Linie zum ersten Mal verwendet wird.</li>
	<li>Fügen Sie für die Lösungsmittel behandelt MCF-7-Gruppe 25 μL der sterilen Dimethyl Sulfoxid (DMSO hinzu) in einem 15 mL konische Röhrchen auf das fertige Medium von MCF-7 Zellen zu einem Endvolumen von 10 mL (d. h. 0,25 % V/V DMSO) zu machen. Pipette auf den Inhalt gleichmäßig zu mischen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Kulturmedium von Lösungsmittel behandelten MCF-7 Zellen, einmal mit 2 mL PBS waschen. Dann fügen Sie die 10 mL Medium mit 0,25 % V/V DMSO für 6 h als Lösungsmittel Steuerung für STS.</li>
	<li>Fügen Sie für die Lösungsmittel behandelt T47D Gruppe 5 μL der sterilen DMSO das fertige Medium der T47D Zellen um bis zu 10 mL Endvolumen (d. h. 0,05 % V/V DMSO) in einem 15 mL konische Röhrchen hinzu. Pipette auf den Inhalt gleichmäßig zu mischen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Kulturmedium von Lösungsmittel behandelten T47D Zellen, einmal mit 2 mL PBS waschen. Fügen Sie die 10 mL Medium mit 0,05 % V/V DMSO für 10 h als Lösungsmittel Steuerung für Paclitaxel.</li>
	<li>Zu die morphologischen Veränderungen der behandelten Zellen beobachten, beflecken Zellen mit 50 nM Mitotracker Red CMXRos und 250 ng/mL Hoechst 33342, und weitere 20 min bei 37 ° C unter einer Atmosphäre des 5 % CO295 % Luft inkubieren. Beobachten Sie die typischen Apoptotic Zellmorphologie unter 60 x konfokale Laser-scanning-Mikroskop (Abbildung 2). Hinweis: Typische Apoptose Morphologie enthält Zelle Schrumpfung, Membran Blebbing, Mitochondrien Fragmentierung und nukleare Kondensation aber mit intakten zellulären Membran12,13,14,15 ,18,37.</li>
</ol>3. Isolation der Apoptotic Zellen und Apoptose Umkehrung Verfahren
<ol><li>Färben Sie die Apoptose-Induktor - und Lösungsmittel-behandelten MCF-7 oder T47D Zellen mit 3 μM Caspase-3/7 Grün Erkennung Farbstoff in der Zelle-Konzentration von 106/mL in der Dunkelheit für 30 min bei 37 ° C unter einer Atmosphäre von 5 % CO295 % Luft.</li>
	<li>Filtern Sie die Zellen durch einen 40 µm-Nylon-Mesh vor dem Ausführen auf dem Sorter für die Sortierung.</li>
	<li>Für die Anspritzung Zwecke, zuerst Tor der Ballungszentren (R1) und die Trümmer ausschließen, indem Sie Plotten der Graphen in den Punkten mit forward Scatter und Side Scatter (Abbildung 3).</li>
	<li>Die unbehandelten Zellen ohne Zugabe von Caspase-3/7 Grün Erkennung Farbstoff als Negativkontrolle verwenden, um die negativen Region (R2) Tor (Abb. 3A).</li>
	<li>Zellen mit Staurosporine12,18,34 24 Stunden behandelt und gefärbt mit dem Farbstoff als Positivkontrolle verwenden, um die positiven Region (R3) Tor (Abb. 3 b).</li>
	<li>Sammeln Sie positive Zellen (R3) aus den Induktor-behandelten Gruppen in Rundboden Polystyrol 12 x 75 mm Röhrchen mit 1 mL der Sammlung Medium (identisch mit der Kollektion Medium im Schritt 1.18) (Abb. 3C-3D). Die Rohre bei 300 x g und RT für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.</li>
	<li>Sammeln Sie negative Zellen (R2) von Lösungsmittel-behandelten Gruppen in Rundboden Polystyrol 12 × 75 mm Röhrchen mit 1 mL Kollektion Medium wie in Schritt 3.6 (Abbildungen 3E-3F). Hinweis: Ein kleiner Teil der Zellen (z. B. 10.000 Zellen) kann gesammelt und starten erneut auf dem Sorter, das Muster der aktiven Caspasen Marker zu überprüfen. Wenn mehr als 90 % der sortierten Lösungsmittel-behandelten Zellen im Großraum Caspase-Negative erscheinen oder über 90 % der sortierten Induktor-behandelten Zellen im Großraum Caspase-positiv dargestellt sind, sind diese gesammelten Zellen vermutlich relativ reines (zahlen 3 C-3F). Andernfalls sollte die Sortierung Region und/oder der Sortierer zurückgesetzt werden.</li>
	<li>Aufschwemmen der sortierten Zellen in frischen Kollektion Medium und säen sie in 12-Well-Zellkultur-Platten und Kultur bei 37 ° C unter einer Atmosphäre des 5 % CO295 % Luft für 7 Tage für Apoptose Umkehr.</li>
</ol>4. Bestätigung der Apoptose in Caspase-aktivierten Zellen
<ol><li>Mischen Sie 10 mM HEPES, 140 mM NaCl und 2,5 mM CaCl2 annexin-Bindung Puffer (pH 7,4) vorzubereiten. Lagern Sie den Puffer bei 4 ° C und vermeiden Sie den Puffer, dem Licht auszusetzen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 100 µg/mL funktionierende Lösung des Propidium Jodid (PI) durch Verdünnung 5 µL von 1 mg/mL PI-Stammlösung in 45 µL Puffer annexin-Bindung. Lagern Sie die Lösung bei 4 ° C und vermeiden Sie die Lösung, dem Licht auszusetzen. Hinweis: PI ist ein potenzieller Mutagen und sollten mit Vorsicht behandelt werden.</li>
	<li>Bereiten Sie die Induktor-behandelten Zellen wie in den Schritten 2.1 bis 2.5.</li>
	<li>Sammeln Sie den Induktor behandelt MCF-7 oder T47D Zellen durch Pipettieren dem Medium über die Zellschicht 3-5 X, um die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die Zellen auf eine 15 mL konische Rohr.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 300 x g und RT für 5 min. überstand verwerfen.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie die Zellen mit abgeschlossenen Medium in die Zelle-Konzentration von 106/mL in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Beflecken Sie Zellen mit 3 μM Caspase 3/7 Grün Erkennung Farbstoff in der Dunkelheit für 30 min bei 37 ° C.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 300 x g und RT für 5 min. verwerfen die Überstände.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit 1 mL eiskaltem PBS und Zentrifuge bei 300 X g und 4 ° C für 5 min. verwerfen die Überstände.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zellen in 100 μL von annexin-Bindung Puffer mit Add 5 μL des annexin V-Konjugats und 1 µL von 100 µg/mL PI Arbeitslösung zu jeweils 100 μl Zellsuspension und die Zellen für 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Annexin V und PI werden häufig zusammen verwendet Apoptotic Zellen im Flow Cytometry38,39,40beschriften.</li>
	<li>400 µL annexin-Bindung Puffer, Mischung sanft hinzufügen. Halten Sie die Proben auf Eis vor der Ausführung auf einem Durchflusszytometer.</li>
</ol>5. Messung der Brust CSC-ähnliche Zellen durch Durchflusszytometrie
<ol><li>Ernten Sie die umgekehrte MCF-7 in beiden Gruppen Induktor oder Lösungsmittel behandelt mit 0,05 % Trypsin-EDTA. T47D Zellen in beiden Gruppen Induktor oder Lösungsmittel behandelt oder mit 0,25 % Trypsin-EDTA wie in Schritt 1.2 bis 1.5 zu ernten.</li>
	<li>Färben Sie die Zellen mit Fluorochrom konjugierten monoklonalen Antikörpern gegen menschliche CD44 (PerCP-Cy5.5) und CD24 (PE) wie in Schritt 1.12. Unterdessen bereiten Sie die Isotype-Steuerelemente wie in Schritt 1.13.</li>
	<li>Führen Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer und erkennen den Anteil der Zellen mit CD44+/CD24– -Marker.</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt eine direkte und klare Weise zur Erkennung von den Übergang von nicht-Stamm Brustkrebszellen in Brust CSC-ähnliche Zellen infolge Apoptose Umkehr. Bestätigung der CSC Eigenschaften dieser umgekehrte Zellen könnte gefördert werden, mit der ichn Vitro Mammosphere Bildung Assay und in Vivo Xenograft-Transplantation in immungeschwächte Mäuse18,24,26 ,27</sup...

Krebs ist eine führende Ursache des Todes, verursacht schwere Last zu Ländern weltweit1gewesen. Brustkrebs zählt bei weiblichen Patienten unter allen Arten von Krebs1hoch, sowohl in Bezug auf die Inzidenz und Mortalität. Aufgrund der Heterogenität Krebs ist eine Kombination von Medikamenten in der Regel in der Chemotherapie verwendet, um Krebs Zelle Tod2,3,4zu erreichen. Jedoch da gemeinsame Chemotherapeutika oft DNA-5,6 Ziel, betroffen Synthese7,8 und/oder Mikrotubuli Proteindynamik9, schnell wachsende Zellen sind am meisten während ruhende Zellen wie Krebs-Stammzellen (CSC) s sind in der Regel weniger betroffenen10. CSCs sind daher eher nach der Behandlung überleben, später führt zu Resistenzen und Krebs10,11 Rezidiv. Daher, Beseitigung von CSCs ist ein wichtiges Thema für die Krebsbehandlung geworden und Studie über den Ursprung des CSCs ist notwendig.
Weitere Studien über das Phänomen der Apoptose Umkehrung wurden im letzten Jahrzehnt12,13,14,15,16,17,18 durchgeführt , 19. vor der Entstehung dieses Konzeptes, es hat weit angenommen worden, dass Zellen irreversibel nach der Aktivierung der Caspase Apoptose. Caspasen sind eine Familie von Protein-Enzyme, die wichtige Rolle in der Initiierung und Durchführung Stadien der Apoptose, einschließlich der Bildung von komplexen apoptotische und die Spaltung von nachgelagerten Substrate20spielen. Aktivierung von Caspasen Henker wie Caspase 3 oder Caspase 7 galt als der "Point Of No Return" für Apoptose21. Allerdings beobachteten Forscher vor kurzem, dass Umkehr Apoptose sowohl in-vitro tritt- und in-vivo, , während die Zellen sich von Apoptose auch nach Caspase Aktivierung12,13,14 erholen können , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Darüber hinaus aggressive Merkmale wie z. B. höhere Beständigkeit gegen die ursprünglichen Apoptose-Induktor und höheren Invasivität werden in der umgekehrten Krebs erkannt Zellen15. Daher wurde vorgeschlagen, dass der Anteil der CSC-ähnlichen Zellen in der umgekehrten Bevölkerung im Vergleich zu den unbehandelten Zellen schließlich einen Beitrag zu mehr bösartigen Funktionen nach Apoptose Umkehr18höher wäre.
Zuvor wurden viele Anstrengungen unternommen, die Apoptose Umkehr in-vitro- und noch wichtiger, in vivo zu verfolgen die sehr helfen bei der Bestätigung der Universalität von diesem Prozess16,17,19. Allerdings fehlt eine systemische Studie über die Folgen der umgekehrte Zellen aufgrund der unbefriedigenden Isolation von Zellen, die wirklich Apoptose Umkehr unterzogen wurden. Es muss eine reine Apoptotic Zellen zu erwerben und für weitere Studien zu erholen. Also, wir verwenden den traditionell anerkannten Marker der Henker Caspase Aktivierung als Marker für den "Point Of No Return"-21 für die Apoptose und nutzen Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) um Caspase-aktivierten Zellen befleckt Diskriminierung mit Farbstoff Caspase-3/7-Grün-Erkennung. Der Farbstoff ist kovalent verbunden mit eine kurze Aminosäuresequenz, DEVD, die erkannt und durch aktive Caspasen 3/7 abgespalten werden können. Die Spaltung hilft den Farbstoff freigeben, die aus dem Zytosol in den Zellkern translozieren wird, wo es bindet an DNA und starke Fluoreszenz emittiert. Dieses Verfahren vermeidet die Verwendung einer Bulk-Zell-Population, in der einige Zellen keine Apoptose durchgemacht haben können.
CSCs oder Tumor-initiierenden Zellen wurden in vielen soliden Tumoren, die mit einer einzigen oder eine Kombination aus mehreren Oberflächen Marker(s) und sehr wenige Zahlen dieser Zellen sind ausreichend, um Form Tumoren immungeschwächte Mäuse22,23, 24,25,26,27. Häufig wird eine Kombination von CD44 und CD24 Brust CSC Studien und CD44+/CD24– Zellen wurden definiert als die Brust CSCs26,27,28,29 , 30. vor kurzem haben wir eine Reihe von Experimenten bestätigen die vorgeschlagene Beziehung zwischen Apoptose Umkehr und CSCs zu demonstrieren, dass umgekehrte Brustkrebszellen erhöhte Tumor bilden Fähigkeit in vitro und in vivo mit gewonnen durchgeführt ein erhöhter Anteil an Zellen mit CSC Marker18. Obwohl wir nicht ausschließen konnte, dass Brust CSCs besser überleben und somit nach Apoptose Umkehr, wichtig ist, bereichert wenn wir nicht-Stamm Krebszellen und Thema isolieren entstehen ihnen zu Apoptose Umkehr, CSC in der ursprünglich nicht-stem Krebs-Zell-Population, darauf hindeutet, dass nicht-Stammzellen Krebs, wie Zellen auf die Erhöhung des Anteils von CSCs während der Apoptose Umkehr beitragen können.
Dieser Artikel soll den Übergang von Brustkrebszellen-Stamm zu CSC-wie Brustzellen nach Apoptose Umkehr zu zeigen und diesen Übergang durch Durchflusszytometrie zu erkennen. -Stamm-Brustkrebszellen bereiten wir zunächst durch die Isolierung von CD44–/CD24+ Brustkrebs Krebszellen durch FACS. Dann ist Apoptose induziert und durch morphologische Veränderungen unter dem Mikroskop bestätigt. Danach sind Apoptotic Zellen positiv gekennzeichnet durch Caspase 3/7 Grün Erkennung Farbstoff durch FACS isoliert und weiter in das Fehlen von Apoptose induzieren Apoptose Umkehr kultiviert. Die umgekehrten Zellen sind dann nach 7 Tagen Erholung für durchflusszytometrischen Analyse mit CSC-Markern gefärbt. Zellen mit CD44+/CD24– Marker erscheinen wieder in der umgekehrten Bevölkerung darauf hindeutet, dass Übergang von nicht-Stamm Krebszellen zu CSC-wie Zellen in Apoptose Umkehrung aufgetreten ist.
Apoptose Umkehr wurde in mehreren Krebs beobachtet Zelllinien sowie normale Primärzellen mit verschiedenen apoptotischen Stimuli in vitro-12,13behandelt. Dieser Prozess hat auch in Drosophila verfolgt worden Modell in-vivo16,17,19. Viele Informationen über die zugrunde liegenden Mechanismus der Krebs-Rückfall in verschiedenen Krebs-Krankheit-Modelle und die Herkunft des CSCs erhalten Sie durch den Einsatz der Technik wie in diesem Manuskript beschrieben.

<table><tbody><tr><td>MCF-7</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>T47D</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>HTB-133</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz0,05</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 Annexin V Konjugat</td><td>Invitrogen</td><td>A35109</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>USB</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 & middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspase-3/7 grüner Fluoreszenzfarbstoff</td><td>Invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fc-Block</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td>hitzeinaktiviertes</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>USB</td><td>16926</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>monoklonale Antikörper gegen humanes CD24</td><td>BD Biosciences</td><td>555428</td><td>PE Klon:ML5 Los:5049759 RRID:AB_395822</td></tr><tr><td>monoklonale Antikörper gegen humanes CD44</td><td>BD Biosciences</td><td>560531</td><td>PERCP-CY5.5 Klon:G44-26 Los:7230770 RRID:AB_1727485</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7402</td><td></td></tr><tr><td>PE Maus IgG2a, &kappa; Isotypkontrolle</td><td>BD Biosciences</td><td>554648</td><td>Klon: G155-178 (RUO) RRID: AB_395491</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td>, <td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr>, <tr><td>PerCP-Cy5.5, Maus IgG2b, & kappa; Isotypkontrolle</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>Klon: 27-35 RRID: AB_647257</td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td>phenolrotfreies</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Kulturschale</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Gewebekulturplatten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 40 &mu; m Nylonnetz</td><td>BD Biosciences</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>FACSuite software bundle v1.0</td><td>BD Biosciences</td><td>651360</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Biosciences</td><td>651155</td><td></td></tr><tr><td>FluoView FV1000 konfokales Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>60X Objektiv</td></tr><tr><td>FV10-ASW Viewer-Software Ver.4.2b</td><td>Olympus-Polystyrol</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mit rundem Boden 12 &mal; 75 mm Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>S3e Sortierer</td><td>Bio-Rad</td><td>1451006</td><td></td></tr></tbody></table>

flow durchflusszytometrischen erkennung von neu gebildeten stammzellen-wie brustkrebszellen nach apoptose umkehr

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Rezidiv wurde lange von Onkologen untersucht, während die zugrunde liegenden Mechanismen unklar bleiben. Vor kurzem fanden wir und andere, dass ein Phänomen namens Apoptose Umkehr zu erhöhten Tumorigenität in verschiedenen Zellmodellen unter verschiedene Reize führt. Frühere Studien konzentrierten sich auf die Verfolgung dieser Prozess in vitro und in vivo; ist aber noch die Isolierung der echten umgekehrte Zellen erreicht werden, welche Grenzen unser Verständnis über die Folgen der Apoptose Umkehr. Hier nutzen wir einen Caspase-3/7 Grün Erkennung Farbstoff Label Zellen mit aktivierte Caspasen nach Induktion der Apoptose. Zellen mit positiven Signalen werden weiter durch Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) zur Verwertung aussortiert. Morphologische Untersuchung unter konfokalen Mikroskopie hilft den apoptotischen stand vor FACS bestätigen. Eine Zunahme der Tumorigenität kann oft die Höhe des Anteils der Krebsstammzellen (CSC) zugeschrieben werden-wie Zellen. Auch wäre angesichts die Heterogenität der Brustkrebs, Identifizierung des Ursprungs dieser CSC-ähnliche Zellen entscheidend für die Behandlung von Krebs. So bereiten wir nicht Stamm Brustkrebszellen vor Apoptose auslösen, Caspase-aktivierten Zellen zu isolieren und die Apoptose Umkehrung Verfahren durchführen. Flow-Zytometrie-Analyse zeigt, dass die CSC-wie Brustzellen wieder erscheinen im Bereich "umgekehrte" darauf hinweist, dass die CSC-wie Brustzellen von Brustkrebszellen-Stamm während der Apoptose Umkehr gereist sind. Zusammenfassend lässt sich sagen enthält dieses Protokoll die Isolierung von apoptotischen Brustkrebszellen und Erkennung von Veränderungen in CSC Prozentsatz in umgekehrter Zellen durch Durchflusszytometrie.

Um den Übergang von der Brust nicht-Krebszellen zu CSC-wie Brustzellen, eine erste Sortierung der CD44 Stiel zu beobachten–/CD24+ Brustkrebs-Zellen wurden benötigt. Seit die MCF-7-Zell-Linie, die etwa 0,15 % Zellen mit CSC-Marker in der ursprünglichen Bevölkerung (Abbildung 1), dieser Schritt unterstützt CSC Bereicherung während der Apoptose Umkehr auszuschließen. Im Gegenteil, gäbe es keine Zellen mit CSC-Marker in der ursprünglichen Be...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur isolieren Apoptotic Brustkrebszellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und weiter den Übergang von nicht-Stamm Brustkrebszellen zu Brustkrebs-Stammzellen-ähnliche Zellen nach Apoptose Umkehr zu erkennen, indem Durchflusszytometrie.

Flow durchflusszytometrischen Erkennung von neu gebildeten Stammzellen-wie Brustkrebszellen nach Apoptose Umkehr

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Die Isolierung enthoben erpopulationen von apoptotischen Umkehrzellen war bisher ein Problem, das unser Verständnis über die Folgen der Apoptose-Umkehr stark einschränkt. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, eine reinere Populationen von apoptotischen Umkehrzellen zu erzeugen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die verwendeten Materialien und Ausrüstungen in verschiedenen Institutionen weit verbreitet sind.Diese Technik ist leicht anwendbar für die Isolierung einer reineren Populationen von Zellen, die eine Umkehrung der Apoptose durchgemacht haben. Wie bereits berichtet, können normale Zellen auch apoptose umkehren, dass neben Brustkrebszellen auch verschiedene Chemozellen sowie normale Zellen gestartet und die verschiedenen apoptotischen Reize verwendet werden können. Da die Umkehrzelle durch Apoptose und schnelle Sortierung gegangen ist, ist die Wiederherstellungsrate in der Regel niedrig.Eine größere Startzellenzahl ist rekombinant, um die Endausbeute zu erhöhen. Zu Beginn, Kultur MCF-7, MDA-MB-231, Zu beginn, Kultur MCF-7, MDA-MB-231 und T47D-Zellen, nach dem Textprotokoll. Danach die Zellen zweimal mit PBS waschen und dann zwei Milliliter 0,05 Prozent Trypsin-EDTA von 0,05 Prozent Trypsin-EDTA in den MCF-7, und MDA-MB-231-Zellen, zu den Zellen MCF-7 und MDA-MB-231 sowie zwei Milliliter 0,25 Prozent Trypsin-EDTA und zwei Milliliter von 0,25 Prozent Trypsin-EDTA an die T47D-Zellen.t47D-Zellen. Kultur die Zellen für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, in einem fünf Prozent Kohlenstoff-Dioxid-Zellkultur-Inkubator. Während die Zellen brüten, überprüfen Sie die Ablösung der Zellen mit einem Mikroskop, um eine Überverdauung durch Trypsin-EDTA zu verhindern.Wenn sich mehr als 90 Prozent der Zellen lösen, fügen Sie der Schale fünf Milliliter abgeschlossenes RPMI-Medium hinzu und pipetteten Sie es mehrmals über die Zellschichtoberfläche. Dann übertragen Sie die Zellen in 15 Milliliter konische Röhren und Zentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Pellets mit FACS-Puffer in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohren wieder auf.Dann teilen Sie die Zellen in mehrere Röhren. Zentrifugieren Sie die Rohre noch einmal und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie dann den Proben einen verdünnten Fc-Block hinzu.Die Proben im Dunkeln 20 Minuten auf Eis bebrüten, bevor die Proben wieder zentrifugiert werden. Danach entsorgen Sie den Überstand. Als nächstes fügen Sie fluorchromekonjugierte monoklonale Antikörper gegen menschliche CD44 und CD24 gegen menschliche CD44 und CD24 in ein bis 40 bzw. ein bis zehn Verdünnungen zu den Doppelfärbungsgruppen hinzu.Für die positiven Kontrollen fügen Sie CD44-Antikörper Hinzu Für die positiven Steuerelemente CD44-Antikörper zu den MDA-MB-231-Zellen, zu den MDA-MB-231-Zellen und CD24-Antikörpern zu den MCF-7-Zellen und CD24-Antikörpern zu den MCF-7-Zellen in ein bis 40 bzw. ein bis zehn Verdünnungen hinzu. PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, Add PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa hinzufügen, verdünnt im Verhältnis eins bis 40 zu Zellen als Isotopensteuerung für CD44-Antikörper. Dann fügen Sie PE Mouse IgG2a Kappa, Dann, fügen Sie PE Maus IgG2a Kappa, verdünnt in einem Verhältnis von eins bis 10 zu den Zellen als Isotopensteuerung für CD24 Antikörper.Die Proben bei vier Grad Celsius im Dunkeln 30 Minuten lang bebrüten. Dann zentrifugieren Sie die Proben bei 300 g es Dann zentrifugieren Sie die Proben bei 300 g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet zweimal in 500 Mikroliter PBS.Wiederholen Sie dann die Zentrifugation wie zuvor beschrieben. Setzen Sie das Pellet auf 0,5 Milliliter PBS wieder auf und filtern Sie die Suspension durch ein 40 Mikrometer Nylongewebe. Führen Sie dann die Suspension durch einen fluoreszenzaktivierten Zellsortierer aus.Sammeln Sie die Zellen mit CD44-Negativ und CD24-positiven Markern in rund-bodenigen Röhren, die ein Milliliter Sammelmedium enthalten. Zentrifugieren Sie dann die Rohre und entsorgen Sie den Überstand. Als nächstes die sortierten Brust-Nicht-Stammkrebszellen in einem Kulturgericht mit frischem Sammelmedium für weitere Kultur aufzuführen.Verwenden Sie zunächst ein Millimolar-Staurosporin in DMSO, Um 2,5 Mikromolaren Staurosporin in Medium vorzubereiten, gemäß dem Textprotokoll. Entfernen Sie dann das Kulturmedium aus den Zellen. Waschen Sie die Zellen mit zwei Milliliter PBS einmal, danach fügen Sie 10 Milliliter des Staurosporinmediums zu den MSF-7-Zellen für sechs Stunden hinzu, um Apoptose zu induzieren, wenn die Zellen zu 70 Prozent konfluent sind.Als nächstes bereiten Sie ein Millimolar-Paclitaxel in DMSO vor. Dann fügen Sie 12,5 Mikroliter dann 12,5 Mikroliter des 1 Millimolaren Paclitaxel s auf das fertige Medium der T47D-Zellen, um ein endgültiges Volumen von 10 Milliliter in einem 15 Milliliter konischen Rohr zu machen. Entfernen Sie das Kulturmedium aus den Zellen, und waschen Sie die Zellen mit 2 MilliliterPBS.Dann fügen Sie das Paclitaxel-Medium für 10 Stunden in die Zellen, um Apoptose für 10 Stunden zu induzieren, um Apoptose zu induzieren, wenn die Zellen 70 Prozent Konfluenz erreichen. Danach das Medium aus der lösungsmittelbehandelten MCF-7-Gruppe entfernen und mit zwei Millilitern PBS waschen. Dann fügen Sie 10 Milliliter von 0,25 Prozent DMSO Medium dann, fügen Sie 10 Milliliter 0,25 Prozent DMSO Medium für sechs Stunden als Lösungsmittelkontrolle für Staurosporin.Entfernen Sie das Kulturmedium aus der lösungsmittelbehandelten T47D-Gruppe, und waschen Sie die Zellen mit zwei MilliliterPBS. Dann fügen Sie 10 Milliliter von 0,05 Prozent DMSO Medium dann 10 Milliliter 0,05 Prozent DMSO Medium für 10 Stunden als Lösungsmittelkontrolle für Paclitaxel hinzufügen. Als nächstes färben Sie die Zelle und bebrüten sie für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem fünf Prozent Kohlendioxyd-Inkubator.Verwenden Sie ein 60-fach konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, um die morphologischen Veränderungen der behandelten Zellen zu beobachten. Stain sowohl die apoptotischen Induktoren und lösungsmittelbehandelten MCF-7- und T47D-Zellen und lösungsmittelbehandelten MCF-7- und T47D-Zellen im Dunkeln für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem fünf Prozent Kohlendioxyd-Inkubator. Sammeln Sie mit dem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer die positiven Zellen aus den mit Induktorbehandelten Induktionsgruppen in runden Bodenröhrchen, die ein Milliliter Sammelmedium enthalten.Zentrifugieren Sie dann die Rohre wie zuvor beschrieben, und entsorgen Sie den Überstand. Sammeln Sie die negativen Zellen aus den lösungsmittelbehandelten Gruppen in rund-Boden-Röhren mit einem Milliliter Sammelmedium. Zentrifugieren Sie die Rohre und entsorgen Sie den Überstand.Danach setzen Sie die sortierten Zellen in einem neuen Sammelmedium erneut aus. Säen Sie die Zellen in 12-Well-Gewebekulturplatten, und kulture sie für sieben Tage für Apoptose-Umkehr. Ernten Sie den umgekehrten MCF-7 sowohl in Induktor- als auch in lösungsmittelbehandelten Gruppen mit 0,05 Prozent Trypsin-EDTA.0,05 Prozent Trypsin-EDTA. Dann ernten Sie die T47D-Zellen in beiden Induktor dann, Ernten Sie die T47D-Zellen in beiden Induktor- und lösungsmittelbehandelten Gruppen mit 0,25 Prozent Trypsin-EDTA. Stain die Zellen mit fluorchrome-konjugierten monoklonalen Antikörpern gegen menschliche CD44 und CD24.Während die Zellen färben, bereiten Sie die Isotypkontrollen vor, wie zuvor gezeigt. Führen Sie schließlich die Zellen auf einem Durchflusszytometer aus, und erkennen Sie den Prozentsatz der Zellen mit CD44-positiven und CD24-negativen Markern. In diesem Protokoll wurde der Übergang von Brust-Nicht-Stammkrebszellen zu Brust-CSC-ähnlichen Zellen beobachtet.Die Isolierung von Nicht-Stammzellen wurde zuerst in MCF-7-Zellen durchgeführt. Typische morphologische Veränderungen wurden nach Zugabe von apoptotischen Induktoren beobachtet, und die Zellen erholten sich von Apoptose mit ähnlicher Morphologie nach dem Drogenentzug. Die kavraumaktivierten Zellen wurden aufgrund ihrer höheren Fluoreszenseintensität beschriftet und aussortiert als Zellen ohne Kavalleumaktivierung.Während des apoptotischen Induktionsprozesses wurde Lösungsmittel verwendet, um die Möglichkeit auszuschließen, dass das Faktenverfahren oder das Lösungsmittel selbst die Ursache für den Übergang war. Caspace-aktivierte Zellen in den apoptotisch-induzierenden Behandlungsgruppen wurden als nexin fünf positive und PI-negative, was darauf hindeutet, dass sie apoptotische Zellen waren. Die apoptotischen Zellen wurden gesammelt und zur Erholung kultiviert, verglichen mit den lösungsmittelbehandelten Gruppen zeigte die zytometrische Flussanalyse, dass im CD44-positiven und CD24-negativen Quadranten in der umgekehrten ursprünglich nicht-Stammkrebszellpopulation die Zelle cd44 und CD24 auftraten.Gaging ist wichtig in der Strömungsanalyse und Zellsortierung, dass eine ausreichende Kontrolle in den Labors vorbereitet werden sollte. Da dieses In-vitro-Apoptose-Umkehrverfahren reine apoptotische Krebszellen isoliert, können Experimente wie in vivo-Tumorgenese-Assets durchgeführt werden, um die Folgen einer realen Umkehr der Zellen zu verstehen. Diese Technik beleuchtet die Ursache für Krebsrückfälle, daher kann es untersucht werden, um das Wiederauftreten bei Krebspatienten zu verhindern.Bitte denken Sie daran, sich bei der Durchführung von Zellkulturexperimenten gemäß den Biosafe-Tier-Vorschriften in Ihrer Einrichtung richtig zu schützen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

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Flow durchflusszytometrischen Erkennung von neu gebildeten Stammzellen-wie Brustkrebszellen nach Apoptose Umkehr

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