Name: Groß angelegte Top-Down-Proteomik mit Kapillare Zone Elektrophorese Tandem-Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Erfahren Sie die groß angelegte Top-Down-Proteomik mit Kapillarzonenelektrophorese-Tandem-Massenspektrometrie zur hochauflösenden Charakterisierung von Proteoformen und posttranslationalen Modifikationen.

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Die Autoren danken für die freundliche Bereitstellung Escherichia coli Zellen für die Experimente Heedeok Hong Gruppe an der Michigan State University, Department of Chemistry. Die Autoren danken der Unterstützung aus dem National Institute of General Medical Sciences, der National Institute of Health (NIH) durch Grant R01GM118470 (zu X. Liu) und Grant R01GM125991 (L. Sonne und X. Liu).

<ol><li>Aebersold, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteoforms+are+there%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">How many proteoforms are there.</a> Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).</li>
<li>Catherman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+Top-down+Proteomics+of+the+Human+Proteome%3A+Membrane+Proteins%2C+Mitochondria%2C+and+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-Down+Proteomics+of+Large+Proteins+up+to+223+kDa+Enabled+by+Serial+Size+Exclusion+Chromatography+Strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy.</a> Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).</li>
<li>Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+Top-Down+Proteomics+and+the+Analysis+of+Proteoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).</li>
<li>Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Zone+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capillary Zone Electrophoresis.</a> Science. 222 (4621), 266-272 (1983).</li>
<li>Keithley, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+with+three-color+fluorescence+detection+for+the+analysis+of+glycosphingolipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism.</a> Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-Line+Separation+by+Capillary+Electrophoresis+Prior+to+Analysis+by+Top-Down+Mass+Spectrometry+Enables+Sensitive+Characterization+of+Protein+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).</li>
<li>Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+and+Fast+Bottom-up+Analysis+of+Femtogram+Amounts+of+Complex+Proteome+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).</li>
<li>Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Peptide+Detection+Toward+Single-Neuron+Proteomics+by+Reversed-Phase+Fractionation+Capillary+Electrophoresis+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).</li>
<li>Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Top-Down+Intact+Protein+Characterization+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization+Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+comprehensiveness+and+sensitivity+of+sheathless+capillary+electrophoresis-tandem+mass+spectrometry+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).</li>
<li>Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachable+strong+cation+exchange+monolith%2C+integrated+with+capillary+zone+electrophoresis+and+coupled+with+pH+gradient+elution%2C+produces+improved+sensitivity+and+numbers+of+peptide+identifications+during+bottom-up+analysis+of+complex+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+10%2C000+peptide+identifications+from+the+HeLa+proteome+by+using+single-shot+capillary+zone+electrophoresis+combined+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+in+English%22%5BJournal%5D)">Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).</li>
<li>Aebersold, R., Morrison, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dilute+peptide+samples+by+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).</li>
<li>Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Focusing+of+Catecholamines+and+Weakly+Acidic+Compounds+by+Capillary+Electrophoresis+Using+a+Dynamic+pH+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction.</a> Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).</li>
<li>Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+Capillary+Zone+Electrophoresis+to+a+Q+Exactive+HF+Mass+Spectrometer+for+Top-down+Proteomics%3A+580+Proteoform+Identifications+from+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast.</a> Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).</li>
<li>Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-Up+Proteomics+of+Escherichia+coli.+Using+Dynamic+pH+Junction+Preconcentration+and+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).</li>
<li>Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Shot+Top-Down+Proteomics+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry+for+Identification+of+Nearly+600+Escherichia+coli+Proteoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).</li>
<li>Busnel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+capacity+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization+mass+spectrometry%3A+coupling+a+porous+sheathless+interface+with+transient-isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).</li>
<li>Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-Confined+Aqueous+Reversible+Addition-Fragmentation+Chain+Transfer+%28SCARAFT%29+Polymerization+Method+for+Preparation+of+Coated+Capillary+Leads+to+over+10+000+Peptides+Identified+from+25+ng+HeLa+Digest+by+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis-Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).</li>
<li>Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally-initiated+free+radical+polymerization+for+reproducible+production+of+stable+linear+polyacrylamide+coated+capillaries%2C+and+their+application+to+proteomic+analysis+using+capillary+zone+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry.</a> Talanta. 146, 839-843 (2016).</li>
<li>Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac00169a022">Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).</li>
<li>Moini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplifying+CE-MS+Operation.+2.+Interfacing+Low-Flow+Separation+Techniques+to+Mass+Spectrometry+Using+a+Porous+Tip%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip.</a> Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).</li>
<li>Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+capillary+electrophoresis+nanospray+sheath-flow+interface+for+high+efficiency+and+sensitive+peptide+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).</li>
<li>Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-Generation+Electrokinetically+Pumped+Sheath-Flow+Nanospray+Interface+with+Improved+Stability+and+Sensitivity+for+Automated+Capillary+Zone+Electrophoresis-Mass+Spectrometry+Analysis+of+Complex+Proteome+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests.</a> Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).</li>
<li>McCool, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Top-Down+Proteomics+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis-Tandem+Mass+Spectrometry%3A+Identification+of+5700+Proteoforms+from+the+Eschericia+coli+Proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).</li>
<li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoWizard%3A+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li>
<li>TopPIC Suite. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/topfd/">http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/topfd/</a> (2017).</li>
<li>Kou, Q., Xun, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopPIC+%3A+a+software+tool+for+top-down+mass+spectrometry-based+proteoform+identification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).</li>
<li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li>
<li>Methods - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.topdownproteomics.org/resources/methods/">http://www.topdownproteomics.org/resources/methods/</a> (2018).</li>
<li>Software - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.topdownproteomics.org/resources/software/">http://www.topdownproteomics.org/resources/software/</a> (2018).</li>
<li>Ansong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+proteomics+reveals+a+unique+protein+S-thiolation+switch+in+Salmonella+Typhimurium+in+response+to+infection-like+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+ultrahigh-pressure+long+column+reversed-phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).</li>
<li>Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-energy+C-trap+dissociation+for+peptide+modification+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis.</a> Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).</li>
<li>Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+and+protein+sequence+analysis+by+electron+transfer+dissociation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).</li>
<li>Shaw, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+Protein+Characterization+Using+Top-Down+Mass+Spectrometry+and+Ultraviolet+Photodissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).</li>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll um CZE-MS/MS für die hochauflösende Charakterisierung von Proteoforms in einfachen Proteinproben und der großen Identifikation von Proteoforms in komplexen Proteom Proben verwenden. Ein Diagramm der CZE-ESI-MS/MS-System ist in Abbildung 1dargestellt. Es gibt vier wichtige Schritte im Protokoll. Erstens ist die Erstellung von qualitativ hochwertigen LPA-Beschichtung auf der inneren Wand der Kapillare Trennung extrem wichtig. Eine Trennung LPA-...

Top-Down-Proteomics (TDP) zielt darauf ab, für die groß angelegte Charakterisierung von Proteoforms innerhalb einer Proteom. TDP stützt sich auf die effektive flüssig Phasentrennung von intakten Proteinen vor der Elektrospray-Ionisation-Tandem-Massenspektrometrie (ESI-MS/MS)-Analyse aufgrund der hohen Komplexität und große Konzentration Dynamikbereich des Proteoms1,2 ,3,4,5. Kapillare Zone Elektrophorese (CZE) ist eine leistungsfähige Technik für die Trennung von Biomolekülen, die anhand ihrer Größe-Ladungs-Verhältnis6. CZE ist relativ einfach und erfordert nur eine offene röhrenförmigen verschmolzen Silica Kapillare, ein Hintergrund-Elektrolyt (BGE) und ein Netzteil. Eine Probe von intakten Proteinen kann in der Kapillare mit Druck oder Spannung geladen werden, und Trennung wird durch beide Enden der Kapillare in das BGE eintauchen und Anlegen einer hohen Spannung eingeleitet. CZE kann extrem hohe Abscheideleistung Ansatz (> 1 Million theoretischen Platten) für die Trennung von Biomolekülen7. CZE-MS hat eine drastisch höhere Empfindlichkeit als weit verbreitete umgekehrt Phase Flüssigkeitschromatographie (RPLC)-MS für die Analyse von intakten Proteinen8. Obwohl CZE-MS ein großes Potenzial für große Top-Down-Proteomics hat, hat ihre breite Anwendung in Proteomics durch mehrere Themen, darunter eine geringe Probenbeladung Kapazität und schmale Trennung Fenster behindert worden. Das typische Beispiel Ladevolumen in CZE ist etwa 1 % des gesamten Kapillare, die normalerweise weniger als 100 nL9,10,11entspricht. Die Trennung-Fenster der CZE ist in der Regel weniger als 30 min durch den starken Elektroosmotischer Fluss (EOF)9,10. Diese Probleme beschränken CZE-MS/MS für die Identifizierung einer großen Anzahl von Proteoforms und niedrigen reichlich Proteoforms aus einer komplexen Proteom.
Viel Anstrengungen wurden unternommen, um die Probe Ladevolumen von CZE über Online-Probe Konzentration Methoden (z.B., Solid Phase Microextraction [SPME]12,13, Feld-erweiterte Probe Stapeln [FESS]9 zu verbessern , 11 , 14, und dynamische pH Kreuzung15,16,17,18). FESS und dynamische pH Junction sind einfacher als SPME, erfordert nur einen signifikanten Unterschied zwischen dem Probenpuffer und das BGE in pH-Wert und Leitfähigkeit. FESS beschäftigt ein Probenpuffer mit viel geringere Leitfähigkeit als die BGE, führt zu eine Stapelung von Analyten an der Grenze zwischen der Probe Zone und die BGE-Zone in der Kapillare. Dynamische pH Junction nutzt ein einfaches Beispiel-Stecker(z. B.50 mM Ammonium Bicarbonat, pH 8) und einen sauren BGE (z.B., 5 % [V/V] Essigsäure, pH 2,4) auf beiden Seiten des Steckers Probe. Auf Antrag eine hohe positive Spannung am Ende der Kapillare Injektion Auftritt Titration von den grundlegenden Beispiel Stecker, Konzentration des Analyten in einen engen Stecker bevor Sie irgend eine CZE-Trennung. Vor kurzem, die Sonne-Gruppe systematisch verglichen FESS und dynamische pH Junction zum Online-Stapeln von intakten Proteinen, demonstrieren, dass dynamische pH-Kreuzung könnte viel bessere Leistung als FESS für die Online-Konzentration von intakten Proteinen produzieren wenn Das Probenvolumen Injektion war 25 % des Gesamtvolumens Kapillare19.
Neutral beschichteten Trennung Kapillaren (z.B.lineares Polyacrylamid [LPA]) sind eingesetzt worden, um die EOF in der Kapillare, verlangsamt sich die CZE-Trennung und Verbreiterung der Trennung Fenster20,21zu reduzieren. Vor kurzem entwickelte sich die Dovichi Gruppe ein einfaches Verfahren zur Herstellung von stabilen LPA-Beschichtung auf der inneren Wand der Kapillaren, Verwendung von Ammonium Bleichen (APS) als Initiator und Temperatur (50 ° C) für die Produktion freier Radikale und Polymerisation22 . Vor kurzem beschäftigte der Konzern Sonne die LPA-beschichtete Trennung Kapillare und dynamische pH Kreuzung Methode zur Trennung von intakten Proteinen, CZE, eine Mikroliter-Skala Probe laden Volumen und einem 90-min Trennung Fenster19zu erreichen. Dieses CZE-System öffnet die Tür zur Verwendung von CZE-MS/MS für große Top-Down-Proteomics.
CZE-MS erfordert eine sehr robuste und sensiblen Schnittstelle paar CZE, MS. Drei CE-MS Schnittstellen wurden gut entwickelt und vermarktet in der Geschichte der CE-MS, und sie sind der co-axial Mantel-Flow Schnittstelle23, die sheathless-Schnittstelle mit einer porösen Spitze wie die ESI-Strahler24, und der Elektro-kinetisch gepumpte Scheide fließen Schnittstelle25,26. Die Elektro-kinetisch gepumpten Scheide-Fluss-Schnittstelle-basierte CZE-MS/MS hat eine niedrige Zeptomole Peptid Erkennung Grenze9erreicht, mehr als 10.000 Peptid Identifikationen (IDs) von der HeLa Zelle Proteom in einem einzigen laufen14, eine schnelle Charakterisierung Intakte Proteine11und extrem stabile und reproduzierbare Analysen von Biomolekülen26. Vor kurzem, LPA-beschichtete Trennung Kapillare, die dynamische pH-Kreuzung-Methode und das Elektro-kinetisch gepumpten Scheide Fluss Interface für große Top-Down-Proteomics ein Escherichia coli (E. Coli) Proteoms19 verwendet ,27. CZE-MS/MS-Plattform näherte sich über 500 Proteoform IDs in einem einzigen laufen19 und fast 6.000 Proteoform IDs über Kupplung mit Größe-Exclusion Chromatography (SEC)-RPLC-Fraktionierung27. Die Ergebnisse zeigen deutlich die Fähigkeit der CZE-MS/MS für große Top-Down-Proteomics.
Hier ist ein detaillierte Verfahren unter Verwendung von CZE-MS/MS für große Top-Down-Proteomics beschrieben. CZE-MS/MS-System beschäftigt die LPA-beschichtete Kapillare zur Verringerung der EOF in der Kapillare, die dynamische pH Kreuzung Methode für die Online-Konzentration von Proteinen, die Elektro-kinetisch gepumpten Scheide Fluss Schnittstelle für Kupplung CZE, MS, eine Orbitrap Masse Spektrometer für die Sammlung von MS und MS/MS Spektren von Proteinen und eine anregen (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform Identifizierung und Charakterisierung) Software für Proteoform-ID per Datenbanksuche.

<table><tbody><tr><td>Quarzglaskapillare</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150017</td><td>50 &micro; M I.D. 360 &Mikro; m o.t.</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid-Pellets</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>7708-10</td><td>Korrosives</td></tr><tr><td>Wasser der LC-MS-Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-1</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA48-1</td><td>Korrosives</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td>Giftig, gesundheitsschädlich</td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6514</td><td>Feuchtigkeits- und hitzeempfindlich</td></tr><tr><td>Flusssäure</td><td>Acros Organics</td><td>423805000</td><td>Hochgiftiges</td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Acros Organics</td><td>164855000</td><td>Giftig, gesundheitsschädlich</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Gesundheitsgefahr, Oxidationsmittel</td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Myoglobin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1882</td><td></td></tr>&<tr><td>szlig;-Kasein</td><td>Sgma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>Carboanhydrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3934</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Alfa Aesar</td><td>36428-36</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>Gesundheitsgefahr</td></tr><tr><td>Jodacetamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC122270250</td><td>Gesundheitsgefahr</td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td>Ätzend, gesundheitsgefährdende</td></tr><tr><td>C4-Fallensäule</td><td>Sepax Technologies</td><td>110043-4001C</td><td>3 &micro; m Partikel, 300 & Aring; Poren, 4,0 mm i.d. 10 mm lang</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK-4</td><td>Giftig, Oxidationsmittel</td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1066-33-7</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Schnellstromfilter</td><td>Thermo Scientific</td><td>126-0020</td><td>0,2 &micro; m CN-Membran und</td></tr><tr><td>E. coli-Zellen</td><td></td><td></td> mit 50 mm Durchmesser <td>K-12 MG1655</td></tr><tr><td>Dulbecco-phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>BCA-Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23250</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11-1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-System zur Proteinentsalzung</td><td>Agilient</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Fisher</td><td>Scientific A38-212</td><td></td></tr><tr><td>CE Autosampler</td><td>CMP Scientific</td><td>ECE-001</td><td></td></tr><tr><td>Elektrokinetisch gepumpte Mantelströmungsschnittstelle</td><td>CMP Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HF Hybrid Quadrupol-Orbitrap Massenspektrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutter flammender/brauner Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschall-Zelldisruptor für die Zelllyse</td><td>Branson</td><td>101063196</td><td>Modell S-250A</td></tr><tr><td>Vakuumkonzentrator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD131DDA-115</td><td></td></tr></tbody></table>

groß angelegte top-down-proteomik mit kapillare zone elektrophorese tandem-massenspektrometrie

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Kapillare Zone Elektrophorese-Electrospray Ionisierung-Tandem-Massenspektrometrie (CZE-ESI-MS/MS) wurde als ein nützliches Werkzeug für Top-Down-Proteomics anerkannt, die Proteoforms in komplexen Proteome charakterisieren soll. Jedoch die Anwendung der CZE-MS/MS für große Top-Down-Proteomics hat durch die niedrige Probenbeladung Kapazität behindert wurde und schmale Fenster Trennung von CZE. Hier wird ein Protokoll beschrieben mit CZE-MS/MS mit einem Mikroliter-Skala Probenbeladung Volumen und einem 90-min-Trennung-Fenster für große Top-Down-Proteomics. CZE-MS/MS-Plattform basiert auf einer linearen Polyacrylamid (LPA)-beschichtete Trennung Kapillare mit extrem niedrigen Elektroosmotischer Fluss, eine dynamische pH-Junction-basierte Online-Probe Konzentration Methode mit hohem Wirkungsgrad für Protein zu stapeln, ein Elektro-kinetisch gepumpten Scheide Fluss CE-MS Schnittstelle mit extrem hohe Empfindlichkeit und eine Ionenfallen-Massenspektrometer mit hoher Auflösung und Geschwindigkeit zu scannen. Die Plattform kann für die hochauflösende Charakterisierung von einfachen intakt Proteinproben und die groß angelegte Charakterisierung von Proteoforms in verschiedenen komplexen Proteome verwendet werden. Als Beispiel ist eine hocheffiziente Trennung einer standard Protein-Mischung und eine hochempfindliche Detektion der vielen Verunreinigungen, die Nutzung der Plattform unter Beweis gestellt. Ein weiteres Beispiel dieser Plattform produzieren über 500 Proteoform und 190 Protein Identifikationen von einer Escherichia coli Proteom in einem einzigen CZE-MS/MS führen.

Abbildung 1 zeigt ein Diagramm des dynamischen pH-Junction-basierte CZE-ESI-MS Systems in das Experiment verwendet. Ein langer Stecker der Probe in einem grundlegenden Puffer wird in einem LPA-beschichtete Trennung Kapillare gefüllt mit einer sauren BGE injiziert. Nach der Anwendung von hoher Spannungen werden I und II, die Analyten in der Probe Zone konzentriert über die dynamische pH-Kreuzung-Methode. Um die Ertragskraft der CZE-MS-System wird in d...

Ein detailliertes Protokoll wird für die Trennung, Identifikation und Charakterisierung von Proteoforms in Proteinproben mit Kapillare Zone Elektrophorese-Electrospray Ionisierung-Tandem-Massenspektrometrie (CZE-ESI-MS/MS) beschrieben. Das Protokoll kann für die hochauflösende Charakterisierung von Proteoforms in einfachen Proteinproben und der großen Identifikation von Proteoforms in komplexen Proteom Proben verwendet werden.

Groß angelegte Top-Down-Proteomik mit Kapillare Zone Elektrophorese Tandem-Massenspektrometrie

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Diese Methode kann dazu beitragen, die großflächige und hochauflösende Charakterisierung von Protein-Isoformen und nach-translationalen Modifikationen in Zellen zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Kapillarzonen-Massenspektrometrie eine hocheffiziente Trennung und hochempfindliche Detektion intakter Proteine bietet. Um die Kapillare vorzubehandeln, trocknen Sie sie mindestens 12 Stunden lang mit Stickstoffgas bei 10 psi.Dann füllen Sie die Kapillare mit 50% Volumen-by-Volumen 3-Propylmethacrylat in Methanol mit einer Spritzenpumpe. Beide Enden der Kapillare mit Kieselgummi versiegeln. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für mindestens 24 Stunden mit einer linearen Polyacrylamidbeschichtung an der Innenwand der Trennkapillare, wie im Textprotokoll beschrieben, weiter.Verbrennen Sie einen Teil der Kapillare mit einer sanften Flamme, um die Polyamid-Außenbeschichtung etwa vier Zentimeter von einem Ende der Kapillare entfernt zu entfernen. Reinigen Sie den verbrannten Teil der Kapillare vorsichtig, indem Sie wischen, um die Polyamidbeschichtung vollständig zu entfernen. Bohren Sie ein kleines Loch am Ende eines 200-Mikroliter-Rohrs in der Gleichen Größe wie der Kapillaraußendurchmesser, um die Kapillare ausreichend an Ort und Stelle zu halten, sobald sie durch dieses Loch gefädelt wird.Gewinden Sie das Ende der Kapillare, die sich in der Nähe des verbrannten Teils befindet, durch das Loch, bis sich der verbrannte Teil im Rohr befindet. Fügen Sie dann etwa 150 Mikroliter HF in das 200-Mikroliter-Rohr, so dass die HF-Lösung etwa auf halbem Weg den verbrannten Teil auf der Kapillare ist. Inkubieren Sie die Kapillare in der HF-Lösung bei Raumtemperatur 90 bis 100 Minuten.Bereiten Sie die Standardproteinmischung und die E.coli-Probe wie im Textprotokoll beschrieben vor. Um die Kapillarzonenelektrophorese oder das CZE-System einzurichten, laden Sie die Probe, den Hintergrundelektrolyten und die Trennkapillare in CZE-Auto-Sampler. Wählen Sie die Probenlast auf der manuellen Steuerseite des CZE-Auto-Samplers aus.Laden Sie die Hintergrundelektrolyt-Durchstechflasche in die Pufferwanne des Auto-Samplers und notieren Sie ihre Position in der Pufferschale. Laden Sie dann die Probendurchstechsons in das Probenfach des Auto-Samplers und notieren Sie ihre Position im Probenfach. Setzen Sie den Auto-Sampler mithilfe einer manuellen Steuerung an die Ausrichtungsposition.Laden Sie nun die Trennkapillare mit dem nicht geätzten Ende der Kapillare in den CZE-Auto-Sampler. Passen Sie die Höhe des Injektionsendes der Kapillare an, wenn das Probenvolumen unter 50 Mikrolitern liegt. Schalten Sie den Auto-Sampler über eine manuelle Steuerung in den Standby-Modus.Geben Sie die Probenposition im System ein, und verschieben Sie die Kapillare in die Probe. Drücken Sie das Injektionsende der Kapillare weiter nach unten, um den Boden der Probendurchstechszusen zu erreichen. Wenn Sie die manuelle Steuerung weiterhin verwenden, spülen Sie die Kapillare mit dem Hintergrundelektrolyten 20 Minuten lang mit einem Druck von 20 psi.Montieren Sie nun eine kommerzielle elektrokinetisch gepumpte Mantelflussschnittstelle an der Vorderseite des Massenspektrometers. Füllen Sie das Mantelpufferreservoir mit einem Puffer, der 10 % Volumen-Volumen-Methanol und 0,2 % Volumen-Volumen-Ameisensäure in LCMS-Wasser enthält. Spülen Sie das T in der Schnittstelle mit dem Mantelpuffer, indem Sie den Druck manuell mit einer Spritze aufbringen.Verfädeln Sie das ein Millimeter äußere DurchmesserEnde eines Elektrospray-Emitters durch einen Hülsenschlauch und verbinden Sie den Strahler über einen Anschluss des T über eine Armatur mit einem Anschluss des T. Spülen Sie das T einfach manuell wieder mit einer Spritze, um den Emitter mit dem Mantelpuffer zu füllen. Stellen Sie den Abstand zwischen der Öffnung des Emitters und dem Eingang des Massenspektrometers mit Hilfe der Kamera, die mit der Schnittstelle kam, auf etwa zwei Millimeter ein.Tragen Sie eine Zwei-bis-2,2-Kilovolt-Spannung an der Mantelpufferdurchstechflasche für Elektrospray auf. Passen Sie dann die Sprühspannung an, um ein stabiles Elektrospray zu erreichen. Tragen Sie während dieses Prozesses einen niedrigen Druck am Injektionsende der Kapillare auf, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen in der Kapillare befinden.Schalten Sie die Sprühspannung aus und fädeln Sie das geätzte Ende der Trennkapillare durch das T vorsichtig in den Emitter ein, bis es nicht weiter geschoben werden kann. Nachdem Sie den niedrigen Druck am Einspritzende der Kapillare gestoppt haben, spülen Sie den Emitter etwas mit einem Mantelpuffer. Wenden Sie erneut zwei bis 2,2 Kilovolt Sprühspannung an, um das Spray zu testen.Wählen Sie unter dem Dropdown-Menü Datei auf dem Hauptbildschirm des Instruments eine neue Methode aus. Wählen Sie dort einlass als Startmuster-Durchstechflasche, Endprobe-Durchstechflasche, Tablett als Probe, Druck als fünf psi, Kilovolt als Null und Dauer als 95 Sekunden für eine Probeninjektion. Dann einlass als Einlassdurchstechflasche, Tablett als Puffer, Druck als Null psi, Kilovolt als 30 und Dauer als 4, 200 Sekunden für die Trennung der Standard-Protein-Gemischprobe.Für die Trennung der E.coli-Proteomprobe eingelassen als Einlassdurchstechflasche, Tablett als Puffer, Druck als Null psi, Kilovolt als 20 und Dauer als 6, 600 Sekunden. Wählen Sie schließlich eingelassen als Einlassdurchstechflasche, Tablett als Puffer, Druck als 10 psi, Kilovolt als 30 und Dauer als 600 Sekunden für Kapillarspülung. Richten Sie nun die MS- und MS/MS-Parameter für die intakte Proteinanalyse mithilfe eines Vierfach-Ionen-Trap-Maskenspektrometers ein.Um die Einstellungen der Tune-Datei anzupassen, schalten Sie den intakten Proteinmodus ein und verwenden Sie einen Fangdruck von 0,2. Stellen Sie die Ionentransferkapillartemperatur auf 320 Grad Celsius und die Hf-Stufe der S-Linse auf 55. Um das CZE MS/MS-Experiment durchzuführen, starten Sie die Datenerfassungsmethode auf dem Massenspektrometercomputer, indem Sie zunächst die Ausführungssequenz auswählen.Starten Sie dann die Kapillarelektrophoresesequenz auf dem Kapillarelektrophorese-Auto-Sampler-Computer. Führen Sie eine Datenbanksuche mit TopPIC in der TopPIC-Suite und in der grafischen Benutzeroberfläche von TopPIC durch. Klicken Sie auf die Datenbankdatei, und wählen Sie eine geeignete Datenbank für die Suche aus.Klicken Sie auf die Spektrumdatei und wählen Sie die generierte ms2 aus. msalign-Datei, die als Eingabe generiert wurde. Wählen Sie die MS1-Featuredatei aus, und wählen Sie die generierte Feature-Datei aus.Setzen Sie Cystein-Carbamidomethyl C57 als feste Modifikation aufgrund der Iodoacetamid-Behandlung. Wählen Sie die Decoy-Datenbank-Funktion aus, und wählen Sie unter Cutoff-Einstellungen die falsche Ermittlungsrate im Dropdown-Menü neben der Spektrumebene aus. Legen Sie die falsche Ermittlungsrate auf Spektrumebene auf 0,01 fest.Lassen Sie die Generierungsfunktion deaktiviert und legen Sie die Fehlertoleranz auf 15 Teile pro Million fest. Legen Sie die falsche Ermittlungsrate auf proteoforme Ebene auf 0,05 fest. Wählen Sie unter erweiterte Parameter zwei für die maximale Anzahl von Massenverschiebungen im Dropdown-Menü aus.Legen Sie die maximale Massenverschiebung unbekannter Modifikationen auf 500 Daltons fest. Lassen Sie alle anderen Parameter bei ihren Standardwerten und klicken Sie auf die Start-Schaltfläche unten rechts in der grafischen Benutzeroberfläche. Das repräsentative Elektropherogramm für die Standard-Proteinmischung wird gezeigt.Die Standard-Proteinmischung wird in der Regel mindestens in doppelter Ausführung ausgeführt, um die Trenneffizienz und die Reproduzierbarkeit des Systems zu bewerten. Die Trenneffizienz kann mit der Anzahl der theoretischen Platten einiger Proteine bewertet werden. Die Reproduzierbarkeit kann anhand der relativen Standardabweichungen von Proteinintensität und Migrationszeit beurteilt werden.Die CZE MS/MS-Plattform kann zur großflächigen Charakterisierung von Proteoformen in verschiedenen komplexen Proteomen verwendet werden, wobei über 500 Proteoformen und 190 Proteine aus einem E.coli-Proteom in einem einzigen Durchlauf mit hohem Vertrauen identifiziert werden. Hier kann ein gezoomter Blick auf das Elektropherogramm verwendet werden, um das Trennfenster des Systems zu beurteilen. Der sehr niedrige E-Wert und die spektrale FDR deuten auf die hohe Konfidenz der Proteoform-ID hin. Die hohe Anzahl der abgestimmten Fragmentionen deutet weiter auf die hohe Konfidenz der ID hin. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die geätzte Trennkapillare langsam und schonend in den Elektrospray-Emitter einzufädeln.Stabile Isotopenkennzeichnung oder etikettenfreie Methoden können in das CZE MS-Verfahren integriert werden, um zu bestimmen, wie sich die proteoforme Fülle in den Zellen unter verschiedenen Bedingungen ändert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Top-Down-Proteomik, um die Rolle von Proteoformen bei der Regulierung verschiedener biologischer Prozesse in Zellen zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Flusssäure extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die richtige persönliche Schutzausrüstung und Notfallmaßnahmen sollten immer bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Proteomanalyse des Cochlea-sensorischen Epithel kann eine Herausforderung aufgrund seiner geringen Größe und weil Membranproteine ​​sind schwer zu isolieren und zu identifizieren. Sowohl Membran und lösliche Proteine ​​können durch die Kombination mehrerer Herstellungsverfahren und Trennverfahren mit hochauflösenden Massenspektrometrie identifiziert werden.

Bottom-up-und Shotgun Proteomics, um eine umfassende Cochlear Proteome Identifizieren

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Dieses Manuskript beschreibt das Protokoll für Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP). Diese neuartige Methode ermöglicht bestimmte Isolierung und Charakterisierung der nachgeschalteten Proteomic zwei interagierenden Proteine während ausgenommen un komplexiert einzelne Proteine sowie komplexe mit konkurrierenden Bindungspartner gebildet.

Sezieren Signalisierung Multi-Protein-komplexe durch eine Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP)

Wir präsentieren ein optimiertes Tandem-Massen-Tag-Etikettierungsprotokoll (TMT), das detaillierte Informationen für jeden der folgenden Schritte enthält: Proteinextraktion, Quantifizierung, Niederschlag, Verdauung, Etikettierung, Einreichung an eine Proteomik-Anlage und Datenanalysen.

TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

Das beschriebene Protokoll bietet eine optimierte quantitative Proteomik-Analyse von Gewebeproben mit zwei Ansätzen: markierungsbasierte und markierungsfreie Quantifizierung. Markierungsbasierte Ansätze haben den Vorteil einer genaueren Quantifizierung von Proteinen, während ein markierungsfreier Ansatz kostengünstiger ist und zur Analyse von Hunderten von Proben einer Kohorte verwendet wird.

Umfassender Workflow der massenspektrometrischen Schrotflintenproteomik von Gewebeproben

Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Proteinen vor, die von genomisch sequenzierten pathogenen Bakterien mittels MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit eigens entwickelter Software produziert werden. Metastabile Proteinionen fragmentieren aufgrund der Asparaginsäurewirkung und diese Spezifität wird für die Proteinidentifizierung ausgenutzt.

Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse

Hier wird ein Protokoll für einen Kapillarelektrophorese-basierten Wasserstoff/Deuterium-Austausch (HDX)-Ansatz in Verbindung mit Top-Down-Massenspektrometrie vorgestellt. Dieser Ansatz charakterisiert den Unterschied in Strukturen höherer Ordnung zwischen verschiedenen Proteinspezies, einschließlich Proteinen in verschiedenen Zuständen und verschiedenen Proteoformen, indem er gleichzeitig differentielle HDX- und elektrophoretische Trennung durchführt.

Kapillarelektrophorese-basierter Wasserstoff/Deuterium-Austausch zur Konformationscharakterisierung von Proteinen mit Top-down-Massenspektrometrie

In dieser Arbeit beschreiben wir eine massenspektrometriebasierte proteomische Charakterisierung von Zelllinien mit bekannten Gewebeschicksalen im Embryo von Xenopus laevis im Wirbeltier.

Zellliniengesteuerte Massenspektrometrie-Proteomik im sich entwickelnden (Frosch-)Embryo

Hier etablieren wir eine massenspektrometrische proteomische Methode unter Verwendung isolierter Regionen von Interesse in formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten. Dieses Protokoll wird verwendet, um Proteome aus bestimmten Gewebebereichen in archivierten formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten zu analysieren.

Ein optimierter Ansatz für die massenspektrometrische Proteomik unter Verwendung ausgewählter Geweberegionen

Erfahren Sie die groß angelegte Top-Down-Proteomik mit Kapillarzonenelektrophorese-Tandem-Massenspektrometrie zur hochauflösenden Charakterisierung von Proteoformen und posttranslationalen Modifikationen.

Groß angelegte Top-Down-Proteomik mit Kapillare Zone Elektrophorese Tandem-Massenspektrometrie

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