Name: Lokalisierung von Locus Coeruleus im Gehirn Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Lernen Sie die Lokalisierung des Locus Coeruleus im Mausgehirn mit Immunhistochemie und Metallanalyse. Dieses Protokoll ermöglicht präzise Schnittführung und Untersuchung neuronaler Funktion.

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Wir danken Abigael Muchenditsi für die Wartung der Maus Kolonie. Verwendung von Advanced Photon Source am Argonne National Laboratory wurde unterstützt von der US-Department of Energy, Office of Science, Büro der grundlegenden Energiewissenschaften, unter Vertragsnummer: DE-AC02-06CH11357. Wir danken Olga Antipova und Dr. Stefan Vogt für User-Support und Unterstützung bei der Advanced Photon Source. Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Health Grant 2R01GM101502 SL finanziert.

Studien von Tieren von Johns Hopkins Universität Animal Care und Nutzung (ACUC) Protokollnummer M017M385 gebilligt wurde.
1. Gehirn aufschneiden
<ol><li>Um zu immobilisieren, Mäuse durch die Anwendung von 3 % Isofluran zu betäuben.<ol>
<li>Genießen Sie einen Wattebausch mit Tropfen Isoflurane und legen Sie sie in einem 15 mL Microcentrifuge Schlauch. Legen Sie das Tier Nase in das Rohr und lassen sie die Isofluran zu inhalieren. Überprüfen Sie die Tiefe der Narkose durch den Mangel an Reaktion auf Zehe-Prise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie das Tier auf dem Rücken und durch Festhalten der Extremitäten nach unten mit einem T-Pin beim Zugriff auf seinen Bauch zu immobilisieren.</li>
	<li>Das Tier mit einer chirurgischen Schere durch Herstellung eines Ausschnitts aus der Bauchhaut und schneiden durch die Haut in der Thorax-Region. Fassen Sie die Haut mit Hilfe der T-Pins aus. Dann brechen Sie die peritoneale Membrane bis zu den Brustkorb. Setzen Sie das Herz durch knacken der Brusthöhle und schneiden das Zwerchfell.</li>
	<li>Schneiden Sie den rechten Vorhof, damit das Blut aus dem Tier heraus fließen. Legen Sie eine 10 mL Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel in die linke Herzkammer und durchspülen mit 10 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Hinweis: Dies kann die Lösung durch systemische Zirkulation und Ausgang fließen durch den rechten Vorhof.</li>
	<li>Entfernen Sie 10 mL Spritze, und fügen Sie eine 25-Gauge-Nadel an die 60 mL Spritze befestigt. Durch die linke Herzkammer mit 50 mL Eis kalt 4 % Paraformaldehyd (PFA) durchspülen.<ol>
<li>Bereiten Sie Eis kalt 4 % PFA Lösung durch H2O 10 % PFA Lösung verdünnen und kühlen die endgültige 4 % PFA Lösung bei 4 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolieren Sie den Kopf der Maus zu und entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel.<ol>
<li>Schneiden Sie die Haut vom Hals, und schneiden Sie dann auf die Augen des Schädels aussetzen. Knacken Sie den Schädel vom Hals, die Nase, und dann von einem Auge zum anderen. Schälen Sie den Schädel heraus und Verbrauchsteuern Sie das ganze Gehirn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie das Gehirn bei 4 % PFA für 24 h bei 4 ° C.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gehirn mit der Pinzette in ein 50 mL konische Röhrchen gefüllt mit 25 mL 30 % Saccharoselösung. Halten Sie es bei 4 ° C für 48-72 h, bis das Gehirn an das Ende der Röhre sinkt.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gehirn mit einer erwachsenen Maus Gehirn Hobel Matrix koronalen durch das Mittelhirn (~ 3 mm Posterior des Bregma). Halten Sie die Gehirn-Abschnitt mit dem Hirnstamm. Hinweis: Dies führt im Gehirn zweiteilig – mit am meisten des Kortex (anterior des Schnittes) und eine mit dem Hirnstamm/Kleinhirn (Posterior des Schnittes). Verwenden Sie den Hirnstamm-Abschnitt für die folgenden Schritte.</li>
	<li>Einbetten des Hirnstamm-Abschnitts mit der Schnittfläche platziert auf der Unterseite ein Einbetten von Schimmel, umgeben durch optimale Arbeitstemperatur zusammengesetzten (Okt); bewegen Sie das eingebettete Gehirn bis-80 ° C Gefrierschrank und Einfrieren für mindestens 12 h – bis zur weiteren Verwendung.</li>
	<li>Bei der Kryostat schneiden: Ort der Einbettung Schimmel mit dem Gehirn im Oktober in der Kryostat; inkubieren Sie es in den Kryostaten für mehrere Stunden, um die Temperatur des Gehirns Block mit derjenigen des Kryostaten anzupassen.</li>
	<li>Ziehen Sie die einbettende Form um den OCT-Block mit dem Gehirn verfügbar zu machen.</li>
	<li>Verwenden Sie Rasierklingen, um Überschuss an OCT von der Oberfläche des Blocks zu entfernen, ohne das Gehirn zu berühren.</li>
	<li>Montieren Sie die OCT-Block auf das Futter von den Kryostaten, Freilegung der Schnittfläche des Gehirns nach vorne.</li>
	<li>Einstellen Sie die Schnittfläche des Gehirns so, dass sie parallel zu den Rasierklingen Kryostaten ausgerichtet ist.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gehirn, beginnend bei der Medulla, Rostral 100 µm Abschnitte schneiden.</li>
	<li>Schneiden Sie Rostral, bis das Kleinhirn und der Hirnstamm als eine kontinuierliche Scheibe geschnitten. Beginnen Sie bei 50 µm dicke Scheiben zu sammeln. Hinweis: Da eine Rostral aus der Medulla trimmt, Hirnstamm und Kleinhirn als zwei separate Abschnitte schneidet. Rostral abschnittsweise werden der Hirnstamm und Kleinhirn schließlich auf der Ebene der 4th Ventrikel verschmelzen. Sobald die seitlichen Ränder des 4th Ventrikels wohlgeformt sind, werden dann das Kleinhirn und der Hirnstamm als eine kontinuierliche Scheibe kommen.<ol>
<li>Sammeln Sie OCT-umgeben Gehirn-Scheibe mit der Pinzette zu und legen Sie sie in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte mit PBS (Abbildung 2a) gefüllt. Die LC wird prominentesten das Kleinhirn und der minderwertigen Colliculus einander am ~-5.52 mm posterior des Bregma (Abbildung 1 b treffen). Hinweis: Der am vordere Teil des LC wird verschwinden, sobald das Kleinhirn vollständig geschnitten wurde und nicht mehr die minderwertigen Colliculus bei ~-5.34 mm posterior des Bregma (Abbildung 1 c umgibt).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Immunohistochemistry für Dopamin-β-Hydroxylase oder Tyrosin-Hydroxylase (Abbildung 2)
<ol><li>Tag1<ol>
<li>Waschen Sie die ausgewählten Scheiben drei Mal für 5 min in PBS.</li>
		<li>Permeabilize für 24 h in 0,5 % Phosphat gepufferte Kochsalzlösung mit Reinigungsmittel (PBSD) bei 4 ° C.<ol>
<li>Verdünnen Sie 125 µL des Waschmittels in 25 mL PBS.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tag2<ol>
<li>Waschen Scheiben drei Mal für 5 min in 0,5 % PBSD.</li>
		<li>Fügen Sie die primären Antikörper, Anti-DBH oder Anti-TH 18 h bei einer Verdünnung von 1: 500 in 0,5 % PBSD bei 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tag3<ol>
<li>Waschen Scheiben drei Mal für 10 min bei 0,5 % PBSD.</li>
		<li>Fügen Sie die gewünschten Sekundärantikörper (488 Esel Anti-Kaninchen für grüne Fluoreszenz) bei einer Verdünnung von 1: 1000 in 0,5 % PBSD für 16 h.</li>
		<li>Wickeln Sie die 24-well-Platte in Aluminium und Platz bei 4 ° C.</li>
		<li>Waschen Scheiben drei Mal für 5 min in 0,5 % PBSD.</li>
		<li>Für 5 min in PBS waschen.</li>
		<li>Scheiben mit einem Bleistift Pinsel in einen Wasserbehälter zu übertragen.</li>
		<li>Montieren Sie Scheiben im Wasser auf aufgeladene Folien.</li>
		<li>Deckglas Abschnitte mit hart eingestellt Montage Medien (ohne DAPI).</li>
		<li>Trocknen Sie die montierten Gehirn Abschnitte für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Bild Gehirnscheiben am konfokalen oder fluoreszierende Mikroskop mit Einstellungen Signal von entsprechenden Sekundärantikörper Fluorophor Wellenlänge erkennen.</li>
		<li>Passen Sie das Mikroskop auf der Brennebene des Gehirns Slice und nehmen Sie ein einzelnes Bild bei 10-facher Vergrößerung.</li>
		<li>Um eine mögliche LC-Region im Gehirn-Scheibe zu finden, verwenden Sie die 4th Ventrikel zur Orientierung; Das Kleinhirn befindet sich oberhalb der Ventrikel, Pons und Hirnstamm unter30gefunden werden.</li>
		<li>Um die LC zu finden, konzentrieren Sie sich auf die seitlichen Ränder des Ventrikels 4th ; die LC stammt von den Rändern der 4th Ventrikel und zeigt in Richtung der Pons / Hirnstamm Region (Abb. 2 b, 2 c).</li>
		<li>Folgenden Bildgebung und Lokalisierung der LC in bestimmten Gehirnscheiben speichern Folien mit Gehirnscheiben bei 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Erkennung der LC in Hirnschnitten
<ol><li>Suchen den Gehirn-Abschnitt enthält die LC, das Gehirn der Maus in Scheiben schneiden, wie oben beschrieben und sammeln Abschnitte mit PBS-Puffer gefüllt 24 gut Speisen, wie in Abbildung 2agezeigt.<ol>
<li>Platzieren Sie ein Gehirn Abschnitt pro Bohrloch, um die korrekte Lokalisierung der LC zu ermöglichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Insgesamt 48 Gehirnscheiben, die Immunostained pro Gehirn werden zu sammeln. Hinweis: Die Brunnen von den beiden Gerichte, dargestellt in Abbildung 2a enthalten Hirnschnitten von einem Tier.</li>
	<li>Immunostain jede dritte bis fünfte Scheibe für DBH oder th Führen Sie vorzugsweise Immunohistochemistry diese Gehirn-Scheiben, die an diejenigen, die untersucht werden (per Röntgen-Fluoreszenz-Mikroskopie, XFM) weiter. Hinweis: Dieses Verfahren kann für die genaue Lokalisierung der LC in die endgültige Assay-Scheiben (Abbildung 2a; mit Zahlen zwischen den Wells beschriftet).</li>
	<li>Passen Sie die Anzahl der Gehirnscheiben, die Immunostained je nach Anwendung, z. B., ob sie genaue Position der Mitte und Rand des LC oder nur eine grobe Annäherung erfordern.</li>
	<li>Erkennen Sie nach Immunohistochemistry Gehirnscheiben mit LC über ein charakteristisches Muster des Ausdrucks auf beiden Seiten der 4th Herzkammer (Abb. 2 b, 2 c). Vergrößerung des DBH-Signals im LC von aufeinander folgenden Gehirnscheiben zeigt Abb. 2d, 2e; das vergrößerte Bild des LC, die befleckt ist TH in dargestellt ist Abbildung 2f.
</li>
	<li>Mithilfe der Abschnitte neben diesen mit LC für weitere Studien - in diesem Fall für XFM, um Metall Niveaus (Abbildung 3) zu quantifizieren.</li>
	<li>Um XFM durchzuführen, sammeln Sie 10-30 µm (je nach Konfiguration) dünne koronalen Gehirnscheiben auf Polymeren Dünnschicht mit dem können sie auf Probenhalter montiert und abgebildet am Synchrotron.</li>
	<li>Speichern Sie Gehirnscheiben die sind vorbereitet auf Polymeren Dünnschicht XFM bei Raumtemperatur und XFM.</li>
</ol>(4) Metall Bildgebung in der LC über XFM
<ol><li>Schneiden Sie Gehirn der Maus Beispiel in Scheiben, wie oben beschrieben, bestimmen Sie LC zu und Messen Sie Metall über XFM aus diesen Gehirnscheiben mit der LC.</li>
	<li>Bild elementare Ausschüttungen auf Strahlrohr 2-ID-E auf der Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, Argonne IL).</li>
	<li>Aufzeichnen von Daten "on the Fly" bereits31beschrieben.</li>
	<li>Elementare Konzentrationen in Hirnschnitten, enthält die LC mit dem Programm Karten32,33zu bestimmen.</li>
</ol>

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Richtig ausrichten der Probekörpers ist ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll. Da wir anatomische Merkmale der dorsalen Oberfläche des Gehirns verwendest, um LC (Grenze zwischen Kleinhirn und minderwertigen Colliculus) zu finden, ist es wichtig, dass die Teile richtig ausgerichtet werden. Dies erfordert Sorgfalt bei richtig einstellen das Gehirn in die Maus Gehirn Schneidemaschine Matrix. Es wird empfohlen, ~ 500 μm mehr Gewebe schneiden, Front- und Seitenzahnbereich, LC zu vermeiden, den Zellkern fehlt. Der häu...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58652/localization-of-the-locus-coeruleus-in-the-mouse-brain">Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain</a>.&#160; An author affiliation&#160;was updated.
The affiliation for Evan Maxey was updated from:
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58652/localization-of-the-locus-coeruleus-in-the-mouse-brain">Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain</a>.&#160; An author affiliation&#160;was updated.

Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

Der Locus Coeruleus (LC) ist eine wichtige Region im Hirnstamm und ein wichtiger Standort von Noradrenalin (NE) Produktion1. Die LC sendet Projektionen im gesamten Gehirn2 an den Kortex, Hippocampus und dem Kleinhirn3 und regelt wichtige physiologische Prozesse, einschließlich zirkadianen Rhythmus4,5, Aufmerksamkeit und Gedächtnis6, betonen Sie7, kognitive Prozesse8und Emotion9,10. Dysfunktion des LC hat in neurologische und neuropsychiatrische Erkrankungen11, darunter Parkinson Krankheit12,13,14, Alzheimer-Krankheit14, Depression15 verwickelt ,16,17, bipolare Störung18,19und Angst20,21,22,23, 24. Angesichts dieser Rollen, Analyse der LC ist entscheidend für seine Funktion und Dysfunktion zu studieren.
Mäuse sind für Untersuchungen physiologische und pathophysiologische Prozesse verbreitet. Aufgrund ihrer geringen Größe hat die Maus LC einen Durchmesser von ~ 300 μm, was zu Schwierigkeiten Auffinden der Struktur. Im Gehirn zu schneiden, kann LC im koronalen oder sagittale Abschnitte leicht übersehen werden. Verfügbare Studien beschreiben, Identifizierung von LC bei Tieren bieten kein Schritt für Schritt-Protokoll, dass ein nicht-Experte,1,25folgen kann. Also, um Leitlinien für die Lokalisierung von LC anbieten zu können, beschreiben wir eine Protokoll, die wir entwickelt, um diese Region im Gehirn Maus für mehrere Anwendungen (Abbildung 1, Abbildung 2, , Abbildung 3) zu finden. Das Protokoll gilt sorgfältig kontrollierten Gehirn-Schnitt und immunhistochemische Nachweis von DBH26,27, alternativ TH24, beide Enzyme hochangereichertes in der LC-28. Sobald LC von Immunohistochemistry befindet, können benachbarte Gehirnscheiben für weitere Studien, einschließlich der morphologischen und metabolische Analysen sowie Metall bildgebenden Studien über Röntgen-Fluoreszenz-Mikroskopie (XFM)29verwendet werden. Wir beschreiben XFM als Vorbild in diesem Protokoll (Abbildung 3).

<table><tbody><tr><td></td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 (Quelle - Esel)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger aus geladenem Glas</td><td>Genesee</td><td>29-107</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 505E</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat Schneidklingen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MX35</td><td></td></tr><tr><td>Schere Mini, 9,5cm</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>503241</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Dopamin &beta;-Hydroxylase (DBH) Antikörper - Eigenproduktion (Quelle - Kaninchen)</td><td>B. Eipper</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Dopamin &beta;-Hydroxylase (DBH) Antikörper - kommerziell erhältlich (Quelle - Kaninchen)</td><td>Cell Signaling</td><td>8586</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Röhrchen, 50ml</td><td>USA Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Foran (Isofluoran)</td><td>Baxter</td><td>NDC 1019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Micro Adson</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>501245</td><td></td></tr><tr><td>Hardset Einbettmedien</td><td>EM sciences</td><td>17984-24</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Pascal</td><td>LSM 5</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Well-Platten, 24 Wells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>Optimale Schnitttemperatur Compound (OCT)</td><td>VWR/ Tissue Tech</td><td>102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)/ Formalin 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way Einweg-Einbettformen</td><td>Polysciences Inc. </td><td>18646A</td><td></td></tr><tr><td>Bleistiftbürste</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Life Tech</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B000CMFJZ2</td><td></td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>14374</td><td></td></tr><tr><td>T pins</td><td>Office Depot</td><td>344615</td><td></td></tr><tr><td>Das Mäusegehirn in stereotaktischen Koordinaten, Paxinos und Franklin, 3. Auflage</td><td>Amazon</td><td>ISBN: 978-0123694607</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100 (zur Vorbereitung von PBSD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Tyrosinhydroxylase (TH)-Antikörper (Quelle - Kaninchen)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Ultralen-Dünnschicht für RFA</td><td>SPEX Probenvorbereitung</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr></tbody></table>

lokalisierung von locus coeruleus im gehirn maus

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

Der Locus Coeruleus (LC) ist ein bedeutender Knotenpunkt von Noradrenalin produzierenden Neuronen, die eine Reihe von physiologischen Funktionen zu modulieren. Strukturelle oder funktionelle Anomalien der LC Einfluss auf verschiedene Gehirnregionen einschließlich Kortex, Hippocampus und Kleinhirn und können dazu beitragen, Depressionen, bipolare Störungen, Angst, sowie Morbus Parkinson und Alzheimer-Krankheit. Diese Erkrankungen sind häufig mit Metall Ungleichgewichtigkeit verbunden, aber die Rolle der Metalle in LC ist nur teilweise verstanden. Morphologische und funktionelle Studien von LC sind erforderlich, um besser zu verstehen, die menschliche Pathologien und den Beitrag von Metallen. Mäuse sind ein weit verbreitetes experimentelles Modell, aber die Maus LC ist klein (~0.3 mm Durchmesser) und schwer zu erkennen, für nicht-Experten. Hier beschreiben wir eine Schritt für Schritt Immunohistochemistry-basiertes Protokoll um die LC im Gehirn Maus zu lokalisieren. Dopamin-β-Hydroxylase (DBH), und Alternativ Tyrosin Hydroxylase (TH), beide Enzyme, die hoch in den LC ausgedrückt werden als immunhistochemischen Marker in Hirnschnitten verwendet. Abschnitte neben LC-haltigen Abschnitte können zur weiteren Analyse, einschließlich Histologie für morphologische Studien, Ergospirometrie, sowie Metall-Bildgebung von Röntgen-Fluoreszenz-Mikroskopie (XFM) verwendet werden.

Änderungen in Metall Homöostase (z. B. Cu, Fe, Zn und Mn) werden oft in neurologische Störungen, einschließlich Änderungen in der LC-34,-35beobachtet. So ist die Bestimmung von Metall-Spiegel im Gehirn notwendig für das Verständnis der Krankheitsmechanismen. Die Gehirn-Abschnitte mit den beschriebenen Protokoll generiert können zur Quantifizierung der Ebenen von Cu und anderen Metallen in der LC und im Vergleich zu den Ebenen in R...

Der Locus Coeruleus ist eine kleine Ansammlung von Nervenzellen in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Maus Gehirn Abschnitte auf das Studium der Proteine und Metalle in diesem Kern vorzubereiten.

Lokalisierung von Locus Coeruleus im Gehirn Maus

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

Dysfunktion des Locus coeruleus wurde in neurologische und neuropsychiatrische Störungen verwickelt, einschließlich Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Depression, bipolare Störung, und Angst. Angesichts dieser Rollen ist die Analyse von locus coeruleus entscheidend für die Untersuchung seiner Funktion und Dysfunktion. Während der Maus-Gehirn-Sektion, der Locus coeruleus kann leicht in koronalen oder sagittalen Abschnitten aufgrund seiner geringen Größe verpasst werden.Um Anleitungen für die Lokalisierung von locus coeruleus zu bieten, beschreiben wir ein Protokoll, das wir entwickelt haben, um diese Region im Maushirn für mehrere Anwendungen zu lokalisieren. Beginnen Sie damit, frisch isoliertes Gehirn einer anästhesierten und dann perfundierten Maus in 4%PFA in einer 50-Milliliter-Röhre zu platzieren. Inkubieren Sie das Gehirn für 24 Stunden bei vier Grad Celsius.Verwenden Sie Zangen, um das Gehirn in ein 50-Milliliter konisches Rohr zu übertragen, das mit 25 Millilitern 30%Saccharoselösung gefüllt ist. Inkubieren Sie es bei vier Grad Celsius für 48 bis 72 Stunden, bis das Gehirn auf den Boden der Röhre sinkt. Um den Hirnstammabschnitt einzubetten, legen Sie seine schnittoberfläche auf den Boden einer Einbettform, und fügen Sie eine optimale Schnitttemperaturverbindung hinzu, um den Hirnstamm zu umgeben.Einfrieren Des eingebetteten Gehirns in einem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius für mindestens 12 Stunden bis zur weiteren Verwendung einfrieren. Legen Sie die Form mit dem Gehirn in den Kryostat und inkubieren Sie es für mehrere Stunden, um seine Temperatur an die des Kryostats anzupassen. Um den OCT-Block mit dem Gehirn freizulegen, verwenden Sie eine Rasierklinge, um die vier Kanten der Form bis zum Boden zu schneiden, und schälen Sie dann die Einbettform davon.Verwenden Sie Rasierklingen, um überschüssiges OCT von der Oberfläche des Blocks zu entfernen, um sicherzustellen, dass das Gehirn nicht berührt wird. Dann montieren Sie den OCT-Block auf dem Spannfutter des Kryostats und legen Sie die schnittige Oberfläche des Gehirns nach vorne frei. Um das Gehirn anzupassen, orientieren Sie die schnittoberfläche parallel zu den Rasierklingen des Kryostats.Die richtige Ausrichtung der Probe ist ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll. Da wir anatomische Merkmale der dorsalen Oberfläche des Gehirns verwenden, um LC zu lokalisieren, wie z. B. die Grenze zwischen Kleinhirn und minderwertigem Colliculus, ist es wichtig, dass die Abschnitte richtig ausgerichtet werden. Dies erfordert Sorgfalt bei der richtigen Einstellung des Gehirns in die Maus Gehirn Slicer Matrix.Schneiden Sie das Gehirn beginnend an der Medulla, schneiden 100-Mikrometer-Abschnitte rostral. Sobald das Kleinhirn und der Hirnstamm beginnen, als eine kontinuierliche Scheibe auf der Ebene des vierten Ventrikels zu schneiden, beginnen Sie, Scheiben mit 50 Mikrometer Dicke zu sammeln. Verwenden Sie Zangen, um jede Gehirnscheibe zu sammeln und legen Sie es in einem Brunnen einer 24-Well-Platte mit PBS gefüllt.Der Locus coeruleus wird am deutlichsten in einer Scheibe, wo das Kleinhirn und minderwertige Colliculus einander bei etwa 5,52 Millimeter hinter dem Bregma treffen. Am ersten Tag die Gehirnscheiben in der 24-Well-Platte dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS waschen. Dann 0,5%PBS mit Waschmittel hinzufügen und sie bei vier Grad Celsius für 24 Stunden durchpermeabilisieren.Am nächsten Tag die Scheiben dreimal für jeweils fünf Minuten mit 0,5%PBSD waschen. Fügen Sie dann den primären Antikörper bei einer Verdünnung von ein bis 500 in 0,5% PBSD hinzu und brüten bei vier Grad Celsius für 18 Stunden. Am dritten Tag die Scheiben dreimal für jeweils 10 Minuten mit 0,5%PBSD waschen und dann den sekundären Antikörper bei einer Verdünnung von eins bis 1000 in 0,5% PBSD hinzufügen.Die Platte mit Aluminiumfolie umwickeln und 16 Stunden bei vier Grad Celsius bebrüten. Nach der Inkubation die Scheiben dreimal für jeweils fünf Minuten mit 0,5%PBSD und dann fünf Minuten in PBS waschen. Bedecken Sie die Abschnitte mit fest gesetztem Montagemedium ohne DAPI.Mit einer Glasabdeckung abdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Verwenden Sie dann ein konfokales Mikroskop mit Einstellungen, um Signal von der entsprechenden Fluoreszenzwellenlänge zu Bildhirnscheiben zu erkennen. Nachdem Sie das Mikroskop an die Brennebene der Hirnscheibe angepasst haben, verwenden Sie die 10-fache Vergrößerung, um ein einzelnes Bild aufzunehmen.Verwenden Sie die vierte Herzkammer unterhalb des Kleinhirns und über Pons und Hirnstamm, um eine mögliche LC-Region in der Gehirnscheibe zu lokalisieren. Konzentrieren Sie sich auf die seitlichen Ränder des vierten Ventrikels und der LC wird von den Rändern des vierten Ventrikels aus in Richtung der Pons Brainstem Region platziert werden. Die intrazelluläre Verteilung von Dopamin-Beta-Hydroxylase, einem im LC exprimierten Protein, wurde mit diesem Protokoll untersucht, um die LC-Morphologie und die neuronale Dichte zu untersuchen.Ein weiteres Protein, das in der LC exprimiert wurde, Tyrosinhydroxylase, zeigte ebenfalls ein starkes grünes Fluoreszenzsignal in Hirnscheiben, die den LC enthalten. Veränderungen der Metallhomöostase werden häufig bei neurologischen Störungen beobachtet, einschließlich Veränderungen in der LC.In diesem Beispiel, wenn eine durch den LC geschnittene Hirnscheibe für Phosphat, Kalium, Zink und Kupfer gemessen wurde, nur Kupfer zeigte eine spezifische Erhöhung des Signals. Wir empfehlen, etwa 500 Mikron mehr Gewebe vor und hinter lc zu schneiden, um zu vermeiden, dass der Kern fehlt, und mehr Abschnitte als nötig zu schneiden, vor allem, wenn dieses Protokoll zum ersten Mal durchgeführt wird. Sorgfältige Untersuchung der Gehirnatlas-Bilder vor der Färbung ist sehr hilfreich.Sobald LC durch Immunhistochemie lokalisiert ist, können benachbarte Gehirnscheiben für weitere Studien verwendet werden, einschließlich morphologischer und metabolischer Analysen, sowie Metallbildgebungsstudien mittels Röntgenfluoreszenzmikroskopie. Die mit dem beschriebenen Protokoll erzeugten Hirnabschnitte können verwendet werden, um den Kupfergehalt und andere Metalle im LC zu quantifizieren und mit den Werten in Regionen außerhalb des LC zu vergleichen, was für das Verständnis des Krankheitsmechanismus erforderlich ist. Weitere mögliche Anwendungen dieses Protokolls sind der Nachweis von Häufigkeit und intrazellulärer Verteilung von Dopamin-Beta-Hydroxylase, Tyrosin-Hydroxylase und anderen Proteinen, die im LC einzeln oder in den Co-Staining-Assays, Studien der LC-Morphologie und der neuronalen Dichte exprimiert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir beschreiben ein Protokoll für transcardiac Perfusion von Mäusen, die Entfernung und Schnitte des Gehirns sowie Immunperoxidasefärbung, Harz eingebettet, und ultradünne Schnitte des Gehirns Abschnitten. Nach Abschluss dieser Verfahren ist die immungefärbt Material bereit zur Untersuchung mit der Transmissionselektronenmikroskopie.

Vorbereitung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie

Quelle: Xavier, A. L. R., et al. Kanülenimplantation in die Cisterna Magna von Nagetieren. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Implantation einer Kanüle in die Cisterna magna einer anästhesierten Maus. Bei der Technik wird eine auf der Nadel befestigte Kanüle durch die Dura in die umgekehrte dreieckige Cisterna magna geführt und für die gezielte Abgabe in das Liquor cerebrospinalis gesichert.

Kanülenimplantation in die Cisterna Magna im Mausmodell

Dieses Video zeigt die In-vivo-Aufzeichnung des lokalen Feldpotentials (LFP) aus bilateralen M2-Bereichen des Mäusegehirns. Eine betäubte Maus wird gesichert und für den Eingriff vorbereitet. Um LFPs aufzunehmen, führen Sie Mikroelektroden in die Zielkoordinaten der bilateralen M2-Bereiche ein, die für komplexe motorische Bewegungen verantwortlich sind.

Aufzeichnung des lokalen Feldpotentials aus beiden Hemisphären des Mausgehirns

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Immunhistochemie zur Identifizierung von Locus coeruleus-Regionen in Schnitten des Mausgehirns. Durch die gezielte Beeinflussung von Dopamin-β-Hydroxylase mit grün fluorophormarkierten Antikörpern werden Noradrenalin-produzierende Neuronen unter dem Mikroskop als grüne Fluoreszenz sichtbar gemacht.

Immunhistochemie zur Identifizierung der Locus coeruleus-Region in Hirnschnitten von Mäusen

Dieses Video zeigt die immunhistochemische Färbung cholinerger Fasern im Nucleus basalis der Meynert-Region von Schnitten aus dem Gehirn von Mäusen. Die Schnitte werden blockiert und mit primärer Cholin-Acetyltransferase behandelt, gefolgt von biotinylierten Sekundärantikörpern. Es werden Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexe zugesetzt, die an Sekundärantikörper binden, gefolgt von dem chromogenen Substrat. Die Schnitte werden dann dehydriert und montiert, bevor sie unter dem Mikroskop sichtbar...

Immunhistochemische Färbung von Nervenfasern im Nucleus basalis von Meyner des Mausgehirns

Hier beschreiben wir eine Vorgehensweise für Gewebe, clearing, fluoreszierende Kennzeichnung und umfangreiche Darstellung der Maus Hirngewebe, die dadurch ermöglicht die Visualisierung der dreidimensionalen Organisation der Zelltypen der Großhirnrinde.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

Wir präsentieren in vivo elektrophysiologische Aufzeichnung des lokalen Feldpotentials (LFP) in bilateraler sekundärer motorischer Kortex (M2) von Mäusen, die zur Bewertung der Hemisphärenlateralisierung angewendet werden können. Die Studie ergab veränderte Synchronisationsniveaus zwischen dem linken und rechten M2 in APP/PS1-Mäusen im Vergleich zu WT-Kontrollen.

Bewertung der Hemisphärenlateralisierung mit bilateraler lokaler Feldpotentialaufzeichnung im sekundären Motorcortex von Mäusen

Um zu überprüfen, ob trigeminale Auswirkungen auf die kognitive Leistungsfähigkeit eine Locus coeruleus-Aktivität beinhalten, werden zwei Protokolle vorgestellt, die darauf abzielen, mögliche Korrelationen zwischen der Leistung und aufgabenbezogenen Pupillengrößenänderungen, die durch Das Kauen induziert werden, zu bewerten. Diese Protokolle können auf Bedingungen angewandt werden, unter denen der Beitrag des Locus coeruleus vermutet wird.

Beurteilung von schülergebundenen Veränderungen in Locus Coeruleus-vermittelter Erregung, die durch Trigeminusstimulation ausgelöst wird

Mit optogenetischer Manipulation bestimmter neuronaler Populationen oder Hirnregionen kann das Verhalten bei frei beweglichen Tieren mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung verändert werden. Durch den Einsatz verschiedener optogenetischer Werkzeuge in Kombination mit chronisch implantierten optischen Fasern kann eine Vielzahl neuronaler Modulationen und Verhaltenstests durchgeführt werden.

Optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität, um das Verhalten bei frei beweglichen Mäusen zu modulieren

Die stereotaktische Chirurgie zur Ausrichtung auf Gehirnstellen bei Mäusen beinhaltet häufig den Zugang durch die Schädelknochen und wird von Schädel-Landmarken geleitet. Hier skizzieren wir einen alternativen stereotaktischen Ansatz, um den kaudalen Hirnstamm und das obere zervikale Rückenmark über die Cisterna magna anzusprechen, der auf der direkten Visualisierung von Hirnstamm-Landmarken beruht.

Stereotaktischer chirurgischer Ansatz zur Mikroinjektion des kaudalen Hirnstamms und des oberen zervikalen Rückenmarks über die Cisterna magna bei Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Bildgebung von Kalziumantworten im Colliculus superior (SC) von wachen Mäusen, einschließlich der Abbildung der Aktivität einzelner Neuronen mit Zwei-Photonen-Mikroskopie, während der Kortex bei Wildtyp-Mäusen intakt bleibt, und der Abbildung des gesamten SC mit Weitfeldmikroskopie bei Mäusen mit Teilkortex-Mutante.

Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus

Lernen Sie die Lokalisierung des Locus Coeruleus im Mausgehirn mit Immunhistochemie und Metallanalyse. Dieses Protokoll ermöglicht präzise Schnittführung und Untersuchung neuronaler Funktion.

Lokalisierung von Locus Coeruleus im Gehirn Maus

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