Name: Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Erfahren Sie die Transfektion von Makrophagen mit PEI-beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln zur siRNA-Lieferung in vitro und in vivo. Diese effiziente Methode ermöglicht gezieltes Gene Silencing für therapeutische Anwendungen.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81772308) und National Key Research and Development Program of China (Nr. 2017YFA0205502) unterstützt.

Alle Methoden, die mit lebenden Tieren, im Einklang mit dem Tier durchgeführt wurden kümmern und Richtlinien der Southeast University, China.
1. Vorbereitung des PEI-Mondfotos
<ol><li>
Vorbereitung der Ölsäure geändert Mondfotos
	<ol>
<li>Lösen sich FeCl3•6H2O und FeSO4•7H2O in Wasser unter dem Schutz der N2.<ol>
<li>Hinzufügen von FeCl3•6H2O 28 g und 20 g FeSO4•7H2O in 80 mL entionisiertem Wasser in ein Becherglas. Führen Sie N2 in das Wasser durch eine Glas-Leitung ein und rühren Sie, bis die feste Materie aufgelöst hat.</li>
			<li>Erhitzen Sie das Reaktionsgemisch auf 72 ° C mit einer mitreißenden Rate von 800 u/min, gefolgt von Zugabe von 40 mL Ammoniakwasser (28 %). 5 min köcheln.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hinzugeben Sie 9 mL Ölsäure tropfenweise in die oben genannten Lösung und rühren Sie es bei 72 ° C für 3 h.</li>
		<li>Kühlen Sie die resultierende Lösung auf Raumtemperatur (RT). Die Lösung über magnetische Trennung herbeiführen.</li>
		<li>Waschen Sie den Niederschlag mit Mondfotos 3 X mit absoluten Spiritus und dann den Niederschlag in 100 mL N-Hexan zu zerstreuen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Dimercaptosuccinic Säure-modifizierte Mondfotos
	<ol>
<li>Hinzufügen von 800 mg von Ölsäure (OA)-geändert Mondfotos zerstreut in 200 mL N-Hexan und 400 mg Dimercaptosuccinic Säure (DMSA) in 200 mL Aceton, dispergiert in einem drei-Hals-Kolben in einem Wasserbad bei 60 ° C. Hinweis: Zur Bestimmung der Konzentration von OA-modifizierte SPION aus dem vorherigen Schritt erhalten, nehmen Sie ein kleines Volumen (z.B. 1 mL) der SPION Dispersion, verdampfen Sie das N-Hexan und wiegen Sie das resultierende Pulver.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL Triethylamin tropfenweise in die oben genannten Lösung mit Rühren bei 1.000 u/min und zurückfließt.</li>
		<li>Erhalten Sie nach 5 h rühren und zurückfließt einen schwarzen Niederschlag durch magnetische Trennung.</li>
		<li>Die hydrophilen Mondfotos in entionisiertem Wasser homogen durch den pH-Wert der Lösung mit Tetramethylammonium Hydroxid zu zerstreuen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der PEI-Mondfotos
	<ol>
<li>DMSA-modifizierte SPION kolloidalen Lösung tropfenweise hinzufügen, in PEI-Lösung (10 kDa) in einen 500-mL drei Hals Kolben unter mechanischen Rühren bei 1.000 u/min für 2 h (WFe: WPEI = 1:3). Hinweis: Die Ladung und Größe des PEI-Mondfotos variieren je nach Verhältnis von WFe WPEI. Der W-Fe: WPEI -Verhältnis von 1:3 kann ein guter Ausgangspunkt zur Synthese von PEI-Mondfotos für SiRNA Delivery geeignet sein.</li>
		<li>Fügen Sie die resultierende Lösung in eine Ultrafiltration Rohr mit einem Molekulargewicht Cutoff von 100 kDa und einen Inhalt von 15 mL; dann, Zentrifuge bei 5.400 x g für 10 min bis die restliche Lösung 1 mL ist. Die Lösung für das Volumen 15 mL wieder machen und wiederholen den obigen Vorgang 10 deionisiertes Wasser hinzufügen X, um das Endprodukt zu erhalten. Dann filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-μm-Filter und speichern Sie das Endprodukt bei 4 ° C.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Fe-Konzentration von PEI-Mondfotos durch die kolorimetrischen Verfahren unter Verwendung Phenanthroline17. PEI-Mondfotos mit entionisiertem sterilem Wasser zu einer Konzentration von 1 mg Fe/mL verdünnen und bei 4 ° c lagern</li>
		<li>Verdünnen Sie 10 μL der PEI-SPION-Lösung (1 mg Fe/mL), 1 mL mit entionisiertem Wasser; Anschließend testen Sie die hydrodynamischen Größe und Zetapotenzial durch ein dynamischen Lichtstreuung Gerät. Hinweis: Bereiten Sie PEI-Mondfotos im Bereich von etwa 30-50 nm. In diesem Größenbereich scheint die Wirkung der NP Größe auf SiRNA Bindung und zelluläre Aufnahme nicht erheblich sein. PEI-Mondfotos mit einer durchschnittlichen Zeta-Potential über + 37 mV in der Dosisbereich zur Transfektion toxisch sein kann, und ein Zytotoxizität-Assay durchgeführt werden, um Sicherheit zu gewährleisten. Die Oberflächenladung und hydrodynamischen Größe der Nanopartikel können durch Anpassen der PEI-Inhalte innerhalb eines gewünschten Bereichs gesteuert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung und Agarose-Gelelektrophorese PEI-SPION/SiRNA NPS
<ol><li>Verdünnen Sie SiRNA mit RNase-freies Wasser um eine Endkonzentration von 20 μM (0,26 µg/μl) zu erzielen.</li>
	<li>Bereiten Sie fünf RNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen beschriftet, 0, 1, 2, 4 und 8. Die Etiketten sind verschiedene Fe: SiRNA-Gewichts-Verhältnis. Pipettieren 3 μL der SiRNA-Lösung für alle Rohre (~0.8 μg SiRNA/Röhre).</li>
	<li>Fügen Sie 0, 0,8, 1,6 mm, 3,2 und 6.4 μg Fe in Form von PEI-Mondfotos beschriftet 0, 1, 2, 4 und 8, bzw. Rohre hinzu. Halten Sie die Gesamtstichprobe jede Röhre weniger als 20 μL. Mischen Sie, indem Sie sanft auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischungen bei RT für 30 min, PEI-SPION/SiRNA Komplexbildung zu ermöglichen. Während dieser Zeit machen Sie eine 3 % Agarose mit hohem Reinheitsgrad Agarose-gel. Hinweis: Zusätzliche PEI-SPION/SiRNA-komplexe mit anderen Fe: SiRNA-Verhältnisse (z.B.5 oder 6) können vorbereitet und getestet werden.</li>
	<li>1 μl 6 x DNA Loading Puffer je 5 μl Probe hinzufügen und vorsichtig mischen. Laden Sie alle Proben und Elektrophorese mit 5 V/cm ausgeführt, bis die Bromophenol Blue bis zu zwei Drittel der Länge des Gels migriert. Färben Sie das Gel mit Interkalation Bromid (EB) für 15-20 min. Hinweis: Frisch zubereitete Elektrophorese Puffer und EB-Lösung sollte verwendet werden.</li>
	<li>SiRNA Bands unter einem UV-imaging-System zu visualisieren. Überprüfen Sie die Fe: SiRNA-Verhältnisse an die SiRNA Formen komplexe mit PEI-Mondfotos und infolgedessen die Bands kostenlos SiRNA vertreten sind, verzögert oder nicht nachweisbar.</li>
</ol>3. die Transfektion von RAW264.7 Makrophagen In-vitro-
<ol><li>Kultur Mauszellen Makrophagen-wie RAW264.7-ein 10-cm-Schüssel mit DMEM komplette mittlere mit 10 % fötalen Rinderserum (FBS) pro 100 U/mL Penicillin pro 100 μg/mL Streptomycin bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator.</li>
	<li>Aspirieren Sie einen Tag vor der Transfektion Medium aus den Zellen und spülen Sie sie mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4). Die 10-cm-Schüssel 1 mL von 0,25 % Trypsin hinzufügen. Trypsinize RAW264.7 Zellen für ca. 5-10 min bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator.</li>
	<li>Wenn die Mehrheit der Zellen (nach ca. 5-10 min) getrennt haben, fügen Sie 5 mL DMEM komplette Medium in die Schale, die Trypsin zu inaktivieren. Pipettieren rauf und runter, Zellcluster in Einzelzellen zu zerstreuen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine sterile 15 mL konische Rohr. Zentrifugieren sie 300 X g für 3 min bei RT. Entfernen Sie überstand.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zellen mit 5 mL frischem DMEM komplette Medium und die Zellen zu zählen.</li>
	<li>Platte 9 x 104 Zellen pro auch in einem 6-Well-Platte mit 2 mL des kompletten DMEM Medium und Inkubation bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator für ca. 24 h. Hinweis: Wenn Sie einen Teller mit einer anderen Größe zu verwenden, einstellen Sie die vergoldeten Zelldichte im Verhältnis zu der relativen Fläche so, dass die Zellen 80 % Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion erreichen.</li>
	<li>Wenn Zelle Konfluenz 80 % ist, entfernen Sie das Medium aus den Zellen zu und ersetzen Sie es mit 1 mL DMEM komplette Medium pro Bohrloch. Rückkehr der Plattenrandes in den Inkubator bis PEI-SPION/SiRNA-komplexe vorbereitet worden und sind bereit für den Einsatz (ca. 30 min).</li>
	<li>Bereiten Sie PEI-SPION/SiRNA-komplexe: berechnen Sie die Menge der PEI-SPION/SiRNA-komplexe für eine Transfektion Experiment benötigt. Mischen Sie in einem 1,5 mL RNase-freie Microcentrifuge Schlauch einen angemessenen Betrag von PEI-Mondfotos mit SiRNA bei einem bestimmten Fe: SiRNA-Verhältnis. Zum Beispiel um PEI-SPION/SiRNA NPs enthält 100 µg Fe bei einem Fe: SiRNA-Verhältnis von 4 vorzubereiten, addieren Sie 100 µL (1 mg Fe/mL) PEI-Mondfotos, 96 μL von SiRNA (0,26 µg/μl), gefolgt von sanft mit einer Mikropipette mischen. 30 min bei RT inkubieren Hinweis: Bereiten Sie ein Volumen von PEI-SPION/SiRNA-Komplex, 10 % mehr als die abschließende Gesamtmasse entfallen jegliche anfallende Verluste ist. Stellen Sie PEI-SPION/SiRNA-komplexe bei niedrigen Fe: SiRNA Verhältnisse, unter denen SiRNA-Moleküle werden auf PEI-Mondfotos vollständig geladen und somit können kleine Mengen von PEI-Mondfotos verwendet werden, um potenzielle Zytotoxizität zu minimieren. Pilotprojekte (Gel Retardierung Assay) für die Optimierung des Fe: SiRNA sind notwendig.</li>
	<li>Nehmen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator (Schritt 3,7). Fügen Sie eine gewünschte Lautstärke des PEI-SPION/SiRNA komplexes tropfenweise in jede Vertiefung und wirbeln Sie die Platte vorsichtig um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Die Platte in den Inkubator erst die Bewertung der zellulären Aufnahme oder gen Knockdown Effizienz (1-3 d) zurück. Hinweis: Transfecting Makrophagen mit PEI-SPION/SiRNA in einer Konzentration von ~ 15 μg Fe/mL können Transfection Leistungsfähigkeit maximieren bei gleichzeitiger Minimierung der möglichen Zytotoxizität.</li>
</ol>4. systemische Lieferung von SiRNA zu Makrophagen bei Ratten mit experimentellen Arthritis
<ol><li>Erhalten Sie spezifische Erreger-freie männliche Wistar-Ratten, die 7 Wochen alt sind. Gewöhnen Sie die Ratten für 7D vor Gebrauch und versorgen sie mit ausreichend Nahrung und Wasser. Adjuvanter Arthritis (AA) bei den Ratten als zuvor beschriebenen18zu induzieren.</li>
	<li>Bereiten Sie PEI-SPION/SiRNA-komplexe wie in Schritt 3.8 beschrieben vor.</li>
	<li>Die PEI-SPION/SiRNA NPs (0,3 mg von SiRNA/kg) in der AA Ratten über die Rute Vene injizieren. Bewerten der zelluläre Aufnahme über, zum Beispiel Durchflusszytometrie, Gewebe Bioverteilung über, zum Beispiel eine Echtzeit-Fluoreszenz imaging-System, oder therapeutische Wirkungen anhand z. B. klinische, histologische und radiologische Analysen zur gewünschten Zeit weist18. Hinweis: Für Mobilfunk und Gewebe Bioverteilung Studien, behandeln Sie die Ratten mit einer einzigen Injektion die gewünschte NPS; injizieren Sie für Therapiestudien die Ratten mit dem NPs geprüft 1 x pro Woche für drei aufeinander folgende Wochen sein.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Makrophagen sind refraktär gegenüber von häufig verwendeten nonviral Ansätze wie Elektroporation, kationische Liposomen und Lipid Arten transfizieren. Hier haben wir eine zuverlässige und effiziente Methode, um Makrophagen mit SiRNA transfizieren. Mit Hilfe dieses Protokolls, werden über 90 % der Makrophagen-wie RAW 264,7 Zellen (Abb. 2 b) und Ratte peritonealen Makrophagen18 mit SiRNA ohne wesentliche Beeinträchtigung des die Zellviabilität transfiziert können. Diese...

Makrophagen sind eine Art von angeborenen immunen Zellen verteilt in allen Körpergeweben, wenn auch in unterschiedlichen Mengen. Durch die Herstellung einer Vielzahl von Zytokinen und anderer Vermittler, spielen sie wichtige Rollen in der Wirt Verteidigung gegen eindringende mikrobielle Krankheitserreger, in Reparatur von Gewebe nach Verletzungen und bei der Aufrechterhaltung der Homöostase-Gewebe1. Aufgrund ihrer Bedeutung waren Makrophagen kontinuierlich Gegenstand intensiver Forschung. Jedoch trotz der Prävalenz in der Genregulation und Funktionsstudien, SiRNA-vermittelten Gen-silencing ist weniger wahrscheinlich, da in Makrophagen erfolgreich diese Zellen – insbesondere primäre Makrophagen – sind oft schwer zu transfizieren. Dies kann eine relativ hohe Toxizität im Zusammenhang mit etabliertesten Transfektion Ansätze, in denen die Zellmembran chemisch ist (z. B.mit Polymeren und Lipide) zugeschrieben werden oder körperlich (z.B.durch Elektroporation und gen Kanonen) gestört, um SiRNA-Moleküle die Membran, dadurch drastisch Makrophagen Lebensfähigkeit2,3überqueren zu lassen. Darüber hinaus sind Makrophagen spezielle Fresszellen, die reich an abbauende Enzyme. Diese Enzyme können die Integrität von SiRNA, die Stummschaltung Effizienz zu schwächen, auch wenn in der Zelle3,4Gen-spezifischen SiRNA geliefert wurde beschädigt. Daher muss eine wirksame Makrophagen ausgerichtete SiRNA Delivery-System zum Schutz der Integrität und Stabilität von SiRNA während Lieferung4.
Es wird immer offensichtlicher, dass dysfunktionale Makrophagen in der Initiierung und Progression von bestimmten gemeinsamen klinischen Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen, Arteriosklerose und Krebs verwickelt sind. Aus diesem Grund Modulation Makrophagen-Funktion mit, zum Beispiel, SiRNA hat als eine attraktive Methode für die Behandlung dieser Erkrankungen5,6,7aufgetaucht. Obwohl große Fortschritte erzielt wurden, ist eine große Herausforderung SiRNA basierenden Behandlungsstrategie der Arme Zelle Besonderheit der systemisch verabreichten SiRNA und die unzureichende SiRNA-Aufnahme durch Makrophagen, die somit zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. Im Vergleich mit kostenlosen Nukleinsäure-Therapeutika, die in der Regel fehlt optimale Zelle Selektivität und führen oft zu Nebenwirkungen, Medikament beladenen Nanopartikeln (NPs), aufgrund ihrer spontanen Neigung gefangen vom retikuloendothelialen System Ziel, für passive targeting zu Makrophagen in Vivo, zulassend verbesserten therapeutischen Wirksamkeit mit minimalen Nebenwirkungen8projektierbar. Aktuelle NPs erforscht für die Lieferung von RNA-Molekülen gehören anorganische darin, verschiedene Liposomen und Polymere-9. Unter anderem zeigt Polyethyleneimine (PEI), eine Art von kationischen polymeren in der Lage zu binden und kondensierenden Nukleinsäuren in stabilisierter NPs, die höchsten RNA liefert Kapazität9,10. PEI schützt Nukleinsäuren vor enzymatischen und nonenzymatic Abbau, vermittelt ihre Übertragung über die Zellmembran und fördert ihre intrazellulären Freigabe. Obwohl zunächst als ein DNA-Lieferung-Reagenz eingeführt, zeigte sich PEI anschließend zu einer attraktiven Plattform für in Vivo SiRNA Delivery, entweder lokal oder systemisch9,10.
Superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (Mondfotos) zeigten viel versprechend in der Biomedizin, aufgrund ihrer magnetischen Eigenschaften, Biokompatibilität, vergleichbarer Größe auf biologisch wichtige Objekte, hohe Oberfläche-Bereich-zu-Volumen-Verhältnis und leicht anpassbar Oberfläche für Bioagent Anlage11. Zum Beispiel haben wegen ihres potenziellen Nutzens als Kontrastmittel und schnelle Aufnahme durch Makrophagen Mondfotos als klinische Lieblingswerkzeug Bild Gewebe Makrophagen12entstanden. Während Mondfotos als Nukleinsäure-Lieferung Fahrzeuge11,13,14,15, nach unserer Kenntnis auch ausgiebig studiert haben enthält die Literatur einige Berichte von Mondfotos als Träger für Makrophagen-gezielte SiRNA Lieferung. Gen-Lieferung von Mondfotos ist ihre Oberfläche in der Regel mit einer Schicht von hydrophilen kationischen polymeren beschichtet auf dem negativ geladenen Nukleinsäuren elektrostatisch angezogen und angebunden werden können. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Synthese von Mondfotos, dessen Oberfläche mit niedrigem Molekulargewicht (10 kDa), verzweigte PEI (PEI-Mondfotos) geändert wird. Diese magnetische Nanoplatforms werden dann eingesetzt, um kondensieren SiRNA, bilden PEI-SPION/SiRNA-komplexe, die SiRNA-Transport in die Zelle zu ermöglichen. Wir Grund, dass spontane Phagozytose von Mondfotos durch Zellen des retikuloendothelialen System16, gepaart mit der starken Fähigkeit der Bindung und kondensierenden Nukleinsäuren von PEI, rendert PEI-Mondfotos geeignet für den effizienten Transport von SiRNA in Makrophagen. Die hier vorgestellten Daten unterstützen die Machbarkeit des PEI-SPION/SiRNA-mediated Gene silencing in Makrophagen in Kultur als auch in Vivo.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Warm in 37° C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>A31608-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (1,5 ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Tetrazolium-basiertes MTS-Assay-Kit</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>Für die Zytotoxizitätsanalyse</td></tr><tr><td>RAW 264.7 Zelllinie</td><td>Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Shanghai, China</td><td>TCM13</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturplatten (6-Well)</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschalen (10 cm)</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>RNasefreie Röhrchen (1,5 ml)</td><td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen (15 ml)</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Wistar Ratten</td><td>Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Wissenschaften</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus Calmette&ndash; Gu&eacute; gefriergetrocknetes Pulver</td><td>National Institutes for Food and Drug Control, China</td><td></td><td>zur Induktion von adjuvanter Arthritis bei Ratten</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>GenePharma (Shanghai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3-siRNA</td><td>RiboBio (Guangzhou, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin (10 kDa)</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E107079</tr><tr><td>Ammoniakwasser</td><td>Aladdin Chemisches Reagenz Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A112077</tr><tr><td>Ölsäure</td><td>Aladdin Chemisches Reagenz Co., Ltd.</td><td></td><td></td>O108484</tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Aladdin Chemisches Reagenz Co., Ltd.</td><td></td><td></td>D103272</tr><tr><td>FeSO4&bull; 7H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10012118</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&bull; 6H2O</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd</td><td>10011918</td><td></td></tr><tr><td>Dimercaptobernsteinsäure</td><td>Aladdin Chemisches Reagenz Co., Ltd.</td><td></td><td></td>D107254</tr><tr><td>Ultrafiltrationsröhrchen</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylammoniumhydroxidlösung</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>T100882</tr><tr><td>Partikelgrößen- und Zetapotenzial-Analysator</td><td>Malvern, England</td><td>Nano ZS90</td><td></td></tr></tbody></table>

polyethyleneimine beschichteten eisenoxid-nanopartikeln als vehikel für die lieferung von kleinen interferierende rna an makrophagen in vitro und in vivo

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Wegen ihre entscheidende Rolle bei der Regulation der Immunantwort Makrophagen kontinuierlich Gegenstand intensiver Forschung und stellen eine vielversprechende therapeutische Ziel bei vielen Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen, Arteriosklerose und Krebs. RNAi vermittelte Gen-silencing ist ein wertvoller Ansatz, Sonde und Makrophagen Funktion zu manipulieren; jedoch die Transfektion von Makrophagen mit SiRNA wird oft als technisch anspruchsvoll, und zur Zeit gibt es einige Methoden, die die SiRNA-Übertragung auf Makrophagen gewidmet. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit Polyethyleneimine beschichteten superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (PEI-Mondfotos) als Vehikel für die gezielte Bereitstellung von SiRNA zu Makrophagen. PEI-Mondfotos sind in der Lage, verbindliche und vollständig kondensiert SiRNA erreicht die Fe: SiRNA-Gewichts-Verhältnis 4 und vor. In-vitro-, diese Nanopartikel können effizient SiRNA liefern, in primären Makrophagen sowie in die Makrophagen-wie RAW 264,7 Zell-Linie, ohne kompromittierende Zellviabilität an die optimale Dosis für Transfection und, letztlich, sie induzieren SiRNA-vermittelten Ziel Gen-silencing. Neben für in-vitro- SiRNA Transfection verwendet, sind PEI-Mondfotos auch ein viel versprechendes Instrument für die Bereitstellung von SiRNA zu Makrophagen in Vivo. Angesichts seiner kombinierten Funktionen der magnetische Eigenschaft und Gen-silencing Fähigkeit dürften systemisch verabreichten PEI-SPION/SiRNA-Partikel nicht nur zu modulieren, Makrophagen-Funktion, sondern auch aktivieren Makrophagen abgebildet und nachverfolgt werden. PEI-Mondfotos repräsentieren im Wesentlichen eine einfache, sichere und wirksame nonviral Plattform für SiRNA Lieferung an Makrophagen in Vitro und in Vivo.

Die Größe und Zeta Potential der PEI-Mondfotos vorbereitet mit diesem Protokoll wurden im Bereich von 29-48 nm (Polydispersität Index: 0,12 - 0,23) und 30-48 mV, beziehungsweise. Sie waren seit über 12 Monaten ohne offensichtliche Aggregation im Wasser bei 4 ° C stabil. Um ihre SiRNA verbindliche Fähigkeit zu bewerten, wurden PEI-Mondfotos mit SiRNA bei verschiedenen Fe: SiRNA-Gewichts-Verhältnis gemischt. Abbildung 1 zeigt, dass erreicht die Fe: SiRNA-Gewich...

Wir beschreiben eine Methode der Verwendung von Polyethyleneimine (PEI)-superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln für transfecting Makrophagen mit SiRNA beschichtet. Diese Nanopartikel können effizient SiRNA zu Makrophagen in Vitro und in Vivo und Stille Ziel Genexpression liefern.

Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Diese Maßnahme kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten. Auf dem Gebiet der Humanologie. Diese Antwort in der Funktion von Makrophagen unter physiologischen Ende pathologischen Bedingungen.Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Polyethylenimin beschichtet effizient en vitro en vitro kann, ohne die Zelle zu beeinträchtigen. Unter optimalen Dosen. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie und Diagnose vieler chronisch entzündlicher Erkrankungen und Krebserkrankungen.Wo Makrophagen eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese spielen. Demonstrieren datilisch wird das Verfahren Na Jia sein. Ein Student aus meinem Labor.Und Kaixuan Wang, ein Doktorand aus Dr.Xiaohuas Labor. Zur Herstellung von Allylsäure modifiziertsuper paramagnetische Eisenoxid-Nanopartikel oder SPION es erste hinzufügen 28 Gramm Pharaschlorid Hexahydrat. Und 20 Gramm Pharas selbst heptahydrat zu einem Becher mit 80 Milliliter entionisiertem Wasser.Und verwenden Sie einen Glasschlauch, um Stickstoff in die Lösung einzuführen. Rühren, bis sich die feste Materie aufgelöst hat. Erhitzen Sie das Reaktionsgemisch auf 72 Grad Celsius unter Rühren bei 800 Umdrehungen pro Minute.Und fügen Sie 40 Milliliter 28%Ammoniakwasser in den Becher. Nach fünf Minuten fügen Sie neun Milliliter Allylsäure Tropfen klug. Und halten Sie die Mischung bei 72 Grad Celsius für drei Stunden mit kontinuierlichem Rühren.Am Ende der Inkubation die resultierende Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Und gefällt das Gemisch durch magnetische Trennung nach Standardprotokollen. Dann waschen Sie den SPION, der Ausscheidung enthält, dreimal mit absolutem Ethylalkohol.Und asperse den Niederschlag in 100 Milliliter n-Hexan. Zur Herstellung von Dimercapto Acrylsäure modifiziert eIAs fügen Sie 800 Milligramm der Allylsäure modifiziert eISIs. In 200 Milliliter n-Hexan und 400 Milligramm Dimercapto-Acrylsäure in 200 Milliliter Aceto in einem Drei-Hals-Kolben bei 60 Grad Celsius dispergiert.Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter Triethylamin tropfen weise in den Kolben mit Rühren bei 1000 Umdrehungen pro Minute und Refluxing. Ein schwarzer Niederschlag kann durch magnetische Trennung nach fünf Stunden erhalten werden. Verwenden Sie dann Tetramethylammoniumhydroxid, um den pH-Wert der Lösung für homogene Dispersionen der hydrophilen SPIONiAs in entionisiertem Wasser einzustellen.Degenerierte Polyethylen-beschichtete SPION es fügen die Dimercapto Acrylsäure modifiziert eIsSPIs kolloidale Lösung tropfen klug in eine 10 Kilodalton Polyethyleneimin Lösung. In einem 500 Milliliter Dreihalskolben unter mechanischem Rühren bei 1000 Umdrehungen pro Minute für zwei Stunden. Am Ende der Inkubation die resultierende Lösung zu einem Ultrafiltrationsrohr mit einem Molekulargewicht von 100 Kilodalton und einem Inhalt von 15 Millilitern hinzufügen.Zentrusen Sie die Probe, bis die verbleibende Lösung ein Volumen von einem Milliliter erreicht. Fügen Sie deionisiertes Wasser in die Lösung, um das Volumen wieder auf 15 Milliliter zu bringen. Und zentrrafuse und rehydrieren Sie die Lösung zehn Mal mehr, wie gerade gezeigt.Filtern Sie die Lösung dann durch einen 22-Mikron-Filter für die Lagerung bei vier Grad Celsius. Zur Herstellung der siRNA-Nanopartikel werden zunächst drei Mikroliter frisch zubereiteter 20 mikromolarer siRNA-Lösungen in fünf beschriftete, mikrozentrische Röhrchen der RNA hinzugefügt. Und fügen Sie 0, 8, 1,6, 3,2 und 6,4 Mikrogramm Polyethylen-IISIAs zu Denröhrchen mit der Bezeichnung Null, eins, zwei, vier und acht hinzu.Nach dem Mischen mit sanfter Pipettierung die Proben 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, damit sich die Polyethyleneimin-SPION siRNA-Komplexe bilden können. Und bereiten Sie ein drei Prozent Agarose Gel mit I Reinheit Agarose. Am Ende der Inkubation einen Mikroliter 6X DNA-Ladepuffer pro fünf Mikroliter Probe in jede Röhre geben und sorgfältig mischen.Dann alle Proben auf das Gel laden. Und laufen Elektrophorese bei fünf Volt pro Zentimeter. Bis der Bromphenolblaufarbstoff zwei Drittel der Länge auf das Gel wandert.Einen Tag vor der Transfektion waschen Sie eine Maus Mikrophage wie RAW264.7 Zellkultur mit PBS. Und behandeln Sie die Zellen mit einem Milliliter 25%Trypsin für fünf bis zehn Minuten bei 37 Grad Celsius in einem fünf Prozent Kohlendioxid-Inkubator. Wenn sich die meisten Zellen gelöst haben.Inaktivieren Sie das Trypsin mit fünf Millilitern kompletter DMEN. Dann pippete die Lösung mehrmals, um alle Zellcluster zu dispergieren. Übertragen Sie die Zellsuspension zur Zentrifugation in ein steriles 15-Milliliter-Conackelrohr.Dann setzen Sie die Zellen in fünf Milliliter n frischer kompletter DMEN zum Zählen wieder aus. Verdünnen Sie die Zellen auf 4,5 mal zehn bis vier Zellen pro Milliliter vollständiger DMEN-Konzentration. Und fügen Sie zwei Milliliter Medium zu jedem Brunnen einer sechs Brunnenplatte für eine 24-Stunden-Inkubation im Zellkultur-Inkubator hinzu.Am nächsten Tag bereiten Sie das entsprechende Verhältnis von Polyethylenimin SPION siRNA Nanopartikeln in einem 1,5 Milliliter RNA-Stream-Mikrozentrifugenrohr mit sanfter Mischung vor, wie gerade gezeigt. Und fügen Sie das entsprechende Volumen von Polyethylenimin SPION siRNA Nanopartikel-Komplex zu jedem Brunnen, die durch einen Milliliter frisches Medium ersetzt wurde. Bereiten Sie Polyethyleneimin SPION si Komplexe vor.in diesem Fall können noch viele weitere Monate Polyethylenimin SPION verwendet werden, wodurch ihre potenzielle Toxizität minimiert wird. Dann wirbeln Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Nanopartikel über die Brunnenböden zu erreichen. Geben Sie die Platte bis zur anschließenden zellulären Aktualisierung oder Gen-Knockdown-Mangelanalyse an den Zellkultur-Inkubator zurück.Polyethyleneimin-SPIONs mit einem Zeta-Potenzial von 30,5 und 37 Millivolt weisen bei Konzentrationen von bis zu 30 Mikrogramm Eisen pro Milliliter keine offensichtliche Zytotoxizität auf. Das ist etwa zweifach ermietend als die Konzentration, die normalerweise für die Zelltransfektion verwendet wird. Polyethylenimin EIAs Zeta-Potenzial von 48 Millivolt sind jedoch giftig.Auch bei der niedrigsten untersuchten Dosis. Wie durch Durchflusszytometrie analysiert, können mehr als 90% der Zellen mit fluoreszierend markierten Polyethyleneimin SPION siRNA-Komplexen mit 15 Mikrogramm Eisen pro Milliliter transfiziert werden. Die Beurteilung der Auswirkungen von Polyethylenimin SPION siRNA-Konzentrationen auf die zelluläre Internalisierung durch Zerkleinern von blauer Färbung zeigt eine minimal nachweisbare Färbung mit 7,5 Mikrogramm Eisen pro Milliliter.Aber deutlich sichtbare Flecken bei 15 Mikrogramm Eisen pro Milliliter, die bei höheren Eisenkonzentrationen wahrscheinlich aufgrund der Polyethyleneimin SPION siRNA Aufnahmesättigung nicht ansteigen. Peritoneale Makrophagen, die mit Polyethyleneimin EIUsIUsiAs spezieller siRNA transfiziert wurden, weisen im Vergleich zu unspezifischer siRNA eine signifikante Abnahme der Targe-mRNA-Spiegel auf. Der Vorschlag, dass siRNA aus endozytischen Vesikeln in das Zytoplasma entweichen kann, um die RNA-Interferenzmaschinerie zu erreichen.Weiter nach intravenöser Injektion einer Einzeldosis Polyethyleneimin SPION siRNA Nanopartikelkomplexe flozentrimetrische Analysen von CD11b-positiven und CD3-positiven Zellen zeigen eine effizientere Aufnahme der Nanopartikel durch CD11b, die Makrophagen exallert als durch CD3-positive Zellen zu einem beliebigen Zeitpunkt in allen untersuchten Organen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Polyethyleneimin-SPIONs mit einem durchschnittlichen Datenpotenzial von nicht mehr als 37 Millivolt vorzubereiten und die Polyethyleneimin-SPION siRNA-Komplexe auf die niedrigen Eisen-SiRNA-Verhältnisse vorzubereiten. Diese Technik vergleicht die Notwendigkeit für Forscher, das therapeutische Potenzial der Ausrichtung auf Makrophagen in Tiermotoren menschlicher Krankheiten wie und Krebs zu erforschen.

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Medicine

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Wiederholte retroorbitalen Injektionen kationische liposomes/siRNA/ITSN-1s Komplexe in Mäusen, alle 72 Stunden für 24 Tage, effizient die siRNA-Duplex zum Mauslunge Mikrovaskulatur Reduzierung ITSN-1s mRNA und Protein-Expression von 75%. Diese Technik ist in hohem Maße reproduzierbar in einem Tiermodell, hat keine Nebenwirkungen und Todesfälle verhindert.

Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy

In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur effizienten Transfektion von murinen Makrophagen-Zelllinien mit siRNAs unter Verwendung des Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systems, zur Stimulation der Makrophagen mit Lipopolysaccharid und zur Überwachung der Auswirkungen auf die Produktion von entzündlichen Zytokinen.

Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Lieferung bleibt die größte Herausforderung für die therapeutische Anwendung der small interfering RNA (siRNA). Dieses Protokoll schließt die Verwendung eines multifunktionellen und biokompatibel siRNA Abgabeplattform, bestehend aus Arginin und Polyethylenimin gepfropft porösen Siliciummikropartikel.

Poröses Silizium Mikropartikel für die Lieferung von siRNA-Therapeutika

Dieses Manuskript beschreibt die effiziente, nicht-virale Abgabe von miR-Zellen durch einen PEI / MNP-Vektor und ihre Magnetisierung an Endothelzellen. Somit kann zusätzlich zu genetischer Veränderung, ermöglicht dieser Ansatz für die magnetische Zellführung und MRI Nachweisbarkeit. Die Technik kann verwendet werden, um die Eigenschaften von therapeutischen Zellprodukten zu verbessern.

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

Diese Handschrift zeigt die Erschöpfung der Gen-Expression in den Mitteldarm der deutschen Schabe durch orale Einnahme von doppelsträngige RNA in Liposomen verkapselt.

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Dieses Protokoll zeigt ein sicheres und effizientes Verfahren zur CD133 ändern+ Hämatopoetischen Stammzellen. Der vorgestellte nicht-viralen, magnetische Polyplex basierenden Ansatz kann eine Grundlage für die Optimierung der therapeutischen Stammzellen Effekte sowie für die Überwachung der verabreichten Zelle Produkt per Magnet-Resonanz-Tomographie bilden.

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Gewebe-spezifische MicroRNA-Hemmung ist eine Technologie, die im Feld MicroRNA unterentwickelt ist. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um erfolgreich die MiR-181 MicroRNA-Familie in Myoblast Zellen aus dem Herzen zu hemmen. Nanovector-Technologie wird verwendet, um eine MicroRNA Schwamm zu liefern, die erhebliche in Vivo Cardio-spezifische MiR-181 Familie Hemmung zeigt.

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Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Generation der kationischen Nanoliposomes, basiert auf der Methode der trocken-Film und eignet sich für die sichere und effiziente Bereitstellung von in-vitro- Boten-RNA transkribiert.

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In dieser Arbeit bringen wir exogene künstlich synthetisierte miRNA-Nachahmungen in die Niere durch Schwanzveneninjektion eines nicht-viralen Vektors und Polyethylenimin-Nanopartikel in verschiedenen Mausmodellen für Nierenerkrankungen. Dies führte zu einer signifikanten Überexpression der Ziel-miRNA in der Niere, was in mehreren Mausmodellen zu einer Hemmung des Fortschreitens der Nierenerkrankung führte.

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Hier beschreiben wir das Protokoll für die in vivo Verabreichung von magnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln, die RNA-Oligomere tragen, an metastasierenden Brustkrebs in Tiermodellen und bieten damit einen klinisch praktikablen Ansatz für das therapeutische Silencing von onkogenen Nukleinsäuren.

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Die Blut-Hirn-Schranke ist eine große Hürde bei der Bereitstellung von Therapien für das Glioblastom, eine Krankheit, für die es keine Heilung gibt. Hier berichten wir über eine in vivo bildgesteuerte therapeutische Nanoplattform für Eisenoxid, die diese physiologische Barriere aufgrund ihrer Größe umgehen und sich im Tumor anreichern kann.

Nanopartikel-Verabreichung einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell

Erfahren Sie die Transfektion von Makrophagen mit PEI-beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln zur siRNA-Lieferung in vitro und in vivo. Diese effiziente Methode ermöglicht gezieltes Gene Silencing für therapeutische Anwendungen.

Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo (Video) | JoVE Journal

Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo

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