Name: Nerv-Stammzell-Differenzierung durch ein einstufiges kalt atmosphärischem Plasma Behandlung In-vitro- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Erfahren Sie die Differenzierung von Nerv-Stammzellen durch kalt atmosphärisches Plasma in vitro. Diese Methode ermöglicht sichere gerichtete Differenzierung für die Behandlung neurologischer Erkrankungen wie Parkinson.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von der Huazhong Scholar Program, dem unabhängigen Innovationsfonds der Huazhong University of Science und Technology (Nr. 2018KFYYXJJ071) und die National Natural Science Foundation of China (Nr. 31501099 und 51707012) unterstützt.

(1) Zell-Kulturen und Predifferentiation
<ol><li>
Neuronalen Stammzelle-Kultur und predifferentiation
	<ol>
<li>Poly-D-Lysin-beschichtete Deckgläsern vorzubereiten. Legen Sie eine sterile Deckglas (20 mm Durchmesser) in ein 12-Well-Platte. Bestreichen Sie das Deckglas mit Poly-D-Lysin, 0,1 % w/V, im Wasser (Table of Materials) für bessere Zelladhäsion auf den Deckgläsern indem Sie die nächsten Schritte. Hinweis: Optimale Bedingungen müssen für jede Zelllinie und Anwendung festgelegt werden.<ol>
<li>Aseptisch Beschichten der Oberfläche des Deckglases mit Poly-D-Lysin, 0,1 % w/V, im Wasser. Rock sanft um eine gleichmäßige Beschichtung der Oberfläche Deckglas zu gewährleisten.</li>
			<li>Nach der Kultivierung Übernachtung (12 h) bei 37 ° C, die Poly-D-Lysin-Lösung entfernen und spülen Sie die Oberfläche 3 X mit 1 mL sterilem Wasser.</li>
			<li>Trocknen Sie die Zellen mindestens 30 min vor der Aussaat sie.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Murine neurale Stammzellen C17.2 (C17.2-NSC) Kultur und predifferentiation
	<ol>
<li>Inkubieren Sie C17.2-NSCs in einem 25 cm2 Kolben in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 5 % Pferd Serum (HS) und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 ° C und 5 % CO2 für ~ 2-3 d.</li>
		<li>Wenn die Zellen Zusammenfluss von 85 % erreicht haben, entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit 1 mL PBS und fügen Sie 1 mL frisch Trypsin (0,25 %) in den Kolben. Lassen Sie es für 1 min; Fügen Sie 1 mL Kulturmedium zu Kolben und Pipette nach oben und unten mehrmals, um eine einzelne Zelle Aussetzung zu gewährleisten.</li>
		<li>Zählen Sie die Dichte der Zellen in der Suspension mit einer Hemocytometer. Berechnen Sie die erforderliche Menge Zellsuspension, eine endgültige Zellkonzentration von 2 x 104 Zellen/mL zu geben.</li>
		<li>Samen C17.2-NSCs auf der beschichteten Deckgläsern in der 12-Well-Platte mit der Dichte von ~ 2 x 104 -Zellen pro Bohrloch. Überprüfen Sie die Zelldichte unter dem Mikroskop. Hinweis: Ein besseres Ergebnis zu erzielen, muss die optimale Zelldichte vor dem Immunfluoreszenz-Test ermittelt werden.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einer Zelle Inkubator für 12 h zur Befestigung zu ermöglichen.</li>
		<li>Nach der Befestigung, waschen Sie die Zellen 2 X mit 1 mL PBS und pflegen die Zellen mit Differenzierung Medium bestehend aus DMEM/F12 mit Zuschlag von 1 % N2 für 48 h vor der Plasmabehandlung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Primäre Ratte neuronalen Stammzelle-Kultur und predifferentiation
	<ol>
<li>Kultur die primäre Ratte NSC-Suspension in Ratte NSC Wachstumsmedium in unbeschichteten T25 Fläschchen bei einer Dichte von 5 x 105 Zellen. Hinweis: Die primäre Ratte NSCs wurden isoliert nach dem Protokoll von Xie Et al. 9.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Bildung von Neurospheres unter einem inversen Mikroskop. Sicherstellen Sie, dass die Morphologie der Neurosphären sphärischen und transparente mehrzelligen komplexe Exponate.</li>
		<li>Bei die Neurosphären einen Durchmesser von 3 mm oder größer erreichen, die Neurosphäre Aussetzung einer sterilen Zentrifugenröhrchen 15 mL und lasse Sie begleichen die Neurosphären durch die Schwerkraft.</li>
		<li>Entfernen des Überstands vorsichtig um den Neurosphären in einem minimalen Volumen des Mediums zu verlassen.</li>
		<li>Spülen Sie die Neurosphären 1 X mit 5 mL PBS und lassen die Neurosphären durch die Schwerkraft zu begleichen. Entfernen Sie den Überstand um eine minimale Menge an PBS zu verlassen.</li>
		<li>Fügen Sie eine angemessene Lautstärke von Mittel-und Differenzierung der Zelldichte, ~ 12-15 Neurosphären pro Milliliter einstellen. Die Differenzierung Medium für primäre Ratte NSCs besteht aus DMEM/F12, 2 % B27 und 1 % FBS.</li>
		<li>Samen 1 mL Neurosphäre Suspension auf jeder beschichteten Deckglas in der 12-Well-Platte. Hinweis: Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Neurosphären gleichmäßig verteilt sind. Dieser Schritt ist entscheidend für ein besseres Ergebnis der Immunfluoreszenz.</li>
		<li>Die Platte in den Brutkasten und lassen Sie ihn 24 Stunden vor der Plasmabehandlung predifferentiate.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung des Plasma-Jets
<ol><li>Wählen Sie eine halboffene Quarzrohr mit einem Innendurchmesser von 2 mm und einem Außendurchmesser von 4 mm. Legen Sie einen Hochspannungs-Draht mit einem Durchmesser von 2 mm in das Rohr.</li>
	<li>Einfügen Sie Quarzrohr mit dem Hochspannungs-Draht in eine 5 mL Spritze und verwenden Sie eine Halterung, um in der Mitte der Spritze zu montieren. Legen Sie den Abstand zwischen versiegelten Ende der Quarzrohr und der Spritze Spitze 1 cm.</li>
	<li>Schließen Sie ein 1 m Silikon Kautschuk Rohr (mit einem Innendurchmesser von 12 mm) zum offenen Ende der Spritze und dann verbinden Sie es mit dem Durchflussmesser und Gasventil nacheinander.</li>
</ol>3. Übernahme der Jets
<ol><li>Verbinden Sie die Schaltung, wie in Abbildung 1dargestellt. Verbinden Sie das Ausgabe-Kabel des Netzteils mit dem Plasmastrahl Gerät, und verbinden Sie dann die Spitze der Hochspannungs-Sonde mit dem Ausgabe-Draht um die Spannung zu erkennen. Verbinden Sie das andere Ende der Hochspannungs-Sonde auf dem Oszilloskop zum Aufzeichnen der Informationen der Ausgangsspannung. Überprüfen Sie die gesamte Schaltung und stellen Sie sicher, dass das Netzteil, das Oszilloskop und die Hochspannungs-Sonde alle geerdet sind.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Gasleitung. Stellen Sie sicher, den Gasschlauch an den Plasmastrahl Gerät angeschlossen wurde; dann öffnen Sie das Gasventil der Helium (Volumenanteil, 99,999 %) und Sauerstoff (Volumenanteil, 99,999 %) und den Gasstrom auf 1 L:0.01 L/min (He: O2) festgelegt. Hinweis: Lassen Sie den Gasstrom für einige Minuten vor dem Einschalten der Stromversorgung zum ersten Mal.</li>
	<li>Legen Sie den Puls Amplitude, Frequenz und Impulsbreite als 8 kV, 8 kHz und 1600 ns, beziehungsweise. Überprüfen Sie die Schaltung wieder und schalten Sie dann die Schaltfläche "Ausgabe", um ein Plasmastrahl zu erstellen. Vorsicht: Berühren Sie nicht die Hochspannungs-Leitung zu jeder Zeit.</li>
</ol>4. die Plasmabehandlung von neuronalen Stammzellen
<ol><li>Legen Sie den Abstand zwischen der Düse der Spritze und die Zelle gut Loch bis 15 mm. Hinweis: Der Abstand wird von der Unterseite der Plattform gemessen wo 12-Well-Platte platziert wird.</li>
	<li>12-Well-Platte aus dem Inkubator nehmen und das Medium der predifferentiated Zellen zu 800 µL frische Differenzierung Medium verändern.</li>
	<li>Die Zellen in drei Gruppen unterteilen: einer unbehandelten Kontrollgruppe, eine 60 s He und O2 (1 %) Gas Flow Behandlungsgruppe und 60 s Plasma Behandlungsgruppe. Hinweis: Es gibt keine offensichtliche Flüssigkeitsverlust unter der Voraussetzung der Behandlung.</li>
	<li>Platzieren Sie 12-Well-Platte unter den Plasma-Jets zu, stellen Sie sicher, dass die Spritze Düse in der Mitte jedes Loch fixiert ist und geben Sie die entsprechenden Behandlung auf den verschiedenen Gruppen in Schritt 4.3 genannten. Hinweis: Die unbehandelten Kontrollen wurden während der Versuchsdurchführung, einheitliche Behandlung zu gewährleisten in Differenzierung Medium bei Raumtemperatur aufbewahrt. He und O2 (1 %) Gas Flow Behandlungsgruppe wurde mit nur einem er behandelt und O2 (1 %) Gasstrom ohne Plasmaerzeugung. Alle Behandlungen sollten in dreifacher Ausführung durchgeführt werden.</li>
</ol>(5) neuronaler Stammzell-Differenzierung
<ol><li>Entfernen Sie nach der Behandlung die ursprüngliche Kultur und 1 mL neue Differenzierung Medium in jede Vertiefung.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für 6 d. das Medium verändern jeden zweiten Tag.</li>
	<li>Überprüfen Sie den Status der Differenzierung der verschiedenen Gruppen täglich unter einem Lichtmikroskop invertierten Phasenkontrast. Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie mindestens 12 Felder aus und fotografieren Sie die morphologischen Veränderungen aufzeichnen.</li>
</ol>6. Immunfluoreszenz-Färbung
<ol><li>
Spülen
	<ol>
<li>Die Proben aus dem Inkubator Zelle herausnehmen Sie und das Medium durch Absaugen. Spülen Sie die Zellen 1 X mit 1 mL PBS. Hinweis: Nach der Differenzierung sind die Zellen leicht abgenommen. Es ist notwendig, die PBS von der Seite der Kultur Brunnen zu vermeiden, waschen Sie die Zellen hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fixierung
	<ol>
<li>Befestigen Sie die Zellen mit 500 µL 4 % Paraformaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur. Nach der Fixierung sanft spülen die Zellen 3 X mit 1 mL PBS, jeweils 5 min, die restlichen 4 % Paraformaldehyd zu entfernen. Hinweis: Der optimale Zeitpunkt für die Zelle Fixierung muss nach der Zelltypen ermittelt werden. Nach der Fixierung 1 mL PBS von der Seite der Kultur Brunnen und lassen Sie die Probe für 5 min auf dem Tisch. Verwenden Sie einen Labor-Shaker, nicht um zu einen minimalen Verlust von Zellen zu gewährleisten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Permeabilisierung
	<ol>
<li>Die Proben mit 0,2 % permeabilize TritonX-100 mit PBS-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur. Spülen Sie nach Permeabilisierung die Zellen sanft mit 1 mL PBS für drei Mal 5 min. Hinweis: Der optimale Zeitpunkt für die Zelle Permeabilisierung muss laut Zelltypen ermittelt werden. Nach Permeabilisierung fügen Sie 1 mL PBS von der Seite der Kultur Brunnen, verlassen Sie die Probe für 5 min auf dem Tisch. Verwenden Sie einen Labor-Shaker nicht um den minimalen Verlust von Zellen zu gewährleisten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Blockieren
	<ol>
<li>Jede Probe 1 mL 10 % Ziegenserum in PBS hinzu und lassen Sie die Probe auf den Tisch für 1 h, unspezifischen Wechselwirkungen zu blockieren. Hinweis: Verwenden Sie keinen Lab-Shaker, um zu verhindern, dass die Zellen von der Folie lösen. Eine Spülung ist nicht notwendig in diesem Schritt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inkubation mit primären Antikörper
	<ol>
<li>Verdünnen Sie den primären Antikörper mit Primärantikörper Verdünnungspuffer. Hinweis: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, muss die endgültige Verdünnungsverhältnis des primären Antikörpers durch Pretest ermittelt werden. Die Verdünnungsverhältnissen von Anti-Nestin (für undifferenzierte Stammzellen), Anti-β-Tubulin III (Neuron), Anti-O4 (für Oligodendrozyt), Anti-NF200 (für Reifen Neuronen), Anti-ChAT (für cholinerge Neuronen), Anti-LHX3 (für Motoneuronen), Anti-GABA (für GABAergen Neuronen), Anti-Serotonin (für serotonerge Neuronen) und Anti-TH (für dopaminergen Neuronen) sind 1: 80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200 und 1: 100,.</li>
		<li>Gelten Sie 300 µL verdünnter Primärantikörper für verschiedene Proben.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellproben über Nacht bei 4 ° c Hinweis: Es wird empfohlen, primären Antikörper bei 4 ° C zur Verringerung der Hintergrund und unspezifische Färbung auszubrüten.</li>
		<li>Entfernen Sie die primären Antikörper und sanft spülen die Zellen 3 X mit 1 mL PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inkubation mit Sekundärantikörper
	<ol>
<li>Verdünnen Sie die Cy3 konjugiert oder Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörper mit 3 % Ziegenserum in PBS. Hinweis: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, muss die endgültige Verdünnungsverhältnis des sekundären Antikörpers durch Pretest ermittelt werden.</li>
		<li>Gelten Sie 300 µL der relevanten Sekundärantikörper, jedem Primärantikörper zu erkennen. Hinweis: Die nachfolgenden Schritte müssen durchgeführt werden, in der Dunkelheit Fluoreszenzlöschung zu verhindern.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellprobe im Dunkeln für 2 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie die sekundäre Antikörper zu und spülen Sie die Zellen sanft mit 1 mL PBS für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nukleare Färbung
	<ol>
<li>Gelten Sie 500 µL Arbeitslösung Hoechst 33258 die Zellprobe einzutauchen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellprobe im Dunkeln für 8 min bei Raumtemperatur, die Kerne zu kennzeichnen.</li>
		<li>Spülen Sie sanft die Zellen 3 X mit 1 mL PBS, jeweils 10 min. vor Licht geschützt. Hinweis: Für einen minimalen Verlust von Zellen, die optimale waschen Bedingung muss empirisch ermittelt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage
	<ol>
<li>Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium in der Mitte der Objektträger.</li>
		<li>Aus den Deckgläsern (mit Beispielen) mit einer Pinzette nehmen Sie und positionieren Sie sorgfältig die Probe auf das Eindeckmittel. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Entfernen Sie alle überschüssigen Eindeckmittel mit saugfähigem Papier.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fluoreszenz-Mikroskopie-Beobachtung
	<ol>
<li>Beobachten Sie die Proben unter die Fluoreszenz-Mikroskopie für Hoechst 33258, Alexa Fluor 488 und Cy3 mit Filtern ausgestattet. Für jede Probe nach dem Zufallsprinzip wählen Sie mindestens 8 bis 12 Felder und Aufnahmen mit einer Kamera aus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).</li>
<li>Rossi, F., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+therapy+for+neurological+diseases%3A+dreams+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).</li>
<li>Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+redox+biology+and+some+implications+for+plasma+applications+to+medicine+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001(2012).</li>
<li>Weltmann, K. D., von Woedtke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+medicine-current+state+of+research+and+medical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Physics+and+Controlled+Fusion%22%5BJournal%5D)">Plasma medicine-current state of research and medical application.</a> Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031(2017).</li>
<li>Lloyd, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+Plasma%3A+Medical+Uses+and+Developments+in+Wound+Care%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Processes+and+Polymers%22%5BJournal%5D)">Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care.</a> Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).</li>
<li>Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+plasmas+at+atmospheric+pressure%3A+toward+new+pharmaceutical+treatments+in+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).</li>
<li>Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Treatment+of+Onychomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Processes+and+Polymers%22%5BJournal%5D)">Plasma Treatment of Onychomycosis.</a> Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).</li>
<li>Xiong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+neuronal+differentiation+of+neural+stem+cells+induced+by+nanosecond+microplasma+agitation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).</li>
<li>Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture+and+Identification+of+Neural+Stem+Cells+in+New-born+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Huazhong+University+of+Science+and+Technology.+%5BMed+Sci%5D%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats.</a> Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).</li>
<li>Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+multipotent+neural+cell+lines+using+retrovirus+vector-mediated+oncogene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer.</a> Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).</li>
<li>Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+engraftment+corrects+lysosomal+storage+throughout+the+MRS+VII+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain.</a> Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).</li>
<li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Fixatives+for+Immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Fixatives for Immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Cell Membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

C17.2-NSCs ist eine Art verewigt neurale Stammzellen Linie von Neugeborenen Mauszellen zerebelläre Körnerschicht, entwickelt von Snyder u.a.10,11. C17.2-NSCs können in Neuronen und Astrozyten, Oligodendrozyten und sind weit verbreitet in Neurowissenschaften12. In unseren früheren Studie konnte CAPs die Differenzierung des C17.2-NSCs in Neuronen verbessern. Eine Proof of Principle Studie wurde auch durchgeführt mit primären Ratte NSCs, und ...

Die gezielte Differenzierung von NSCs in einer bestimmten Linie für den Transport der Gewebe gilt als einer der vielversprechendsten Therapien für Neurodegenerative und Neurotraumatic Krankheiten1. Zum Beispiel sind Catecholaminergic dopaminergen Neuronen vor allem in der Behandlung der Parkinson-Krankheit (PD) erwünscht. Traditionelle Methoden, um die gewünschten Zellen für den Transport vorzubereiten haben jedoch viele Nachteile, wie chemische Toxizität, Narbenbildung oder andere, die vor allem die Anwendungen der NSCs in regenerative Medizin2behindert. Daher ist es sehr notwendig, um eine neue und sichere Methode für NSC Differenzierung zu finden.
Plasma ist der vierte Zustand der Angelegenheiten, folgende Feststoff, Flüssigkeit und Gas und stellt mehr als 95 % der Fragen im ganzen Universum. Plasma ist elektrisch neutral mit ungebundenen positiven/negativen und neutralen Teilchen und wird in der Regel durch eine Hochspannungs-Entladung im Labor erzeugt. In den letzten zwei Jahrzehnten hat die Anwendung von Plasma in der Biomedizin als die Entwicklung der kalten Atmosphärendruck-Plasma-Technologie weltweit große Aufmerksamkeit erregt. Dank dieser Technik stabiles Niedrigtemperatur-Plasma in der umgebenden Luft in der Atmosphäre ohne Bogen Bildung erzeugt werden kann und besteht aus verschiedenen reaktiven Spezies, wie reaktive Stickstoff-Spezies (RNS), reaktive Sauerstoffspezies (ROS), Ultraviolett (UV) Strahlung, Elektronen, Ionen und elektrisches Feld3. Kappen haben einzigartige Vorteile für Mikroorganismen-Inaktivierung, Krebstherapie, Wundheilung, Behandlung von Hautkrankheiten, Zellproliferation und Zelle Differenzierung4,5,6,7. In früheren Arbeiten haben wir bewiesen, dass kalte atmosphärischem Plasma Jet die Differenzierung der NSCs in murinen neurale Stammzellen C17.2 (C17.2-NSCs) und primäre Ratte neuronalen Stammzellen verbessern kann Aussteller ein großes Potenzial zu einem mächtigen Werkzeug für die Regie Differenzierung von NSCs8. Obwohl der Mechanismus der CAP-Verbesserung der NSC Differenzierung noch nicht vollständig verstanden ist durch Kappen können keine erwies sich ein entscheidender Faktor in diesem Prozess sein. In dieser Arbeit wollen wir ein detailliertes experimentelle Protokoll mit einem Helium/Sauerstoff Atmosphärendruckplasma Jet für die Behandlung von NSCs in Vitro, Handy Vorbereitung und Vorbehandlung, Morphologie Beobachtung von inversen Mikroskop und Fluoreszenz-Mikroskopie Beobachtung der Immunfluoreszenz-Färbung.

<table><tbody><tr><td>Deckglas</td><td>NEST</td><td>801008</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01B</td><td>gelagert bei 4 > C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 Medium</td><td>HyClone</td><td>SH30023,01B</td><td>gelagert bei 4 > C</td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>bei -20 &deg gelagert; C und Schutz vor Licht</td></tr><tr><td>B27 Ergänzung</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>bei -20 & Grad gelagert; C und vor Licht schützen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td> gelagert <td>bei -20 &de; C, vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen</td></tr><tr><td>Spender-Pferdeserum</td><td>HyClone</td><td>SH30074,03</td><td>bei -20 & Grad; C, vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>bei 4 μg gelagert; C</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>HyClone</td><td>25300054</td><td>bei 4 μg gelagert; C</td></tr><tr><td>PBS-Lösung</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>gelagert bei 4 > C</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>gelagert bei -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum Blockierungslösung</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000-20</td><td>gelagert bei 4 &Grad; C</td></tr><tr><td>Anti-Nestin</td><td>Beyotime</td><td>AF2215</td><td>gelagert bei -20°; C, vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen</td></tr><tr><td>Anti-&Beta;-Tubulin III</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td><td>bei -20 &° gelagert; C, vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen</td></tr><tr><td>Anti-O4</td><td>R & D Systems</td><td>MAB1326</td><td>bei -20 Grad gelagert; C, vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen</td></tr><tr><td>Anti-NF200</td><td>Sigma</td><td></td>, <td>das bei -20 & Grad gelagert wird; C, vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen</td></tr><tr><td>von Anti-ChAT</td><td>Sigma</td><td></td>, <td>das bei -20 & Grad gelagert wird; C, vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen</td></tr><tr><td>von Anti-LHX3</td><td>Sigma</td><td></td>, <td>gelagert bei -20 & Grad; C, vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen</td></tr><tr><td>Anti-GABA</td><td>Sigma</td><td></td><td>bei -20 & Grad; C, wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden</td></tr><tr><td>Anti-Serotonin</td><td>Abcam, Cambridge, MA</td><td></td><td>gelagert bei -20 & Grad; C, wiederholtes Einfrieren und Auftauen</td></tr><tr><td>vermeiden Anti-TH</td><td>Abcam, Cambridge, MA</td><td></td><td>gelagert bei -20 & Grad; C, vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen</td></tr><tr><td>Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>gelagert bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>gelagert bei -20 &deg; C und vor Licht schützen</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488- Etikettierte Ziege</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>gelagert bei -20 & Grad; C und vor Licht schützen</td></tr><tr><td>Anti-Maus IgG&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Plattenkorn</td><td></td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2</td><td>Kolbenkorn 430639</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Beyotime</td><td>C1018</td><td>gelagert bei -20 > C und vor Licht schützen</td></tr><tr><td>Eindeckmedium</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td>gelagert bei -20 &Grad; C und vor Licht schützen</td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Nanjing Jiangnan Novel Optics Company</td><td>XD-202</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskopie</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Hohe Spannung Leistungsverstärker</td><td>Gerichtete Energie</td><td>PVX-4110</td><td></td></tr><tr><td>Gleichstromversorgung</td><td>Spellman</td><td>SL1200</td><td></td></tr><tr><td>Funktionsgenerator</td><td>Aligent&nbsp;</td><td>33521A</td><td></td></tr><tr><td>Oszilloskop</td><td>Tektronix</td><td>DPO3034</td><td></td></tr><tr><td>Hochspannungs-Tastkopf</td><td>Tektronix</td><td>P6015A</td><td></td></tr></tbody></table>

nerv-stammzell-differenzierung durch ein einstufiges kalt atmosphärischem plasma behandlung in-vitro-

Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro

Da die Entwicklung der physischen Plasmatechnologie, kalte atmosphärische Plasmen (CAPs) in Dekontamination, Krebsbehandlung, Wundheilung, Wurzelbehandlung, etc.weit untersucht wurden, bilden ein neues Forschungsgebiet benannt Plasmamedizin. Als eine Mischung aus elektrischen, chemischen und biologischen reaktiven Spezies, Kappen haben gezeigt, ihre Fähigkeiten, Nerv Stammzellen Differenzierung zu verbessern sowohl in Vitro und in Vivo und sind immer ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung von neurologischen Krankheiten in der Zukunft. Die viel spannende Nachricht ist, dass CAPs einstufige erkennen können und sicher geleitet, Differenzierung von neuronalen Stammzellen (NSCs) für den Transport der Gewebe. Wir zeigen hier die detaillierte experimentelle Protokoll mit einem selbstgebauten CAP Jet-Gerät um zu NSC Differenzierung in C17.2-NSCs und primäre Ratte neuronalen Stammzellen zu verbessern sowie Beobachtung durch das Schicksal der Zelle invertiert und Fluoreszenz-Mikroskopie. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-Färbung Technologie wir fanden beide die NSCs Differential beschleunigt als die unbehandelte Gruppe zeigte, und ~ 75 % von den NSCs differenziert selektiv in Neuronen, die vor allem ältere, cholinerge und motor Neuronen.

Zellmorphologie wurde unter den inversen Mikroskop jeden Tag nach der GAP-Behandlung beobachtet. Abbildung 2 zeigt die gewöhnliche invertierten Phasenkontrast-Lichtmikroskop Bilder von der Zelldifferenzierung in beiden Zelllinien. Die Plasma-behandelten Gruppe weist auf eine beschleunigte Differenzierung-Rate und eine hohe Differenzierung-Verhältnis im Vergleich zu der Kontrolle und Gas Flow-Gruppe.
<p class="jove_content" fo:keep-togeth...

Dieses Protokoll soll detaillierte experimentelle Schritte von einer kalten atmosphärischen Plasmabehandlung auf neurale Stammzellen und Immunfluoreszenz-Erkennung für Differenzierung Verbesserung zu geben.

Nerv-Stammzell-Differenzierung durch ein einstufiges kalt atmosphärischem Plasma Behandlung In-vitro-

As the development of physical plasma technology, cold atmospheric plasmas (CAPs) have been widely investigated in decontamination, cancer treatment, ...

Diese Methode hat das Potenzial, die Differenzierung von neuronalen Stammzellen in vitro zu verbessern und zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen wie Parkinson beizutragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die kalten atmosphärischen Plasmae in einem Schritt zur sicheren gerichteten Differenzierung neuronaler Stammzellen für die Gewebetransplantation eingesetzt werden können. Kaltes atmosphärisches Plasma kann die Differenzierung neuronaler Stammzellen innerhalb kurzer Behandlungszeit verbessern.Und mit der Notwendigkeit mehr Schäden an den Zellen, die die gewünschten Zellen für die Transplantation zur Verfügung stellen. Beginnen Sie mit der Aussaat etwa fünf mal zehn bis fünf murine neuronalen Stammzellen in einem 25 Zentimeter großen quadratischen Kolben. Enthält fünf Milliliter komplettedmEM für zwei bis drei Tage bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid.Wenn die Zellen 85 Prozent Koninfluenza erreichen, waschen Sie die Kultur mit einem Milliliter PBS. Vor der Behandlung, mit einem Milliliter von 25 Prozent Trypsin für eine Minute. Wenn sich die Zellen gelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit einem Milliliter Kulturmedium.Und Pipette mehrmals, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Nach dem Zählen verdünnen Sie die Zellen auf zwei mal zehn bis vier Zellen pro Milliliter Konzentration. Samen Eines Milliliter Stoles von Stammzellen auf einem poly-D-Lysin beschichteten Decksrutsch pro Brunnen in neun Brunnen einer 12-Zell-Kulturplatte.Überprüfen Sie die Zelldichte unter dem Mikroskop. Und geben Sie die Zellen für 12 Stunden in den Inkubator zurück. Wenn die Zellen befestigt sind, waschen Sie die Abdeckung saust zweimal mit einem Milliliter PBS pro Wäsche, und behandeln Sie die Zellen mit Differenzierungsmedium für 48 Stunden.Schließen Sie für die Strahlaufnahme zunächst den Ausgangsdraht des Netzteils an das Plasmastrahlgerät an. Und die Spitze der Hochspannungssonde mit dem Ausgangsdraht, um die Spannung zu erkennen. Schließen Sie dann das andere Ende der Hochspannungssonde an das Oszilloskop an, um die Informationen von der Ausgangsspannung aufzuzeichnen.Überprüfen Sie die gesamte Schaltung, um sicherzustellen, dass das Netzteil, das Oszilloskop und die Hochspannungssonde alle geerdet sind. Überprüfen Sie die Gasleitung, um sicherzustellen, dass die Gasröhre mit dem Plasmastrahlgerät verbunden ist. Öffnen Sie anschließend die Helium- und Sauerstoffgasventile und stellen Sie den Gasstrom auf einen Liter auf 01 Liter pro Minute, das Verhältnis von Helium zu Sauerstoff.Überprüfen Sie die Schaltung erneut und drücken Sie die Ausgangstaste, um einen Plasmastrahl zu erstellen. Um die neuronalen Stammzellen zu behandeln, legen Sie den Abstand zwischen der Spritzendüse und dem ersten Bohrkörper der Zellen auf 15 Millimeter fest. Ersetzen Sie die Überstande in den neuronalen Stammzellkulturen durch 800 Mikroliter frisches Differenzierungsmedium.Und legen Sie die Platte unter die Plasmadüsen. Stellen Sie sicher, dass die Spritzendüse über der Mitte jedes Brunnens befestigt ist. Erstellen Sie drei Brunnen mit Plasma für 60 Sekunden pro Behandlung und drei Brunnen mit einem Prozent Helium und Sauerstoffgas für 60 Sekunden pro Behandlung.Lassen Sie drei Brunnen unbehandelt, als Kontrollen. Dann ersetzen Sie die Überräube durch einen Milliliter frisches Differenzierungsmedium. Und geben Sie die Zellen für sechs Tage in den Inkubator zurück.Überprüfen Sie den Differenzierungsstatus der verschiedenen Gruppen täglich unter einem invertierten Phasenkontrastlichtmikroskop. Nach der Behandlung lassen Sie die Zellen im Zustandsmedium für etwa eine Stunde vollständig ausausgleichen, bevor sie den Überstand durch ein frisches Differenzierungsmedium ersetzen. Für die Immunfluoreszenzanalyse fixieren Sie die Kulturen mit 500 Mikrolitern von vier Prozent Paraformaldehyd pro Brunnen für 20 Minuten bei Raumtemperatur.Gefolgt von drei sanften fünfminütigen Spülungen mit einem Milliliter PBS pro Wäsche. Als nächstes permeabilisieren Sie die festen Proben mit 2 Prozent Triton X-100 in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Gefolgt von sanftem Spülen, wie gezeigt.Nach der letzten Wäsche jede unspezifische Bindung mit einem Milliliter 10 Prozent Ziegenserum in PBS pro Probe für eine Stunde bei Raumtemperatur blockieren. Am Ende der Inkubation die Zellen in jedem Brunnen mit 300 Mikrolitern des primären Interessierenden über Nacht bei vier Grad Celsius beschriften. Gefolgt von drei Wähungen in PBS, wie gezeigt.Nach der letzten Wäsche die Zellen mit 300 Mikrolitern der entsprechenden Sekundärantikörper beschriften. Zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, vor Licht geschützt. Dann spülen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Milliliter PBS pro Brunnen für zehn Minuten bei Raumtemperatur.Bildnis die Zellen auf einem Fluoreszenzmikroskop, das mit den entsprechenden Filtern ausgestattet ist. Plasmabehandelte neuronale Stammzellen weisen eine beschleunigte Differenzierungsrate und ein höheres Differenzierungsverhältnis im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle auf und gasströmungsbehandelte Stammzellen. Nach der Plasmabehandlung nimmt Nestin ab.Beta-Tubulin III erhöht sich signifikant. Und O4 steigt leicht an, im Vergleich zu kontrollbehandelten und gasstrombehandelten Stammzellen. Darüber hinaus wird nach 60 Sekunden Der Plasmabehandlung eine robuste Expression von reifen Neuronen, cholinergen Neuronen und motorischen Neuronmarkern beobachtet.Mit sehr wenigen GABAergic und serotonerge Neuronen, und keine dopaminergen Neuronen nachgewiesen. Beim Versuch dieser Verfahren, Es ist wichtig, sich zu erinnern, behandeln Sie die Zellen mit der richtigen Plasma-Dosierung, weil eine lange und intensive Plasma-Behandlungsphase Wird Zellapoptose oder Nekrose induzieren. Denken Sie daran, auch die Zelllebensfähigkeit vor der nachgelagerten Anwendung zu testen.

nerve-stem-cell-differentiation-one-step-cold-atmospheric-plasma

Research

Forschung

JoVE Journal

Engineering

Ingenieurwesen

Dieses Video zeigt die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) direkt in neurale Vorläuferzellen, ohne dass Feeder-Zellen oder Zwischenschritte verwendet werden. Die selektive Hemmung des Signalwegs des knochenmorphogenetischen Proteins (BMP) und des transformierenden Wachstumsfaktor-beta (TGF-β) führt zur Differenzierung der hES-Zellen in neurale Vorläuferzellen (NPCs).

Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen in neurale Vorläuferzellen

Dieses Video stellt eine Methode vor, um die Differenzierung in neuralen Stammzellen unter Verwendung von kaltem atmosphärischem Plasma auszulösen. Dabei werden UV-Strahlung und reaktive Moleküle erzeugt, die Nervenzellen zur Produktion von Projektionen anregen, was auf die Differenzierung neuronaler Zellen hinweist.

Stimulierung der Differenzierung von Nervenstammzellen durch Behandlung mit kaltem, atmosphärischem Plasma

Dieses Video zeigt den Prozess der Erzeugung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) aus menschlichen embryonalen Stammzellen, gefolgt von der Reifung von OPCs zu Oligodendrozyten. Dieser Prozess der Erzeugung von Oligodendrozyten eröffnet zahlreiche Möglichkeiten, die Erforschung und Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich Alzheimer, zu verbessern.

Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen in Oligodendrozyten

Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Mit der Absicht, Veränderungen in miRNAs auf differenzierten humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) zu charakterisieren, beschreiben wir die hNSC-Differenzierung auf einem dreidimensionalen System, die Bewertung von Veränderungen in der microRNA-Expression durch miRNA-PCR-Arrays und computergestützte Analysen zur Vorhersage von miRNA-Zielen und deren Validierung durch duale Luciferase-Assays.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Dieses Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von primären amniotische Flüssigkeit und Membran mesenchymalen Stammzellen in induzierte pluripotente Stammzellen unter Verwendung eines nicht-Integration von episomal Ansatzes in vollem Umfang chemisch definierten Bedingungen. Verfahren der Gewinnung, Kultur, Neuprogrammierung und Charakterisierung der daraus resultierenden induzierten pluripotenten Stammzellen durch strenge Methoden werden detailliert beschrieben.

Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

Die Generierung differenzierter Zelltypen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) ist sehr therapeutisches Versprechen, bleibt aber herausfordernd. PSCs weisen oft eine inhärente Unfähigkeit auf, sich zu differenzieren, selbst wenn sie mit einem richtigen Satz von Signalen stimuliert werden. Hier wird ein einfaches Tool beschrieben, um die Differenzierung mehrerer Linien über eine Vielzahl von PSC-Linien hinweg zu verbessern.

Transiente Behandlung von humanen pluripotenten Stammzellen mit DMSO zur Förderung der Differenzierung

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

Hier haben wir eine kostengünstige und einfach zu bedienende Methode etabliert, die eine schnelle und effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Neuronen leitet. Diese Methode eignet sich für die Popularisierung unter Laboratorien und kann ein nützliches Werkzeug für die neurologische Forschung sein.

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

Wir beschreiben eine Methode zur Differenzierung von vom Menschen induzierten pluripotenten Astrozyten und Neuronen des Rückenmarks und deren Kokultur für die elektrophysiologische Aufzeichnung.

Etablierung einer elektrophysiologischen Plattform zur Modellierung von ALS mit regionalspezifischen humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Astrozyten und Neuronen

Erfahren Sie die Differenzierung von Nerv-Stammzellen durch kalt atmosphärisches Plasma in vitro. Diese Methode ermöglicht sichere gerichtete Differenzierung für die Behandlung neurologischer Erkrankungen wie Parkinson.

Nerv-Stammzell-Differenzierung durch ein einstufiges kalt atmosphärischem Plasma Behandlung In-vitro-

Weitere Videos entdecken