Name: Lunge MicroRNA Profiling über the Estrous Zyklus bei Mäusen Ozon ausgesetzt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Lernen Sie die Bewertung von Lungen-MicroRNA-Profilen über den Estrous-Zyklus bei ozonexponierten Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung hormoneller Einflüsse auf entzündungsregulierende Gene.

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Diese Forschung wurde durch Zuschüsse vom NIH K01HL133520 (PS) und K12HD055882 (PS) unterstützt. Die Autoren danken für die Unterstützung mit Ozon Belichtung Experimente Dr. Joanna Floros.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Penn State University genehmigt.
1. Beurteilung des Estrous Zyklus-Phase
<ol><li>Zurückhalten Sie richtig ein Weibchen C57BL/6 die einhändige Maus Zurückhaltung Technik in Machholz Et Al.10beschriebenen Maus (8 – 9 Wochen alt) zu verwenden.</li>
	<li>Füllen Sie die sterile Pipette aus Kunststoff mit 10 μL ultrareines Wasser.</li>
	<li>Kunststoff Pipettenspitze in die Vagina einführen.</li>
	<li>Sanft spülen die Flüssigkeit 4 – 5 Mal auf die Probe zu sammeln.</li>
	<li>Legen Sie die letzte Spülung mit Scheidenflüssigkeit auf einen Objektträger.</li>
	<li>Die ungefärbte vaginale Spülung unter einem Lichtmikroskop mit einem 20 X Objektiv zu beobachten. Hinweis: Tiere, die nicht in regelmäßigen Zyklen durch Scheinträchtigkeit oder andere Ursachen-show aus dem Experiment ausgeschlossen werden müssen. Es wird empfohlen, täglich Vaginalsekret für mindestens drei aufeinander folgenden Zyklen Zyklizität bestätigen durchführen.</li>
</ol>2. Belastung durch Ozon
<ol><li>Legen Sie maximal 4 Mäuse in zwei 1,2 L Glasbehälter mit Wire Mesh Deckel und Wasser ad libitum.</li>
	<li>Setzen Sie einen Glasbehälter in der Ozon-Kammer und der andere in der gefilterten Luftkammer Exposition.</li>
	<li>Die Ozonkonzentration um 2 ppm und Monitor Ozonwerte regelmäßig anzupassen. Hinweis: Das Ozon-Gerät liefert einen geregelten Luftstrom (> 30 Luft Änderungen/h) mit kontrollierten Temperatur (25 ° C) und Luftfeuchtigkeit (50 %). Das System erzeugt Ozon durch eine elektrische Entladung Ozonisators, die überwacht und gesteuert durch ein UV-Ozon-Analysator und Massendurchflussregler, wie oben beschrieben11.</li>
	<li>Entfernen Sie Glasbehälter nach 3 h Ozon/gefilterte Luft ausgesetzt. Tiere, mit Bettwäsche, Nahrung und Wasser ad libitum Käfig zurück.</li>
</ol>(3) Lunge Sammlung
<ol><li>4 h nach der Belichtung zu betäuben Tiere mit einer intraperitonealen Injektion eine Ketamin/Xylazin cocktail (90 mg/kg Ketamin, 10 mg/kg Xylazin). Hinweis: Um einen angemessenen Grad an Anästhesie zu bestätigen, überprüfen Sie die Maus für ein Pedal reflex (feste Zehe Prise) und die Narkose nach Bedarf anpassen.</li>
	<li>Die Maus Haut mit 70 % Ethanol zu dämpfen.</li>
	<li>Machen Sie einen 2 cm Mittellinie Schnitt mit einem operativen Scheren und chirurgische Pinzetten, um die untere Hohlvene verfügbar zu machen.</li>
	<li>Opfern Sie Mäuse durch Durchtrennung der Vena Cava und Aorta. Bei Bedarf legen Sie 21 G-Gauge-Nadel in der Vena Cava oberhalb der renale Adern Blut vor dem Entbluten zu sammeln. Alternativ sammeln Sie Blut über Herz durchbohren nach standard-Protokolle.</li>
	<li>Verwenden Sie eine chirurgische Schere aufschneiden der Bauchhöhle und Haut/obere Muskel, verschieben nach oben in Richtung der Rippen entfernen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Membran zu durchbohren. Hinweis: Lungen werden von der Membran zusammenbrechen.</li>
	<li>Schneiden Sie den Brustkorb mit einer chirurgischen Schere, um Herz und Lunge verfügbar zu machen.</li>
	<li>Mit Pinzette, nehmen Sie eine 1,5 mL RNase-freie Microcentrifuge Schlauch und Tauchen Sie es in flüssigem Stickstoff, das Rohr zu füllen. Hinweis: Verwenden Sie Schutzbrille und Schutzhandschuhe, flüssigen Stickstoff behandeln.</li>
	<li>Entfernen Sie der Lunge zu, legen Sie sie in die RNase-freie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen gefüllt mit flüssigem Stickstoff zu Snap-das Gewebe Einfrieren, und warten Sie einige Sekunden, bis die Flüssigkeit verdampft.</li>
	<li>Schließen Sie den Schlauch Deckel und speichern Sie das Gewebe bei-80 ° C bis zu seiner Verwendung zu.</li>
</ol>(4) RNA-Vorbereitung
<ol><li>Ganze Lunge mit einer Edelstahl-Gewebe Pulverisator zu pulverisieren. Hinweis: Das Gewebe Pulverisator muss in flüssigem Stickstoff vor der Anwendung platziert werden. Reinigen Sie den Zerstäuber nach jedem Gebrauch mit RNAse-Lösung.</li>
	<li>Die pulverisierten Lungen aufgeteilt und legen Sie in zwei 1,5 mL Röhrchen (halbe Lunge).</li>
	<li>500 µL Guanidinium-Thiocyanat pro Probenröhrchen und verrühren.  Jede Probe mit 18 G, 21 G und 23 G Nadeln bzw. zu homogenisieren. Hinweis: Proben können mit 5,6 x 108 Kopien (von einer anderen Spezies) bevor mit der Extraktion ein kleines RNA Spike-im Steuerelement versetzt werden.</li>
	<li>Jede Probe und Vortex für 15 500 µL Ethanol hinzufügen s.</li>
	<li>Last die Mischung in einer Spin-Spalte in einem Sammelrohr und Zentrifuge bei 12.000 X g für 1 min. verwerfen der durchströmten.</li>
	<li>
Für DNase ich Behandlung (in Spalten);
	<ol>
<li>400 µL RNA Wash Buffer und Zentrifuge bei 12.000 X g für 1 min hinzufügen.</li>
		<li>Fügen Sie in eine RNase-freies Rohr 5 µL der DNase I und 75 µL 1 x DNA Verdauung Puffern und mischen. Fügen Sie die Mischung direkt in die Spalte Matrix.</li>
		<li>Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Spalte und die Zentrifuge bei 12.000 X g für 1 min. verwerfen der durchströmten 400 µL RNA eingespült Lösung hinzu, und wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
	<li>Hinzufügen der Spalte 700 µL Waschpuffer RNA und Zentrifuge bei 12.000 X g für 1 min. Entsorgen der durchströmten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 12.000 X g für 2 min, verbleibende Puffer zu entfernen. Übertragen Sie die Spalte in eine RNase-freies Rohr.</li>
	<li>Um RNA eluieren, 35 µL DNase/RNase-freies Wasser direkt hinzufügen der Spalte Matrix und Zentrifuge bei 12.000 X g für 1,5 min.</li>
	<li>Total RNA-Konzentration zu messen (260 nm) und Reinheit mit einem Spektralphotometer. Befolgen Sie die Anweisungen zum RNA Quantifizierung in einer 1,5 µL Probe aliquoten durchführen. Das Instrument mit DNase/RNase-freies Wasser zur Elution leer. Hinweis: ~2.0 260/280 Verhältnis gilt allgemein als "rein" für RNA. Typische RNA-Konzentration reicht in der Regel zwischen 750 und 2.500 ng/µL.</li>
	<li>Shop bei-80 ° C.</li>
</ol>5. MiRNA Profiling
<ol><li>
Retro-kleine RNAs, Einsatz 200 ng von Gesamt-RNS transkribieren.
	<ol>
<li>Bereiten Sie die Reverse Transkription Reaktion Mischung auf Eis (Gesamtvolumen pro Reaktion beträgt 20 µL). Fügen Sie für jede Reaktion 4 µL 5 x Puffer, 2 µL 10 X Nukleotide-Mix, 2 µL Reverse Transkriptase und 2 µL RNase-freies Wasser. Mischen Sie die Komponenten und Aliquot in 600 µL RNAse-freie Kunststoff-Rohre (10 µL-Mix pro Reaktion). Hinweis: Die Reverse Transkription-master-Mix enthält alle Komponenten, die erforderlich für die erste-Strang cDNA Synthese außer Vorlage RNA. Hinweis: Berechnen Sie überschüssige Volumen (10 %), bei der Vorbereitung der master-Mix.</li>
		<li>Fügen Sie die Vorlage RNA (200 ng in 10 µL) auf jedes Röhrchen mit Reverse Transkription master-Mix. Mix, Zentrifuge für 15 s bei 1000 X g, und speichern sie auf Eis bis in Thermocycler oder trockene Block platzieren.</li>
		<li>60 min bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>5 min bei 95 ° C inkubieren Sie und die Rohre auf Eis.</li>
		<li>Verdünnen Sie die cDNA durch Zugabe von 200 µL RNase-freies Wasser zu jeweils 20 µL Reverse Transkription Reaktion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Durchführen Sie Real-Time PCR unter Verwendung der Maus Entzündungsreaktion und Autoimmunität MiRNA PCR Array.
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine Reaktion Mischung (Gesamtvolumen 1100 µL): für jede Reaktion hinzufügen, 550 µL 2 X PCR-master-Mix, 110 µL 10 x universal Grundierung Mischung, 340 µL RNase-freies Wasser und 340 µL Vorlage cDNA (verdünnte Reaktion von Schritt 5.1.5).</li>
		<li>Jede Vertiefung des vorinstallierten MiRNA PCR-Array mit einem Mehrkanal-Pipette fügen Sie 10 µL Reaktion Mischung hinzu.</li>
		<li>Versiegeln Sie die MiRNA Array PCR Platte mit optischen Klebefolie.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Platte für 1 min bei 1.000 X g bei Raumtemperatur um Luftblasen zu entfernen.</li>
		<li>Programmieren Sie die Echtzeit-Thermocycler, PCR Erstaktivierung Schritt für 15 min bei 95 ° C, 3-Stufen-Radsport enthaltenden Denaturierung für 15 s bei 94 ° C, Glühen für 30 s bei 55 ° C und Erweiterung für 30 s bei 70 ° C für 40 Zyklen Reihe. Hinweis: Folgen des Herstellers Radfahren Bedingungen Anweisungen zum Einrichten der Echtzeit-Cycler. Führen Sie die Dissoziation Kurve Schritt in die Echtzeit-Cycler-Software integriert.</li>
		<li>Datenanalyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(6) Datenanalyse
<ol><li>Ct-Werte aus der Real-Time PCR Software für jede Probe in einer Analyse-Software zu extrahieren. Hinweis: Ein CT-Wert von 34 gilt als Cut-off. Wenn Proben Spike-Steuerelement (z. B., Cel-Mir-39) enthalten, normalisieren Sie Ct-Werte, die Spitze in der Steuerung für jede Probe. Grenzwerte müssen manuell eingestellt werden. Ausgangswerte werden automatisch eingestellt.</li>
	<li>Ct-Werte, die durchschnittliche Ct von sechs MiRNA-Housekeeping-Steuerelementen zu normalisieren: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, unter Verwendung der folgenden Gleichung: ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)</li>
	<li>Für Falte ändern Sie Berechnungen, berechnen Sie ΔΔCt Werte mit einer bestimmten Probe als das Steuerelement, mit dem relativen Ausdruck Gleichung12: MiRNA relativen Ausdruck: 2-∆∆Ct, wo - ∆∆Ct =-[∆Ct Test - ∆Ct Kontrolle] Hinweis: Eine Falte Änderung von 200 gilt als Cut-off.</li>
	<li>Export-Falte ändern Ausdruckswerte auf R mit dem Limma -Paket Bioconductor8statistische Analysen durchzuführen.</li>
	<li>Für multiple Vergleiche anhand der Benjamini-Hochberg Methode13zu korrigieren. Hinweis:  Eine Kopie der R-Skript ist abrufbar: <a href="http://psilveyra.github.io/silveyralab/">http://psilveyra.github.io/silveyralab/</a>. Datasets und analysierten Daten stehen auch an der Gene Expression Omnibus unter Nummer GSE111667 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.</li>
</ol>7. Analyse: Funktionelle Analysesoftware
<ol><li>Ordnen Sie das Dataset. Enthalten Sie MiRNAs mit ihren jeweiligen Ausdruck Log Verhältnisse und p-Werte. Siehe Tabelle 1 für die Formatierung von bestimmten Dataset.</li>
	<li>Offenen Funktionsanalyse Software (Version 10/01).</li>
	<li>Laden Sie das Dataset mithilfe des folgenden Formats: Dateiformat: "Flexible Format", enthält Spaltenüberschrift: "Ja", wählen Sie Bezeichnertyp: "MiRBase (alt)" Array-Plattform für Experimente verwendet: Wählen Sie die Array-Plattform. Hinweis: Akzeptierte Dateiformate sind txt (Registerkarte "getrennte Textdateien), XLS (excel-Dateien), und .diff (Cuffdiff Dateien).</li>
	<li>Wählen Sie "Beobachtungen ableiten" und überprüfen Sie, ob die experimentelle Gruppe Beschriftung korrekt ist.</li>
	<li>Gehen Sie zu "Dataset Zusammenfassung", den Gesamtbetrag der zugeordneter und nicht zugeordneter MiRNAs zu überarbeiten.</li>
	<li>
Klicken Sie auf die Schaltfläche "neu" am oberen linken Ecke des Programms. Wählen Sie "Neue MicroRNA Ziel Filter" und laden Sie ein MicroRNA-Dataset.
	<ol>
<li>Legen Sie Quelle: TarBase, Einfallsreichtum Experten Erkenntnisse, MiRecords.</li>
		<li>Vertrauen gesetzt: experimentell beobachteten oder hohe (vorausgesagt).</li>
		<li>Wählen Sie "Spalten hinzufügen", um eine Vielzahl von biologischen Informationen zu den Zielgruppen wie Arten, Krankheiten, Gewebe, Wege und mehr umfassen.</li>
		<li>Um Ziele zu konzentrieren, die Ausdruck im Experiment geändert haben, wählen Sie "hinzufügen / ersetzen mRNA Dataset". Verwenden Sie "Ausdruck Pairing", um Micro-RNAs mit dem gleichen oder einem anderen Ausdruck zu finden. Hinweis: Die Filter-Analyse liefern MicroRNA-Namen und Symbole, mRNA-Ziele, die Quelle, die Ziel-Beziehung und das Konfidenzniveau der vorhergesagten Beziehung (Abbildung 2) beschreibt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klicken Sie auf "Hinzufügen zu mein Weg" zum Senden der gefilterten Datensatz auf einer Leinwand weg und mehr biologische Zusammenhänge zu erforschen.</li>
	<li>Verwenden Sie Weg Designer Publikation Qualitätsmodell MicroRNA-Effekte zu erstellen.</li>
	<li>
Eine Alternative ist die Schaffung eine Kern-Analyse.
	<ol>
<li>Wählen Sie für Kern-Analyse "Expression Analysis".</li>
		<li>Wählen Sie für Messung "Expr Log Ratio".</li>
		<li>Analyse Filter Zusammenfassung: betrachten nur Moleküle bzw. Beziehungen wo: (Art = Maus) und (Vertrauen = experimentell beobachteten) AND (Datenquellen = "Einfallsreichtum Experte Ergebnisse", "Einfallsreichtum ExpertAssist Ergebnisse", "MiRecords", "TarBase", oder " Zielscan Mensch").</li>
		<li>Wählen Sie eine Abschaltung der p-Wert = 0,05.</li>
		<li>Führen Sie die Analyse. Hinweis: Der Bericht umfasst: kanonische Pfade, vorgelagerten Regulierungsbehörden Analyse, Krankheiten und Funktionen, Regler Effekte, Netzwerke und Moleküle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.

MicroRNA profiling ist eine vorteilhafte Technik für Diagnose von Krankheiten und mechanistische Forschung. In dieser Handschrift haben wir definiert ein Protokoll zur Evaluierung des Ausdrucks von MiRNAs, die voraussichtlich entzündlichen Gene in den Lungen von weiblichen Mäusen ausgesetzt Ozon in verschiedenen Estrous Zyklus Stufen regulieren. Methoden zur Bestimmung des Estrous Zyklus, wie die visuelle Erkennungsmethode wurden beschrieben16. Aber diese verlassen sich auf einmalige Messungen und...

Micro-RNAs (MiRNAs) sind kurze (19 bis 25 Nukleotide), natürlich vorkommende, nicht-kodierende RNA-Moleküle. Sequenzen von MiRNAs sind evolutionär konserviert über Artgrenzen, was auf die Bedeutung der MiRNAs bei der Regulierung der physiologischen Funktionen1. MicroRNA Expression profiling ist nachgewiesen worden, zur Identifizierung von MiRNAs, die wichtig sind bei der Regulierung der eine Vielzahl von Prozessen, einschließlich der Immunantwort, Zelldifferenzierung, Entwicklungsprozesse und Apoptose2hilfreich sein. Vor kurzem wurden MiRNAs für ihre mögliche Verwendung in der Krankheit Diagnostik und Therapie anerkannt. Für Forscher, die Mechanismen der Genregulation kann messen MiRNA Ausdruck aufklären Systemebene Modelle der regulatorischen Prozesse, vor allem beim MiRNA Informationen mit mRNA profiling und andere Genom angelegten Daten3. Auf der anderen Seite MiRNAs haben auch gezeigt, dass stabiler als mRNAs in verschiedensten Probenarten und auch sensibler als Proteine4messbar sind. Dies führte zu erheblichen Interesse an der Entwicklung von MiRNAs als Biomarker für unterschiedliche molekulare diagnostische Anwendungen, einschließlich Lungenerkrankungen.
In der Lunge MiRNAs eine wichtige Rolle in den Entwicklungsprozessen und die Aufrechterhaltung der Homöostase. Darüber hinaus wurde ihre abnormen Ausdruck der Entstehung und Progression von verschiedenen Lungenkrankheiten5zugeordnet. Entzündliche Lungenerkrankungen induziert durch Luftverschmutzung hat gezeigt, mehr schwere und schlechtere Prognose bei Frauen, die darauf hinweist, dass Hormone und den Estrous Zyklus Lunge angeborene Immunität und MiRNA Ausdruck als Reaktion auf ökologische Herausforderungen regulieren können 6. in diesem Protokoll verwenden wir Ozonbelastung, das ist ein wichtiger Bestandteil der Luftverschmutzung, um eine Form der Lungenentzündung bei weiblichen Mäusen zu induzieren, das auftritt, in Ermangelung der adaptiven Immunität. Durch die Verwendung von Ozon, sind wir die Entwicklung der Atemwege Hyperreaktivität induziert, die Atemwege Epithelzelle Schaden und eine Erhöhung der Neutrophilen und Entzündungsmediatoren im proximalen Airways7zugeordnet ist. Derzeit gibt es keine gut beschriebenen Protokolle zu charakterisieren und zu analysieren MiRNAs über den Estrous Zyklus bei Mäusen Ozon ausgesetzt.
Im folgenden beschreiben wir eine einfache Methode zur Ermittlung Estrous Zyklus Phasen und MiRNA Ausdruck im Lungengewebe von weiblichen Mäusen Ozon ausgesetzt. Wir sprechen auch effektive Bioinformatik Ansätze zur MiRNA Entdeckung und Target Identifizierung mit dem Schwerpunkt Bioinformatik. Wir analysieren die Microarray-Daten mithilfe von Limma, eine R/Bioconductor-Software, die eine integrierte Lösung bietet für die Analyse von Daten aus gen Ausdruck Experimente8. Analyse von PCR-Arraydaten aus Limma hat einen Vorteil in Bezug auf Leistung gegenüber t-basierte Testverfahren bei der geringen Anzahl von Arrays/Proben Verwendung Ausdruck zu vergleichen. Um biologische Zusammenhang mit MiRNA Ausdrucksergebnisse zu verstehen, haben wir dann die funktionale Analyse-Software verwendet. Um die Mechanismen zur Regulierung transcriptional Änderungen zu verstehen und wahrscheinlich Ergebnisse vorherzusagen, kombiniert die Software MiRNA-Ausdruck Datasets und wissen aus der Literatur-9. Dies ist ein Vorteil im Vergleich zu Software, die für die statistische Anreicherung in überlappenden Gruppen von MiRNAs schauen.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>8 Wochen alt</td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10813012</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Kunststoffpipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-25</td><td>Kapazität: 1,7 mL</td></tr><tr><td>Frosted Mikroskop Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2951TS</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Mikroskop Welt</td><td>MW3-H5</td><td>10x und 20x Ziel</td></tr><tr><td>Ketathesia-Ketamin HCl Injektion USP</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>55853</td><td>90 mg/kg. Kontrollierte Droge.</td></tr><tr><td>Xylazin Sterile Lösung</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td>10 mg/kg. Kontrollierte Droge.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>Mit Wasser auf 70 % Ethanol verdünnen.</td></tr><tr><td>21 G Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>329654</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Operationsschere</td><td>World Precision Instruments</td><td>501221, 504613</td><td>14 cm, Scharf/Blunt, Gebogen und 9 cm, Gerade, Pinzette mit feiner Spitze</td></tr><tr><td>Nizette Set</td><td>World Precision Instruments</td><td>504616</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum&nbsp; Bessman Gewebepulverisierer</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-418-1</td><td>Kapazität: 10 bis 50 mg</td></tr><tr><td>RNase-freie Mikrofuge-Röhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>TRIzol-Reagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Direct-Zol RNA MiniPrep Plus</td><td>Zymo Research</td><td>R2071</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>Maus Entzündungsreaktion & Autoimmunität miRNA PCR Array</td><td>Qiagen</td><td>MIMM-105Z</td><td></td></tr><tr><td>Dünnwandige, DNase-freie, RNasefreie PCR-Röhrchen</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific AM12225</td><td>für 20 μ; L-Reaktionen</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma-Spike-in-Kontrolle</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>https://office.microsoft.com/excel/</td></tr> <tr><td>Ingenuity Pathway Analysis</td><td>Qiagen</td><td></td><td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td></tr> <tr><td>R Software</td><td>The R Foundation</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>Thermocycler oder Kühl-/Heizblock</td><td>General Lab Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>General Lab Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR Cycler</td><td>General Lab Lieferant</td> Mehrkanal-Pipettierer <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>General Lab Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA-Waschpuffer</td><td>Zymo Research</td><td>R1003-3-48</td><td>48 mL</td></tr><tr><td>DNA-Aufschlusspuffer</td><td>Zymo Research</td><td>E1010-1-4</td><td>4 mL</td></tr><tr><td>RNA Pre-Wash Puffer</td><td>Zymo Research</td><td>R1020-2-25</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Ultraviolett-Ozon-Analysator</td><td>Teledyne API</td><td>Modell T400</td><td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td></tr><tr><td>Massendurchflussregler</td><td>Sierra Instruments Inc</td><td>Flobox 951/954</td><td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td></tr></tbody></table>

lunge microrna profiling über the estrous zyklus bei mäusen ozon ausgesetzt

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

MicroRNA (MiRNA) Profilerstellung ist von Interesse für Forscher arbeiten in verschiedenen Forschungsgebieten der Biologie und der Medizin geworden. Aktuelle Studien zeigen eine viel versprechende Zukunft der Verwendung von MiRNAs bei der Diagnose und Betreuung von Lungenerkrankungen. Hier definieren wir ein Protokoll für MiRNA profiling um die relative Häufigkeit einer Gruppe von MiRNAs voraussichtlich im Lungengewebe von von einem Mausmodell Ozon-induzierte Atemwege Entzündung entzündlichen Gene regulieren zu messen. Weil sich gezeigt hat, dass zirkulierenden Sexualhormone die Regulierung der angeborenen Immunität Lungenkrebs bei Frauen beeinflussen kann, ist der Zweck dieser Methode zu beschreiben, eine entzündliche MiRNA profiling Protokoll bei weiblichen Mäusen, unter Berücksichtigung des Estrous Zyklus Bühne der einzelnen Tiere zum Zeitpunkt der Ozonbelastung. Wir befassen uns auch geltenden Bioinformatik Ansätze zur MiRNA-Entdeckung und Ziel Identifizierungsmethoden mit Limma, ein R/Bioconductor-Software, und Funktionsanalyse Software zu verstehen, die biologischen Kontext und Wege zugeordnet differenzielle MiRNA Ausdruck.

Die verschiedenen Zelltypen in Ausstrichen beobachtet werden verwendet, um die Maus Estrous Zyklus-Phase (Abbildung 1) zu identifizieren. Diese sind durch Zellmorphologie gekennzeichnet. Während Proestrus sind Zellen fast ausschließlich Trauben von runden, wohlgeformten kernhaltigen Epithelzellen (Abbildung 1A). Wenn die Maus in die Brunst ist, sind Zellen verhornten Plattenepithel Epithelzellen, in dichten Büscheln (<strong clas...

Hier beschreiben wir eine Methode zur Bestimmung der Lunge Ausdruck von MiRNAs, die vorausgesagt werden, entzündlichen Gene regulieren mit Mäusen Ozon ausgesetzt oder gefilterte Luft in den verschiedenen Phasen des Estrous Zyklus.

Lunge MicroRNA Profiling über the Estrous Zyklus bei Mäusen Ozon ausgesetzt

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Lungenimmunität zu beantworten, wie die Expression von microRNAs bewertet werden kann, die voraussichtlich entzündliche Gene in der Lunge regulieren. Diese Technik bietet die einfache Möglichkeit, die Beiträge von zirkulierenden Hormonen zur Lunge microRNA Expression zu identifizieren. Um das estre Zyklusstadium zu beurteilen, halten Sie eine acht bis neun Wochen alte weibliche Maus manuell zurück und führen Sie die Spitze einer 10-Mikroliter-Kunststoffpipette ein, die mit ultrareinem Wasser gefüllt ist, in die Vagina.Vier- bis fünfmal sanft spülen, um eine Probe zu sammeln, und die endgültige Spülung der Vaginalflüssigkeit auf eine Glasrutsche ablagern. Beobachten Sie dann die ungefärbte vaginale Spülung unter einem Lichtmikroskop bei 20-facher Vergrößerung. Für Ozon- und gefilterte Lufteinlagen maximal vier Mäuse in einen von zwei einzelnen 1,2-Liter-Glasbehältern mit Drahtgitterdeckeln geben.Legen Sie einen Glasbehälter in eine Ozonkammer und einen in eine gefilterte Luftbelichtungskammer. Dann stellen Sie die Ozonkonzentration auf zwei Teile pro Million ein und entfernen Sie den Behälter nach drei Stunden. Vier Stunden nach der Exposition, desinfizieren Sie die exponierte Hautoberfläche der ersten experimentellen Maus mit 70% Ethanol und schneiden Sie den Rippenkäfig weg, um Herz und Lunge freizulegen.Verwenden Sie Zangen, um ein 1,5 Milliliter RNase-freies Mikrozentrifugenrohr in den flüssigen Stickstoff zu tauchen und die geerntete Lunge im flüssigen Stickstoff einzufrieren. Verwenden Sie dann einen Edelstahl-Gewebepulverisator, um die gesamte Lunge zu maskieren, und teilen Sie das pulverisierte Gewebe zwischen zwei 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren. Nach der Ernte und Pulverisierung der Lunge von allen Tieren auf die gleiche Weise, fügen Sie 500 Mikroliter Guanidiniumthiocyanat zu jeder Probe und sequenziell homogenisieren jedes Gewebe mit 18, 21 und 23 Gauge Nadeln.Nach der letzten Homogenisierung 500 Mikroliter Ethanol in jede Probe geben, bevor sie 15 Sekunden lang wirbeln. Die Mischungen zur Zentrifugation in einzelne Spinsäulen in einzelne Sammelrohre laden und die Durchflusse entsorgen. Für die Behandlung mit DNase 1 400 Mikroliter RNA-Waschpuffer zu jeder Spalte für eine weitere Zentrifugation hinzufügen und fünf Mikroliter DNase 1 und 75 Mikroliter DNA-Verdauungspuffer pro Probe in RNase-freien Röhrchen mischen.Fügen Sie die Mischung direkt zu den Säulenmatrizen für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu, gefolgt von zwei 400 Mikroliter-RNA-Vorspüllösungsspülungen durch Zentrifugation. Um die RNA zu verbessern, fügen Sie 35 Mikroliter DNase-RNase-freies Wasser direkt zu jeder Säulenmatrix für eine endgültige Zentrifugation hinzu und messen die gesamte RNA-Konzentration und Reinheit jeder Probe auf einem Spektralphotometer. Dann lagern Sie die RNA bei minus 80 Grad Celsius.Für die Retrotranskription der kleinen RNase, fügen Sie 200 Nanogramm der gesamten RNA in 10 Mikroliter Vorspüllösung zu einem Röhrchen Reverse Transkriptionsreaktionsmix pro Probe hinzu. Nach dem Mischen die Proben kurz zentrieren und bis zu ihrer Inkubation auf Eis legen. Als nächstes inkubieren Sie die Rohre für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius, gefolgt von einer fünfminütigen Inkubation bei 95 Grad Celsius.Am Ende der zweiten Inkubation die CDNA mit 200 Mikroliter RNase-freiem Wasser pro 20 Mikroliter Reverse-Transkriptionsreaktion verdünnen und 10 Mikroliter jeder Reaktionsmischungsprobe zu jedem Brunnen einer vorinstallierten Mausentzündungsreaktion und Autoimmunität microRNA PCR-Array hinzufügen. Das Proestrusstadium kann durch das Vorhandensein von runden und wohlgeformten Nukleat-Epithelzellen identifiziert werden. Wenn sich die Maus im Estrusstadium befindet, werden im Abstrich dicht gepackte Cluster von anucleierten, verhornten und Plattenepithelzellen beobachtet.Während metestrus werden verhornte Epithelzellen und polymorphonukleare Leukozyten beobachtet. In Diestrus sind Leukozyten im Allgemeinen häufiger. Rna, die aus vier Mauslungen extrahiert wird, weisen, wie gezeigt, Nukleinsäurekonzentrationen zwischen 1198 und 2178 Nanogramm pro Mikroliter und ein durchschnittliches A260-A280-Verhältnis zwischen 2,01 und 2,02 und ein durchschnittliches A260-A230-Verhältnis zwischen 2,139 und 2,223 auf.In dieser Tabelle werden zweifache Veränderungen der microRNA-Expression zwischen Ozon und gefilterten luftexponierten Mäusen angezeigt. Nach microRNA-Zielfilter und Kernanalyse für 14 microRNAs können diese Daten durch den microRNA-Zielfilter abgebildet werden, um das signifikante Expressionsprotokollverhältnis und die P-Werte zu erhalten. Die Kernanalyse liefert auch Informationen über kanonische Wege, Krankheiten und Funktionen, Regulierungsbehörden und Netzwerke.Darüber hinaus kann die funktionale Analysesoftware verwendet werden, um eine Netzwerkanalyse zu erstellen, die die Beziehung zwischen den microRNAs von Interesse und anderen Molekülen zeigt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, den Estrus-Zyklus täglich für mindestens drei aufeinander folgende Zyklen zu überprüfen, bevor ein Experiment durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren können andere Methoden durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über die entzündliche Genexpression der Lunge während des Estrus-Zyklus zu beantworten.Nach der Entwicklung ebnete diese Technik anderen Forschern auf dem Gebiet der Lungenimmunität den Weg, um Mechanismen der Sexualhormonregulation mit anderen Modellen zu erforschen.

lung-microrna-profiling-across-the-estrous-cycle-in-ozone-exposed-mice

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir, wie auf der Bühne des murinen reproduktiven (Proöstrus Brunst, Metöstrus oder Diöstrus) durch einfache, nicht-invasive Erfassung und zytologische Beurteilung der vaginalen Abstrich Proben zu identifizieren. Wir beschreiben weiterhin, wie Vaginalzytologie zirkulierenden Hormonspiegel zugrunde liegenden Übergang durch die murine reproduktiven Zyklus widerspiegelt.

Durchführen Vaginal Lavage, Kristallviolettfärbung und Vaginal zytologische Beurteilung für Maus Zyklusstand Staging Identification

Zwei Paradigmen Übung wurden auf einem neu entwickelten chemisch induzierte Menopause Mausmodell getestet werden, um die Auswirkungen der Wechseljahre auf die körperliche Belastbarkeit und Herz Anpassung ausüben zu untersuchen.

Eine Methode, um die Auswirkungen der Chemisch-induzierte Ovarialinsuffizienz on Exercise Cardiac Kapazität und Anpassung in Mäusen untersucht

Diese Studie beschreibt die erfolgreiche Generierung von ein neues Tiermodell für die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), indem man immer wieder Mäuse, um hohe Konzentrationen von Ozon.

Generation von eine chronisch obstruktive Lungenerkrankung-Modell bei Mäusen durch wiederholte Ozonbelastung

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Bestimmung, ob die Exposition gegenüber Ozon, einem Kriterium des Luftschadstoffs, die Alveolarmakrophagen-Efferozytose in vivo beeinträchtigt. Dieses Protokoll verwendet häufig verwendete Reagenzien und Techniken und kann an mehrere Modelle von Lungenverletzungen angepasst werden, um Die Auswirkungen auf die Alveolar-Makrophagen-Efferozytose zu bestimmen.

In Vivo Bewertung der Alveolar Makrophagen-Efferozytose nach Ozon-Exposition

Kombinierte Ozon- und bakterielle Endotoxin-exponierte Mäuse zeigen einen weit verbreiteten Zelltod, einschließlich des von Neutrophilen. Wir beobachteten zelluläre Anpassungen wie die Störung der zytoskelettalen Lamellipodie, eine erhöhte zelluläre Expression der komplexen V-ATP-Synthase-Untereinheit β und Angiostatin in der broncho-alveolären Lavage, die Unterdrückung der Lungenimmunantwort und eine verzögerte Neutrophilenrekrutierung.

Visualisierung von lungenzellulären Anpassungen während kombinierter Ozon- und LPS-induzierter akuter Lungenverletzungen bei Der Maus

Eine Methode zur Mikrodissektion des Eileiters der Maus, die die Sammlung der einzelnen Segmente unter Beibehaltung der RNA-Integrität ermöglicht, wird vorgestellt. Darüber hinaus wird ein nicht-enzymatisches oviduktales Zelldissoziationsverfahren beschrieben. Die Methoden eignen sich für die anschließende Gen- und Proteinanalyse der funktionell unterschiedlichen Eileitersegmente und dissoziierten Eileiterzellen.

Mikrodissektion und Dissoziation des Murinen Eileiters: Identifizierung einzelner Segmente und Einzelzellisolierung

In diesem Protokoll wurden die translatierende Ribosomenaffinitätsreinigungsmethode (TRAP) und die Isolierung von Zellkernen, die in bestimmten Zelltypen markiert wurden (INTACT), für die paarweise Abfrage des zellspezifischen ovariellen Transkriptoms und Epigenoms unter Verwendung des NuTRAP-Mausmodells, das mit einer Cyp17a1-Cre-Mauslinie gekreuzt wurde, optimiert.

Zellspezifische paarweise Abfrage des Ovarialepigenoms und des Transkriptoms der Maus

Das follikelstimulierende Hormon (FSH) in verschiedenen extragonadalen Geweben und Organen wird mit der Pathogenese mehrerer Krankheiten in Verbindung gebracht. Das ovariektomierte und FSH-behandelte Mausmodell (OVF) kann verwendet werden, um die extragonadalen Wirkungen von FSH zu untersuchen.

Untersuchung unabhängiger Effekte des follikelstimulierenden Hormons in vivo in einem Mausmodell

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Beschreibung des Tests zur Unterscheidung von vergrabenen Lebensmitteln und des Experiments zur sozialen Geruchsunterscheidung, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber eingeatmeten Umweltschadstoffen auf die Geruchsfunktion bei Mäusen zu bewerten.

Untersuchung der Auswirkungen von eingeatmeten Umweltschadstoffen auf die Geruchsfunktion bei Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Hypoxie bei neugeborenen Mäusen zu induzieren, indem sie in kontrollierten Umgebungen mit unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen verabreicht werden. Mausmodelle, die bei der Geburt Sauerstoffschwankungen ausgesetzt waren, haben die Expression von miRNAs, die an der Induktion von phänotypischen Verhaltensänderungen wie Autismus beteiligt sind, dauerhaft variiert.

Hypoxie verändert miRNAs-Spiegel, die an der nicht-Mendelschen Vererbung der Autismus-Spektrum-Störung bei Mäusen beteiligt sind

Lernen Sie die Bewertung von Lungen-MicroRNA-Profilen über den Estrous-Zyklus bei ozonexponierten Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung hormoneller Einflüsse auf entzündungsregulierende Gene.

Lunge MicroRNA Profiling über the Estrous Zyklus bei Mäusen Ozon ausgesetzt

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