Name: Fluoreszierende silberne Färbung von Proteinen im Polyacrylamid-Gele (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Lernen Sie eine neuartige fluoreszierende Silberfärbung für Proteine in Polyacrylamid-Gelen. Diese Methode nutzt einen fluorogenen Silber-Sonde und bietet höhere Empfindlichkeit als herkömmliche Silbernitratfärbung.

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Die Autoren möchten Patrick Chan bei Ming Wai Lau Zentrum für Reparative Medizin, Karolinska Institutet, für seine technische Unterstützung zu danken. S. X. ist dankbar für die Unterstützung von der schwedischen Forschungsrat (Grant No. 2017-06344).

1. Vorbereitung des Gels
Hinweis: Die Demonstration folgt ein standard Protokoll, um das Gel kurz nach SDS-PAGE12Färbung vorbereiten. Kurz gesagt, die folgenden Schritte beschreiben die Vorbereitung der Proben und gel-Elektrophorese.
<ol><li>SDS-PAGE mit 4 % - 12 % Bis-Tris Protein Gele (1 mm, 15-Brunnen) durchführen mit einem Mini-Gel Tank gefüllt mit 2-(N -Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES) Puffer.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Proben mit einer Mischung aus destilliertem Wasser, Lithium-Dodecyl-Sulfat (LDS)-Puffer und eine Probe-Reduktionsmittel.</li>
	<li>Laden Sie die erste Spur mit doppelt so viel Lager (10 µL), gefolgt von der normalen Lager Menge (5 µL) und eine Reihe von doppelten Verdünnungen des Bestandes danach (von 2 X bis 8192 X 13 Verdünnungen).</li>
	<li>Laufen Sie das Gel bei einer konstanten Spannung von 200 V für 30 min.</li>
</ol>2. Fixierung des Gels
<ol><li>Tauchen Sie nach Elektrophorese die Gele in einer 100 mL-Lösung von 40 % ethanol/10% Essigsäure auf einem Orbitalschüttler bei 50 u/min bei Raumtemperatur 2 x (jeweils für 30 min), oder über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>Waschen Sie die Gele 3 x 10 min in Reinstwasser in einem sauberen Behälter. Die Waschschritt ist von entscheidender Bedeutung. Wenn die Säure aus der Festlegunglösung im dritten Schritt Fluorogenic nicht ordnungsgemäß entfernt wird, die übermäßigen TPE-4TA wird durch die Säure aktiviert werden und führen zu starken Hintergrundfluoreszenz im Gel.</li>
</ol>3. Vorbereitung des AgNO3Lösung und Silber Imprägnierung des Gels
<ol><li>AgNO3 Lösung (0,0001 %) machen für die Imprägnierung zunächst lösen Sie 0,01 g von AgNO3 in 10 mL Reinstwasser eine 0,1 % AgNO3 Stammlösung vorbereiten auf. Als nächstes fügen Sie 100 µL der Stammlösung 0,1 % AgNO3 in 100 mL Reinstwasser, funktionierende Lösung zu machen. Hinweis: Die AgNO3 Lösung sollte in der Dunkelheit vor dem Gebrauch aufbewahrt werden.</li>
	<li>Imprägnieren Sie das Gel mit 100 mL Silber arbeiten Lösung für 1 h auf einem Orbitalschüttler bei 50 u/min in einem verschlossenen Glascontainer. Es ist entscheidend für die silberne Imprägnierung unter einem Abzug, lichtgeschützt mit Alu-Folie durchführen.</li>
	<li>Waschen Sie das Gel mit Reinstwasser (ca. 100 mL) in einem sauberen Behälter für 2 x 60 s.</li>
</ol>(4) Fluorogenic Entwicklung des Gels
<ol><li>Zur Vorbereitung der Farbstoff-Stammlösung (0,1 mM) fügen Sie 3,0 mg des TPE-4TA Farbstoffs in 50 mL Reinstwasser hinzu. Beschallen Sie die Lösung für ein paar Minuten und fügen Sie einige NaOH-Lösung (z.B. 1 M) um den Farbstoff lösen zu helfen.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Fluoreszenz der Lösung unter einer 365 nm UV Lampe um sicherzustellen, dass die Farbstoff-Moleküle vollständig aufgelöst ist. Schwache oder nonemissive Lösungen immer nur volle Auflösung angegeben. Hinweis: Der Farbstoff war TPE-4TA synthetisiert folgendes Protokoll kürzlich von Xie Et Al. berichtete 10 die TPE-4TA -Lösung ist sehr stabil und kann monatelang im Dunkeln gehalten werden.</li>
	<li>Um 100 mL der Fluorogenic entwickelnden Lösung (10 µM) vorzubereiten, fügen Sie 10 mL der TPE-4TA Vorratslösung in 90 mL Reinstwasser. Überprüfen Sie den pH-Wert der Lösung mit einem pH-Meter und tune es 7-9 mit einer Natriumhydroxid-Lösung (1 µM).</li>
	<li>Übertragen Sie das Gel auf einen sauberen und verschließbaren Behälter mit 100 mL der Fluorogenic entwickelnden Lösung. Stellen Sie sicher, dass das Gel ganz in die Lösung eingetaucht ist. Verschließen Sie den Behälter. Bedecken Sie es vor Licht und schütteln Sie sie über Nacht auf einem Orbitalschüttler bei 50 u/min bei Raumtemperatur. Alternativ kann die Inkubationsschritt auch auf ca. ~ 2 h verkürzt werden, durch Vorwärmen der AIE entwickelnden Lösung auf 80 ° C zum Beizen und dann verlassen sie bei Raumtemperatur.</li>
</ol>(5) entfärben und Imaging
<ol><li>Das Gel auf einen sauberen Behälter übertragen und in 100 mL 10 % Ethanol für 30 min destain. Hinweis: Wasser allein kann verwendet werden, um das Gel zu waschen. Es ist jedoch mehr Zeit-effizient zu nutzen eine 10 % ige Ethanol-Lösung für das entfärben. Dadurch wird das destaining Verfahren von Stunden auf 30 Minuten verkürzen.</li>
	<li>Spülen Sie das Gel in Reinstwasser für 5 Minuten.</li>
	<li>Bild das Gel auf die 365 nm oder 302 nm-Kanal von einer Gel-Dokumentation-Maschine.</li>
</ol>

<ol><li>Chevalier, F. <a target="_blank" href="https://proteomesci.biomedcentral.com/articles/10.1186/1477-5956-8-23">Highlights on the capacities of &#34;Gel-based&#34; proteomics.</a> Proteome Science. 8 (1), (2010).</li>
<li>Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+detection+methods+for+gel-based+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).</li>
<li>Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics%3A+assessing+the+spectrum+of+in-gel+protein+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods.</a> Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).</li>
<li>Candiano, G., Bruschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li>
<li>Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins in polyacrylamide gels.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).</li>
<li>Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+silver+staining+of+protein+in+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+an+azo+dye%2C+calconcarboxylic+acid%2C+as+a+silver-ion+sensitizer%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).</li>
<li>Celis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).</li>
<li>Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+Staining+Techniques+of+Polyacrylamide+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels.</a> Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).</li>
<li>Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver-staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels%3A+a+general+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview.</a> Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).</li>
<li>Zhou, M., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+by+Two-Dimensional+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).</li>
<li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+Ag%2B-Tetrazolate+Aggregation+Enables+Efficient+Fluorescent+Biological+Silver+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).</li>
<li>Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Eine Patentanmeldung auf diese fluoreszierende silberne Färbung wurde eingereicht.

Hier vorgestellten ist eine neuartige fluoreszierende silberne Färbung Methode für Proteine in Polyacrylamid-Gele. Diese Strategie integriert konventionellen Silber Flecken und fluoreszierende Flecken. Die Färbung Heldentaten die selektive Bindung von Silberionen an Proteine wie in anderen Silber Flecken aber beschäftigt eine hochempfindliche Fluorogenic Silber Sonde TPE-4TA , um die silberne gebundene Proteine Leuchten. Da die Fluorogenic Sonde TPE-4TA silberne-Ionen bei einer relativ n...

Viele Färbung Methoden wurden verwendet, um Proteine nach Gelelektrophorese, z. B. Verwendung von farbmetrischen Farbstoffen wie Coomassie Brilliant Blue, silbernen Fleck, Fluoreszenz zu visualisieren oder radioaktive Markierung1,2, 3 , 4. silberne Färbung gilt als eines der sensibelsten Techniken für Proteindetektion erfordern einfache und billige Reagenzien. Es kann in zwei große Gruppen unterteilt werden: der ammoniakalischen Silber Fleck und das Silbernitrat Flecken5,6. In der alkalischen ammoniakalischen Silber-Methode ist der Silber-Diamin-Komplex mit Ammoniak und Natriumhydroxid hergestellt und während der Entwicklung mit einer sauren Formaldehyd-Lösung zu metallischem Silber reduziert. Der Fleck beherbergt effizient für grundlegende Proteine aber zeigt eine kompromittierte Performance für saure und neutrale Proteine und ist darüber hinaus auf klassischen Glycin und Taurin elektrophoretischen Systemen beschränkt. Im Vergleich dazu die Silbernitrat Flecken nutzen die hohe Bio-Affinität von Silberionen an Protein, in erster Linie die Sulfhydryl Carboxylgruppen Gruppen aus den Seitenketten und tendenziell saure Proteine effizienter Fleck7. Nach Silberionen verbindlich, eine entwickelnde Lösung (in der Regel aus einer Metall-Karbonat-Lösung, die Formaldehyd und Natrium Thiosulphate) wird angewendet, um die Silberionen zu metallischem Silber Körner zu verringern, die eine braun-dunkel Farbe visualisieren bauen die Protein-Bänder.
Obwohl Silber Färbung bekannt für seine Vielseitigkeit und hohe Empfindlichkeit seit seiner Entwicklung in den 1970er Jahren8gewesen, wird die Methode häufig als schwierig angesehen. Silber-Färbung Methoden haben zeitlich begrenzte Schritte und zeigen niedrige Reproduzierbarkeit. Da die Farbe des silbernen Fleck in der Regel nicht ist einheitlich und Reduktionsschritt, die schwer zu kontrollieren ist abhängig, der silberne Fleck ist keine quantitative Methode und somit nicht für Gel Vergleich Studie und Protein Quantifizierung9empfohlen. Methoden in der Empfindlichkeit optimiert können Aldehyde verwenden, die auch eine gleichmäßigeren Färbung10anbieten können. Dies ist jedoch auf Kosten der weiteren nachgeschalteten Analyse durch die Vernetzung von Proteinen durch Aldehyde. Schnelle Protokolle meist kombinieren oder kürzen Sie Schritte zu verkürzen, die Reproduzierbarkeit und Einheitlichkeit der Fleck5zu beeinträchtigen. Infolgedessen gibt es zahlreiche Silber Färbung Varianten innerhalb Protein Gel Färbung, jeweils optimiert, um bestimmte Anforderungen zu entsprechen; zum Beispiel, Einfachheit, Sensibilität oder Peptid Verwertungsquote für nachgelagerte Analyse. Diese Attribute haben ebenfalls einen Einfluss auf einander, und erfüllt alle Anforderungen in einem Protokoll kann schwierig sein.
In dieser Arbeit stellen wir eine neue fluoreszierende silberne Färbung Methode zur Proteindetektion Polyacrylamid-Gel. Bei dieser Methode verwenden wir Fluorogenic Sonde für Silberionen, TPE-4TA (Abbildung 1), die Silber-imprägnierte Proteine11zu visualisieren. TPE-4TA richtet sich nach dem Prinzip der Aggregation-induzierte Emission (AIE). Es ist nicht emissiven, in wässriger Lösung aufgelöst, jedoch höchst emissiven in Anwesenheit von Silber-Ionen. Indem die chromogene Entwicklung im traditionellen silbernen Flecken mit einer Fluorogenic Entwicklung Schritt ermöglicht die fluoreszierende silberne Methode die robuste Färbung des gesamten Proteine mit einem reduzierten Hintergrund.
Darüber hinaus zeigte die fluoreszierende silberne Fleck eine gute lineare Dynamik für Protein Quantifizierung, die vergleichbar mit den weit verbreiteten SYPRO Ruby Fleck und mit traditionellen silbernen Flecken nicht erreichbar ist. Das Gel kann auf häufig verwendete Gel-Dokumentation-Systeme mit einer UV-Lampe abgebildet (Erregung Wellenlänge: 302/365 nm Kanal; Emission: ~ 490-530 nm) bei vielen biologischen Labs.

<table><tbody><tr><td> LDS-Probenpuffer (4X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td> 4-12 % Bis-Tris-Proteingele, 1,0 mm, 15 Well</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td>Vorgefertigtes Gel</td></tr><tr><td>Probenreduktionsmittel (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0004</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>MES SDS Laufpuffer (20x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0002</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Mini Gel Tank</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25977</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>300W Netzteil (230 VAC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PS0301</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Ungefärbtes Protein Leiter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Probe</td></tr><tr><td>Silbernitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31630-25G-R</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Bragg und Co.</td><td>42520J</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>J.T. Baker</td><td>103201A</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Milli-Q Synthese A10</td><td></td> <td>Merk-Liefert</td> <td>18,2 M&Omega;. cm</td></tr><tr><td>Wasser-Gel-Dokumentationssystem (Modell C600)</td><td>Azure Biosystems-Equipment</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluoreszierende silberne färbung von proteinen im polyacrylamid-gele

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Silberne Färbung ist ein kolorimetrischen Verfahren häufig verwendet, um Protein-Bands in Polyacrylamid-Gele nach Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zu visualisieren. Der klassische silberne Flecken haben bestimmte Nachteile wie hoher Hintergrund Färbung, schlechte Proteingewinnung, niedrige Reproduzierbarkeit, einen schmalen linearen Dynamikbereich zur Quantifizierung und begrenzte Kompatibilität mit der Massenspektrometrie (MS). Jetzt, mit dem Einsatz einer Fluorogenic Ag+ Sonde, TPE-4TA, entwickelten wir eine fluoreszierende silberne Färbung Methode für die Gesamt-Protein-Visualisierung in Polyacrylamid-Gele. Dieser neue Fleck vermeidet das lästige Silber Reduktionsschritt in traditionellen silbernen Flecken. Darüber hinaus zeigt der fluoreszierende silberne Fleck gute Reproduzierbarkeit, Sensibilität und lineare Quantifizierung in Protein-Erkennung, so dass es einen nützliches und praktisches Protein Gel Fleck.

Die Protein-Bands befleckt durch fluoreszierende silberne Flecken zeigen ein intensives grün fluoreszieren unter 365 nm UV-Licht. Alle 14 Protein Bänder (10-200 kDa), waren von oben nach unten, deutlich sichtbar, korreliert gut mit den 14 rote Flecken von SYPRO Ruby Farbstoff (Abbildung 2)10.
In Bezug auf quantitative Proteindetektion die Gele wurden durch ein Gel imaging-Sys...

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll umreißt eine neue fluoreszierende Färbung Technik für Gesamt-Protein Nachweis in Polyacrylamid-Gele. Das Protokoll nutzt eine Sonde, Silber Ionen-spezifische Fluoreszenz Turn-on, die Ag+erkennt-Proteinkomplexe, und gewisse Einschränkungen der traditionellen chromogenen Silber Flecken beseitigt.

Fluoreszierende silberne Färbung von Proteinen im Polyacrylamid-Gele

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Dies ist eine neuartige Gelfärbungsmethode, die eine fluorogene Silbersonde verwendet, um die traditionelle Silberfärbung in eine fluoreszierende Silberfärbung umzuwandeln. Diese Methode zeigte eine verbesserte Leistung im Vergleich zu herkömmlichen Silbernitratfärbung und SYPRO Ruby Färbung, während ein einfaches und einfaches Protokoll ohne Aldehyde verwendet. Demonstriert wird das Verfahren von Alex Wong, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor.Um dieses Verfahren zu beginnen, verdünnen Sie die Proteinproben mit einer Lösung, die destilliertes Wasser, EINEN LDS-Puffer und ein Probenreduktionsmittel enthält. Richten Sie einen Mini-Geltank mit MES-Puffer ein, um SDS-PAGE mit einem 4-12%Bis-Tris Proteingel durchzuführen. Laden Sie die Brunnen mit der vorbereiteten Proteinprobe, dann führen Sie das Gel mit einer konstanten Spannung von 200 Volt für 30 Minuten.Nach der Elektrophorese tauchen Sie das Gel in eine 100-Milliliter-Lösung, die Ethanol und Essigsäure enthält, auf einem Orbitalshaker unter und inkubieren Sie das Gel zweimal für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur, während sie bei 50 U/min schütteln. Als nächstes waschen Sie das Gel dreimal mit reinem Wasser in einem sauberen Behälter mit jeder Wäsche von 10 Minuten. Lösen Sie zunächst 0,01 Gramm Silbernitrat in 10 Milliliter Reinstwasser auf, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 0,1% herzustellen, fügen Sie 100 Mikroliter der Stammlösung in 100 Milliliter Reinstwasser, um die Silbernitrat-Arbeitslösung zu machen.In einer Dunstabzugshaube tauchen Sie das Gel in 100 Milliliter der Silbernitrat-Arbeitslösung in eine versiegelte Glaskammer. Verwenden Sie Aluminiumfolie, um das Gel während der Imprägnierung vor Licht zu schützen und eine Stunde lang zu brüten, während Sie bei 50 Umdrehungen pro Minute auf einem Orbital-Shaker schütteln. Danach das Gel zweimal mit reinem Reinstwasser in einem sauberen Behälter waschen, wobei jede Wäsche etwa 100 Milliliter Wasser und eine Dauer von 60 Sekunden beträgt.Es ist wichtig, reines Wasser zu verwenden, um das Gel nach dem Silberimprägnierungsschritt zu reinigen, um die Hintergrundfärbung zu minimieren. Fügen Sie zunächst 50 Milliliter Reinstwasser zu drei Milligramm TPE-4TA-Farbstoff hinzu. Beschallen Sie die Lösung für drei Minuten und fügen Sie fünf Mikroliter ein-molar Natriumhydroxid-Lösung zwischen jeder Beschallungssitzung, um den Farbstoff aufzulösen, in der Regel bis zu dreimal.Überprüfen Sie dann die Fluoreszenz der Lösung unter einer 365-Nanometer-UV-Lampe, um sicherzustellen, dass der Farbstoff vollständig gelöst ist. Nur schwache oder nicht emissive Lösungen deuten auf eine vollständige Auflösung hin. Um die fluorogene Entwicklungslösung vorzubereiten, fügen Sie 10 Milliliter der TPE-4TA-Stammlösung zu 90 MilliliterReinstwasser hinzu.Verwenden Sie ein pH-Messgerät, um den pH-Wert der Lösung zu überprüfen. Stellen Sie die Lösung auf einen pH-Wert zwischen 7 und 9 ein, indem Sie verdünnte Natriumhydroxidlösung oder Essigsäure verwenden, wenn der pH-Wert anicht eatoriert ist. Als nächstes das Gel in einen sauberen und verschließbaren Behälter mit 100 Millilitern der fluorogenen Entwicklungslösung übertragen und sicherstellen, dass das Gel vollständig eingetaucht ist.Versiegeln Sie den Behälter und bedecken Sie ihn, um ihn vor Licht zu schützen. Schütteln Sie den Behälter über Nacht auf einem Orbital-Shaker bei 50 Umdrehungen von Euro/Min. und bei Raumtemperatur. Das Gel in einen sauberen Behälter geben und 30 Minuten lang in 100 Milliliter 10% Ethanol entführen.Dann spülen Sie das Gel in reinem Wasser für fünf Minuten. Das Gel kann auf einem Tischtransilluminator visualisiert oder auf einer Geldokumentationsmaschine am 365-Nanometer-Kanal oder dem 302-Nanometer-Kanal abgebildet werden. In dieser Studie wird eine neuartige fluoreszierende Silberfärbungsmethode verwendet, um Proteine in Polyacrylamidgelen zu färben.Die Proteinbänder, die durch den fluoreszierenden Silberfleck gebeizt werden, weisen ein intensives Grün unter einer 365-Nanometer-UV-Lampe auf. Alle 14 Proteinbänder sind deutlich sichtbar und korrelieren gut mit den rot gefärbten Bändern des SYPRO Ruby Farbstoffs. Diese fluoreszierende Silberfärbungsmethode scheint eine hohe Auflösung zu haben.Bei einigen Proteinbändern ist die Empfindlichkeit des fluoreszierenden Silberflecks auch etwas besser als die des fluoreszierenden SYPRO Ruby-Fleckens. Insbesondere die Leistung dieses Fleckens wird für die Proteinbänder zwischen 10 und 40 Kilodalton verbessert, was darauf hindeutet, dass die neue Methode besonders nützlich für den Nachweis von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht ist. Wie man sieht, deuten die Daten auch darauf hin, dass der fluoreszierende Silberfleck eine gute und gleichmäßige Linearität für alle 14 Proteine über ein relativ breites Spektrum an Proteinquantifizierung ergibt.Während der Silbernitratfleck ein hohes Maß an Hintergrundsignal und verzerrte Spitzen lieferte, erfasste der fluoreszierende Silberfleck die Bänder mit gutem Kontrast und gleichmäßiger Intensitätsverteilung, vergleichbar mit dem SYPRO Ruby Fleck über alle 14 Proteine. Waschschritte sind wichtig, da sie die Restfixierungslösung durch Unterbrechung der Silberimprägnierung oder fluorogenen Entwicklung einschränken. Bei verwendung von Silbernitrat hautkontaktvermeiden.Reinigen Sie alle Verschüttungen sofort. Tragen Sie Schutzkleidung und Handschuhe und entsorgen Sie sie als chemische Abfälle.

fluorescent-silver-staining-of-proteins-in-polyacrylamide-gels

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Nach der Trennung durch elektrophoretische Methoden können Proteine ​​in einem Gel durch mehrere Färbemethoden nachgewiesen werden. Die Färbung von Proteinen mit Coomassie Blue, Silver Färbung, SYPRO Orange, SYPRO Ruby sind in diesem Video demonstriert.

Die Färbung Proteine ​​in Gelen

Eine einfache und spezifische Methode wurde für Fluoreszenzmarkierung und verbesserte Erkennung von Zelloberflächen-Proteine ​​ohne Fraktionierung Schritt demonstriert. Differential Fülle in Zelloberflächenproteine ​​wurde mittels zweidimensionaler (2-D)-Elektrophorese und Ettan ™ DIGE Technologie.

Selektive Markierung von Zelloberflächen-Proteinen unter Verwendung von CyDye DIGE Fluor Minimal Farbstoffe

Ein kurzes Protokoll für Protein-Färbung mit Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in Polyacrylamidgelen wird ohne Verwendung von organischen Lösungsmitteln oder Essigsäure als in der klassischen Färbeverfahren mit CBB beschrieben.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

Dieses Video ist eine kolloidale Coomassie G-250 Färbung Protokoll nach Kang...

Schnell und feinfühlig Kolloidale Coomassie G-250 Färbung für Proteine ​​in Polyacrylamidgelen

In diesem Video demonstrieren wir eine Silberfärbemethode von Polyacrylamid-Gelen zur Visualisierung des Gesamtproteins mit fluorogenen Sonden.

Fluoreszierende Silberfärbung: Eine Technik zur Visualisierung des Gesamtproteins in Polyacrylamid-Gelen

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur kombinierten Alcian-Blau- und Silberfärbung von sulfatierten Glykosaminoglykan-Oligosaccharid-Fragmenten. Diese kombinierte Färbetechnik verstärkt die Banden von Glykosaminoglykan-Polymeren unterschiedlicher Länge in Polyacrylamid-Gelen erheblich.

Silberfärbung von sulfatierten Glykosaminoglykanen: Eine Färbemethode zur Visualisierung von sulfatierten Glykosaminoglykanen in Polyacrylamidgelen

Dieses Video zeigt eine denaturierende Polyacrylamid-basierte Trenntechnik für Proteine. Diese Technik hilft bei der vorläufigen Identifizierung von Proteinen anhand ihres Molekulargewichts.

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die Proteinanalyse: Eine Technik zur Trennung und Visualisierung von Proteinen auf der Grundlage des Molekulargewichts

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Hier berichten wir über eine einfache und kostengünstige Silber Färbeprotokoll erfordert nur drei Reagenzien und 7 min von Verarbeitung und eignet sich für schnelle Generierung von qualitativ hochwertigen SSR Daten in der genetischen Analyse.

Eine schnelle Silber Färbung Protokoll ermöglicht einfache und effiziente Erkennung von SSR-Marker mit einem Non-denaturierenden Polyacrylamid-Gel

Hier präsentieren wir eine empfindliche, schnelle und diskriminierende Post-Gel-Färbungsmethode, um RNAs mit RNA Mango Aptamern I, II, III oder IV abzubilden, wobei entweder native oder denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)-Gelverwendet werden. Nach dem Ausführen von Standard-PAGE-Gelen kann Mango-markierte RNA leicht mit TO1-Biotin gefärbt und dann mit allgemein verfügbaren Fluoreszenzlesern analysiert werden.

Fluoreszierende Visualisierung von Mango-markierter RNA in Polyacrylamidgelen über eine Poststaining-Methode

Dieser Bericht beschreibt Techniken zur Isolierung und Reinigung von sulfatierten Glykosaminoglykanen (GAGs) aus biologischen Proben und einen Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Ansatz, um ihre Größe anzunähern. GAGs tragen zur Gewebestruktur bei und beeinflussen Signalprozesse durch elektrostatische Interaktion mit Proteinen. Die GAG-Polymerlänge trägt zu ihrer Bindungsaffinität für verwandte Liganden bei.

Nachweis von Glykosaminoglykanen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung

Lernen Sie eine neuartige fluoreszierende Silberfärbung für Proteine in Polyacrylamid-Gelen. Diese Methode nutzt einen fluorogenen Silber-Sonde und bietet höhere Empfindlichkeit als herkömmliche Silbernitratfärbung.

Fluoreszierende silberne Färbung von Proteinen im Polyacrylamid-Gele

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