Trennung von Bakterien durch Kapsel Betrag mittels einer diskontinuierlichen Dichtegradienten
7. Januar 2019
Wir zeigen die Verwendung von diskontinuierlichen Dichtegradienten Bakterienpopulationen basierend auf Kapselproduktion zu trennen. Diese Methode wird verwendet, zu vergleichen Kapsel Betrag zwischen Kulturen, durch Mutation entstehende Variationen mit einer speziellen Kapsel Phänotyp zu isolieren oder Kapsel Regulierungsbehörden zu identifizieren. Hier beschrieben ist die Optimierung und Durchführung des Tests.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Klebsiella-Feld zu beantworten, wie z. B. welche Gene verwendet werden, um Kapsel nagen und damit verbundene Virulent zu regulieren. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass es ein Mittel bietet, um kapselförmige und nicht-capsulated Stämme zu trennen, und es kann auch für schnelle Vergleiche zwischen Stämmen der Kapselproduktion verwendet werden. Obwohl diese Methode entwickelt wurde, um Kapselregulierung in Klebsiella zu studieren, Kann es auch auf verschiedene Bakterienarten angewendet werden.
Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten haben, weil das Ausgießen der Farbverläufe und das Hinzufügen der Zellen zu den Gradienten ziemlich schwierig sein kann. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da wir die schwer zu beherrschenden Techniken zeigen und Vorschläge und Tipps bereitstellen, die dem Benutzer helfen. Um zu beginnen, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus einer Stockplatte mit einer sterilen Schleife, und impfen 10 Milliliter einer geeigneten Brühe.
Inkubieren Sie die Kultur über Nacht. Dann übertragen Sie die Kultur auf eine 15 Milliliter Tube, und Zentrifuge. Als Nächstes entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet in zwei Milliliter PBS wieder auf.
Wiederholen Sie die Zentrifugation, und entsorgen Sie den resultierenden Überstand. Dann das Pellet in zwei Milliliter PBS wieder aufhängen. Um die Verdünnungen des Dichtegradienten zu erstellen, kombinieren Sie dichtegradientenmedium mit PBS.
Dann aliquot 600 Mikroliter jeder Gradientenverdünnung in einzelne zwei Milliliter-Röhren. Nehmen Sie 100 Mikroliter Zellen mit einer 200-Mikroliter-Pipette auf und legen Sie die Pipettenspitze an der Seite des Rohres direkt unter den Meniskus eines der vielen Gradienten. Saugen Sie die Bakterienzellen sehr langsam auf den Gradienten, wobei Darauf geachtet wird, die Schnittstelle nicht zu mischen.
Zentrifugieren Sie die vorbereiteten Rohre für 10 Minuten bei 8 000 g. Danach übertragen Sie die Rohre in ein Rack, um die minimale Gradientenverdünnung zu visualisieren, die erforderlich ist, um die Zellen direkt über der Gradientenschicht zu halten. Übertragen Sie zunächst einen Milliliter der verdünntesten Dichtegradientenverdünnung in ein Fünf-Milliliter-Rundbodenrohr.
Mit einer Spritze mit einer 1,5-Zoll-Nadel nehmen Sie einen Milliliter des nächstkonzentriertsten Dichtegradienten auf. Legen Sie die Nadel an die Unterseite des Rohres und injizieren Sie den Inhalt der Spritze sehr langsam. Bei jedem Schritt des Dichtegradienten muss eine klare Schnittstelle vorhanden sein.
Wenn sich die Schichten vermischen, erreichen Sie keine saubere Trennung Ihrer Bakterien. Entfernen Sie die Nadel vorsichtig aus dem Farbverlauf, um die Schnittstelle zwischen den Gradientenverdünnungen nicht zu stören. Legen Sie dann das Rohr in ein Rack.
Fügen Sie vorsichtig 600 Mikroliter der vorbereiteten Zellen an die Spitze des Farbverlaufs in der Röhre hinzu. Legen Sie dann das Rohr in einen Rohradapter und wiegen Sie das Rohr mit dem Adapter, um die Balance zu gewährleisten. Danach den Rohradapter in einen festen Winkelrotor innerhalb einer Tischzentrifuge platzieren und das Rohr 30 Minuten lang bei 3.000 g zentrieren.
Schließlich, nach der Zentrifugation, entfernen Sie das Rohr sorgfältig, legen Sie es in ein Rack, und fotografieren Sie die Ergebnisse. In diesem Protokoll wurde die Dichtegradientenzentrifugation verwendet, um Bakterienstämme basierend auf der Art und Weise, wie viel Kapsel sie produzieren, zu trennen. Obwohl die genauen Ergebnisse von der Bakterienart abhängen, wandern die meisten Stämme an einen einzigen Ort innerhalb des Gradienten.
Die Anwendung dieser Methode auf eine bakterielle Mutante-Bibliothek sollte ein Hauptband über dem Gradienten, ein weniger dichtes Band durch die oberste Schicht des Farbverlaufs und einen kleinen akapulären Bruch am unteren Rand erzeugen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Gradientenschnittstellen nicht gemischt werden sollten und der Gradient keine Luftblasen enthalten sollte. Im Anschluss an das Verfahren sollten Validierungsmethoden wie der Uronsäuretest oder die Mikroskopie durchgeführt werden, um Kapselmengen zu untersuchen.
Dies ist besonders wichtig, wenn diese Technik für neue Stämme verwendet wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Gefahrengruppen 2-Erregern gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten stets Vorsichtsmaßnahmen wie Korrekturschutzausrüstung, Einhaltung von Risikobewertungen und ordnungsgemäße Entsorgung von Kulturen getroffen werden.
Übersicht
Dieser Artikel zeigt die Verwendung von diskontinuierlichen Dichtegradienten zur Trennung bakterieller Populationen basierend auf Kapselproduktion. Die Methode ermöglicht den Vergleich von Kapselmengen zwischen Kulturen, die Isolierung von Mutanten mit spezifischen Kapselphänotypen und die Identifizierung von Kapselregulatoren.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrobiologie
- Zellbiologie
- Pathogenenforschung
Hintergrund
- Die Kapselproduktion in Bakterien ist mit Virulenz verbunden.
- Das Verständnis der Kapselregulation kann Behandlungsstrategien beeinflussen.
- Diskontinuierliche Dichtegradienten bieten eine physikalische Trennmethode.
- Diese Technik kann auf verschiedene Bakterienarten angewendet werden.
Zweck der Studie
- Optimierung einer Methode zur Trennung von gekapselten und nicht gekapselten bakteriellen Stämmen.
- Erleichterung schneller Vergleiche der Kapselproduktion zwischen verschiedenen Stämmen.
- Visuelle Demonstration der Technik für ein besseres Verständnis.
Verwendete Methoden
- Impfung bakterieller Kulturen und Übernachtbebrütung.
- Zentrifugation und erneutes Suspendieren bakterieller Pellets in PBS.
- Vorbereitung von Dichtegradientenverdünnungen und sorgfältiges Schichten der Zellen.
- Zentrifugation zur Erreichung der Trennung basierend auf Kapselproduktion.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Trennung bakterieller Stämme basierend auf Kapselproduktionsniveaus.
- Identifizierung von unterschiedlichen Bändern, die gekapselten und akapselären Fraktionen entsprechen.
- Validierungsmethoden wie uronsäure-Assays bestätigten Kapselmengen.
- Demonstrierte Bedeutung der Aufrechterhaltung von Gradientengrenzflächen für eine saubere Trennung.
Schlussfolgerungen
- Die Methode ist effektiv für die Untersuchung der Kapselregulation in Klebsiella und anderen Bakterien.
- Visuelle Demonstrationen sind entscheidend für die Beherrschung der Technik.
- Sicherheitsvorkehrungen sind wesentlich bei der Arbeit mit pathogenen Stämmen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to physically isolate bacterial subpopulations based on capsule expression, a key virulence factor influencing immune evasion and therapeutic resistance. By providing a semi-quantitative separation tool, it supports target validation and mechanistic de-risking in antimicrobial and vaccine development programs. The approach enhances predictive confidence when evaluating capsule-related phenotypes across strain libraries or mutant collections.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of capsule biosynthesis pathways by separating high- and low-producing strains for downstream genetic analysis.
- Operational Value: Facilitates rapid phenotypic screening of mutant libraries to identify regulators of capsule production.
- Translational Value: Supports isolation of acapsular or hypercapsular mutants for use in virulence modeling and antigen selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates fractionated populations suitable for quantitative capsule assays such as uronic acid measurement.
- Operational Value: Creates standardized, reproducible inputs for high-throughput screening of compounds or genetic perturbations affecting capsule expression.
- Assay Readiness: Produces purified capsulated fractions that improve signal-to-noise ratios in downstream functional or immunological assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links genotype to phenotype by enabling correlation of transposon insertion sites with capsule levels in sequencing workflows.
- Operational Value: Provides a scalable method to generate isogenic strains with defined capsule amounts for pharmacokinetic or efficacy studies.
- Translational Continuity: Supports risk-adjusted advancement by allowing teams to de-risk targets based on validated capsule modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling progression from phenotypic screening to target identification and preclinical validation, particularly in anti-infective programs where capsule is a determinant of pathogenicity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing physical separation of strains to clarify the role of capsule in immune evasion or stress resistance.
- Screening: Enables assay-ready fraction collection for quantitative comparison of capsule production across strain variants or treatment conditions.
- Analytics: Generates distinct, visual bands that serve as semi-quantitative readouts for sorting and further analytical validation.
- Translational Research: Connects discovery-phase capsule modulation to preclinical models by providing defined phenotypic strains for infection or challenge studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for capsule phenotyping applicable across multiple bacterial targets in a portfolio.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in capsule-linked virulence by enabling direct phenotype-genotype correlation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization in capsule analysis compared to bulk culture measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target selection by providing empirical data on capsule modulation efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antimicrobial or vaccine targets based on validated capsule phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture handling and density gradient preparation.
- Depends on access to centrifugation equipment capable of precise speed and temperature control.
- Necessitates careful technique to avoid mixing gradient layers or introducing air bubbles during setup.
- Must be adapted for each bacterial species through optimization of gradient concentrations and centrifugation parameters.
- Relies on post-separation validation methods such as biochemical assays or microscopy to confirm capsule levels in fractions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:48
Preparation of Bacterial Strains of Mutant Libraries
1:40
Preparation of Gradient Dilutions and Mini-gradient Test
2:39
Preparation of Discontinuous Density Gradients
3:39
Adding Prepared Cells to Gradients and Separation by Centrifuge
4:30
Results: Density Gradient Centrifugation Used to Separate Bacterial Strains Based on Capsule Production
5:10
Conclusion
