Name: Visualisierung von 3D weißen Fettgewebe Schachts ganz-Mount Färbung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Lernen Sie die Ganzpräparat-Färbung zur 3D-Visualisierung von weißem Fettgewebe. Diese Methode bewahrt die ursprüngliche Gewebearchitektur und ermöglicht Studien zu Stoffwechselbedingungen wie Fasten und Fettleibigkeit.

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Diese Arbeit wurde finanziert durch Zuschüsse aus den Naturwissenschaften und Engineering Research Council (NSERC) von Kanada, Pilot und Feasibility Study Grant Banting & Best Diabetes Zentrum (BBDC), der SickKids-Gründerfonds, H-K. S., Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) durch die National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunft planen, J-r.k.

Alle experimentellen Tier Protokolle stimmten die Animal Care Committee des Center für Phänogenomik (TCP) nach den Standards des Canadian Council on Animal Care entsprach. Mäuse wurden auf 12 h hell/dunkel-Zyklen und mit freiem Zugang zu Wasser und Nahrung zur Verfügung gestellt. 7 Monat dienten alte C57BL/6J männliche Mäuse im ganzen-Mount Färbung Experiment.
Hinweis: Die Abschnitte 1 bis 2 sind in chronologischer Reihenfolge mit Abschnitt 3 wird ein optionaler Schritt direkt nach Abschnitt 1. Abschnitt 4 kann durchgeführt werden, um nach der Fertigstellung des Abschnitts 2 Adipocyte Größe und Blutgefäß Dichte analysieren.
1. Vorbereitung und Gewebe isoliert
<ol><li>Bereiten Sie frische 1 % Paraformaldehyd (PFA) in 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für Gewebe Fixierung verdünnt. Bereiten Sie 0,3 % nichtionische Tenside in 1 X PBS verdünnt (nachstehend PBS-0,3T) für nachfolgende Gewebe Waschschritte. Hinweis: Für jedes Gewebe, bereiten Sie etwa 1,5 mL 1 % PFA um vollständiges Eintauchen zu gewährleisten. Fixierung-Volumen kann erhöht oder verringert je nach Gewebe Größe. Achtung: Dieser Schritt ist gefährlich, wie PFA korrosiven und toxischen. Persönliche Schutzausrüstung tragen (z. B. Nitril-Handschuhe, Kittel, Schuhe, Schutzbrille) und Griff in einer Dampfhaube.</li>
	<li>Tiere nach einer zugelassenen Verfahren (z. B., zervikale Dislokation und/oder Kohlendioxid Erstickung) einschläfern. Ohne Verzögerung sezieren Sie die gewünschten Fettgewebe-Depots (z.B., leisten-weißen Fettgewebe oder Perigonadal weißen Fettgewebe)18.</li>
	<li>Mit Dissektion Schere, schneiden Sie das Gewebe auf einem 100 x 15 mm2 Petrischale in Stücke etwa 0,5 – 1 cm groß, und tauche sie ein in Mikrozentrifugenröhrchen gefüllt mit 1 % PFA. Halten Sie auf dem Eis.</li>
</ol>2. gesamte-Mount Färbung der weißen Fettgewebe
<ol><li>Nach Dissektion abgeschlossen ist, bewegen sich die Gewebeproben in 1 % PFA aus dem Eis auf Raumtemperatur (RT) für 1 h, und übertragen Sie dann das Gewebe auf ein 12 oder 24-Well Kultur Zellplatte schneller waschen.</li>
	<li>Waschen Sie das Gewebe mit PBS-0,3T, 3 Mal für 5 min jeweils in RT auf einen Shaker bei 22 ° c, mit 20 – 25 kippt pro min als die Geschwindigkeit gekippt. Hinweis: Verwenden Sie dieser Neigung und Geschwindigkeit für alle weiteren Schritte, die die Verwendung von einem Boston-Shaker. Hinweis: Wenn eine mehrfarbige Reporter Mauslinie wie mT/mG und zusätzlichen Antikörper Färbung ist nicht notwendig, das Gewebe ist nach Schritt 2.2 bereit für die Mikroskopie.</li>
	<li>Hinzufügen von 0,5 – 1 mL blockierende Puffer (5 % tierische Seren in PBS verdünnt-0,3T). Setzen Sie die Platte auf den Shaker und 1 h bei RT inkubieren</li>
	<li>Aspirieren Sie die blockierende Lösung und fügen Sie Primärantikörper in PBS verdünnt-0,3T mit 1 % tierische Seren.</li>
	<li>Ort der Platte auf einen Shaker bei 4 ° C über Nacht.</li>
	<li>Am nächsten Tag waschen das Gewebe mit PBS-0,3T 3 Mal für 5 Minuten in RT</li>
	<li>Verwenden Sie geeignete sekundären Antikörper in PBS verdünnt-0,3T. Hinzufügen von 0,5 – 1 mL Sekundärantikörper Lösungen in jede Vertiefung. Die Platte in Alufolie wickeln und es auf einen Shaker 1 Stunde bei RT inkubieren Hinweis: Verdünnen der Sekundärantikörper im Dunkeln, Immunofluoreszenz zu verhindern.</li>
	<li>Nach der Inkubation der Sekundärantikörper, waschen mit PBS-0,3T zweimal für 5 min, jeweils in RT Bild Proben, wenn ein neutrales Lipid Fleck nicht erwünscht ist. Visualisierung von Lipid-Tropfen ist erforderlich mit neutral Lipid Fleck, mit 1 X PBS (ohne nicht-ionische Tenside) zweimal, für 5 min waschen.</li>
	<li>Nach den Waschschritten mit den neutralen Lipid Fleck verdünnt mit 1:1500 Verdünnungsfaktor mit 1 X PBS-Puffer für 30 min in RT inkubieren Die Gewebe sind nun bereit für die Mikroskopie. Für zukünftige Aufnahmen speicherbar Gewebe in dieser Lösung bei 4 ° C. Hinweis: Bildqualität verringert sich im Laufe der Zeit; Daher ist die beste Zeit für die Bildgebung innerhalb von 1-2 Tagen.</li>
	<li>Mit Pinzette, legen Sie das Gewebe flach auf einem 24 x 60 mm ² Glas Deckgläschen und legen Sie es auf einem umgekehrten konfokale Laser-Mikroskop-System.</li>
	<li>Nach Wunsch Färbung der Kerne mit DAPI Tropfen Sie 1 – 2 Eindeckmedium mit DAPI um völlig Eintauchen des Gewebes und Austrocknen verhindert.</li>
	<li>Um Bilder der gesamten-Mount gefärbten Gewebe bei mehreren fokale Ebenen zu erhalten, führen Sie Z-Stapel von 100 – 150 μm eingehend mit 4 – 6 μm Schrittweite auf die gewünschte Vergrößerung.</li>
</ol>(3) Gewebe Clearing- und Immunolabeling mit iDISCO +
Hinweis: Dieses Protokoll basiert auf bereits veröffentlichte Verfahren9,10,19.
<ol><li>Fixierung und Methanol Vorbehandlung<ol>
<li>Inkubieren Sie das Gewebe in 4 % PFA mit 1 X PBS-Puffer bei 4° C über Nacht in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen verdünnt. Hinweis: Lassen Sie das Gewebe in den 2 mL Röhrchen für die folgenden Behandlungen bis Bildgebung.</li>
		<li>Waschen Sie am nächsten Tag, das Gewebe in 1 X PBS dreimal, für 1 Stunde auf einem Schüttler bei RT Hinweis: Dieser Schritt kann ein Anhalten Punkt zu verlassen die Probe über Nacht bei RT oder 4 ° c sein.</li>
		<li>Entwässern Sie das Gewebe bei RT in 20 %, 40 %, 60 % und 80 % Methanol, anschließend 1 h. Entwässern in 100 % Methanol bei RT für 1 Stunde, dann übertragen Sie das Gewebe auf frische 100 % Methanol und inkubieren Sie bei 4 C für 1 h. Hinweis: Verdünnen Sie Methanol in destilliertem Wasser. Während Methanol Inkubation gibt es keine Notwendigkeit, Proben auf einem Boston-Shaker zu setzen, solange die Gewebeproben eingetaucht sind. Achtung: Dieser Schritt ist gefährlich, da Methanol giftig ist. Es ist leicht entzündlich auf offenem Feuer. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (z. B. Nitril-Handschuhe, Laborkittel, Schutzbrille) und in einer Dampfhaube behandeln. Das Methanol vom Zündung und in eine brennbare Sicherheitsschrank zu speichern.</li>
		<li>Bleichen von Geweben mit 5 % Wasserstoffperoxid (H2O2; 1 Volumen von 30 % H2O2 in 5 Bänden von 100 % Methanol verdünnt) über Nacht bei 4 ° c Achtung: 30 % Wasserstoffperoxid ist sehr gefährlich bei Haut- und Augenkontakt. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (z. B. Nitril-Handschuhe, Laborkittel, Schutzbrille) und in einer Dampfhaube behandeln.</li>
		<li>Rehydrieren Sie Gewebe bei RT 80 %, 60 %, 40 % und 20 % Methanol und 1 X PBS, anschließend für 1 Stunde.</li>
		<li>Waschen Sie mit 0,2 % nichtionische Tenside in 1 X PBS verdünnt zweimal für jeweils 1 h auf einem Schüttler bei RT</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunolabeling Hinweis: Füllen Sie die Lösung in jedem Schritt verwendet, um Gewebe Oxidation zu verhindern, sobald Immunolabeling beginnt bis Clearing abgeschlossen ist, das Gewebe an die Spitze des Rohres mit 2 mL-Röhren.<ol>
<li>Permeabilize der Gewebe durch Inkubation sie in einer Lösung aus 1 X PBS, 0,2 % nichtionische Tenside, 20 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und 0,3 M Glycin bei 37 ° C auf eine inkubierten Tabletop Orbitalschüttler für 2 Tage. Hinweis: Die maximale Inkubationszeit für 37 ° C Permeabilisierung Schritt beträgt 2 Tage.</li>
		<li>Blockieren Sie das Gewebe in einer Lösung aus 1 x PBS, 0,2 % nichtionische Tenside, 10 % DMSO, 5 % Esel Serum und 1 % Fc Block bei 37 ° C auf eine inkubierten Tabletop Orbitalschüttler für 2 Tage. Hinweis: Die maximale Inkubationszeit für die Blockierungsschritt beträgt 2 Tage.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Gewebe in primären Antikörper von Interesse in einer Lösung aus 1 X PBS, 0,2 % Polysorbat 20, 10 µg/mL Heparin, 5 % DMSO und 5 % Esel Serum bei 37 ° C auf eine inkubierten Tabletop Orbitalschüttler für 4 Tage.</li>
		<li>Waschen Sie mit 1 x PBS, 0,2 % Polysorbat 20 und 10 µg/mL Heparin auf einem Schüttler bei RT fünf Mal, jeweils für 1 h. Hinweis: Dieser Schritt kann ein Pausenpunkt Proben über Nacht in RT verlassen sein.</li>
		<li>Inkubieren Gewebe mit sekundären Antikörper in einer Lösung aus 1 X PBS, 0,2 % Polysorbat 20, 10 µg/mL Heparin und 5 % Esel Serum bei 37 ° C auf eine Tischplatte Orbitalschüttler für 4 Tage. Hinweis: Ab Schritt 3.2.5 müssen alle Proben mit Alu-Folie, Immunofluoreszenz Sekundärantikörper zu verhindern gewickelt werden.</li>
		<li>Waschen Sie Gewebe in einer Lösung aus 1 x PBS, 0,2 % Polysorbat 20 und 10 µg/mL Heparin auf einem Shaker in RT fünfmal, 2 h. Hinweis: Dieser Schritt kann ein Anhalten Punkt zu Proben über Nacht bei RT verlassen sein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gewebe, die Verrechnung von weißen Fettgewebe und Volumen Bildgebung<ol>
<li>In 2 mL Röhrchen durch Inkubation bei 20 %, 40 %, 60 % und 80 % Methanol, danach jeweils für 1 Stunde bei RT enthaltenen Gewebe zu entwässern Dann pausiert die Proben in 100 % Methanol zweimal bei RT Hinweis: Dieser Schritt kann ein Anhalten Punkt zu verlassen Ihre Proben in 100 % Methanol über Nacht bei RT sein.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Gewebe mit einer Mischung aus 2 Bänden von DCM zu 1 Volumen von Methanol für 3 h bei RT auf einem Boston-Shaker. Hinweis: DCM ist flüchtig. Stellen Sie sicher, dass die Rohre dicht sind, um Verdunstung zu verhindern. Achtung: Dieser Schritt ist gefährlich. DCM ist giftig beim Einatmen. Längerer Exposition kann Verätzungen führen. Persönlichen Schutzausrüstung (z. B. Nitril-Handschuhe, Kittel, Schuhe, Schutzbrille) zu tragen. Verwenden einer Abzugshaube.</li>
		<li>Inkubieren Sie Gewebe 100 % DCM zweimal, für 15 min auf einen Shaker bei RT</li>
		<li>In 100 % inkubieren DBE in RT bis Bildgebung und zur Aufbewahrung der Probe. Invertieren Sie vor Bildgebung die Röhren mehrmals um die Lösungen zu mischen. Hinweis: Füllen Sie komplett Röhren mit DBE gegen Oxidation, die erfolglose Gewebe clearing führen kann. Schütteln Sie die Rohre nicht während der Inkubation DBE. Achtung: Dieser Schritt ist gefährlich. DBE ist giftig. Es kann Reizungen der Augen und Haut verursachen. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (z. B. Nitril-Handschuhe, Laborkittel, Schutzbrille) und in einer Dampfhaube behandeln.</li>
		<li>Bild der gesamten Gewebeprobe mit einem Lichtmikroskop, der der Brechungsindex des organischen Lösungsmittel DBE übereinstimmt. Führen Sie bei einer gewünschten Vergrößerung und die Schrittweite für das ganze Gewebe Z-Stapeln.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Beispiele der Datenanalyse von ganz-Mount gefärbten Gewebe Bilder mit ImageJ
Hinweis: Siehe https://imageJ.nih.gov/ij/download.html für Download und Installation Anweisungen.
<ol><li>Quantifizierung der Blutgefäß-Dichte (ergänzende Abbildung 2)<ol>
<li>Importieren Sie die gespeicherten Bilder nur der Kanal mit Blutgefäß Immunostaining auf ImageJ. Hinweis: Die Bilder zur Quantifizierung sollten in Bezug auf Färbeverfahren und Bild Erwerb Zustand übereinstimmen. Identische Reagenzien sollten verwendet werden. Die Belichtungszeit sollte Intensität und Vergrößerung auch in den bildgebenden Verfahren20entsprechen.</li>
		<li>Wandeln Sie das Bildfarbe in schwarz/weiß für Blutgefäß Dichte Quantifizierung. Wählen Sie dazu unter der Registerkarte "Bild" der Befehl "Anpassen" , dann die Option "Farbschwelle" . In die "Schwelle Color" Feld anzuzeigen, wählen Sie "Dark Background"20 und "B & W" unter "Schwellenwert Farbe".</li>
		<li>Um den Prozentsatz der Fläche von Blutgefäß Signal Hintergrund zu messen, die Registerkarte "Analyze" , dann den Befehl "analysieren Partikel" . Wählen Sie unter dem Display "analysiertTeilchen" die Optionen "klare Ergebnisse" und "Zusammenfassen" . Klicken Sie auf "OK".</li>
		<li>Kopieren Sie und fügen Sie den Wert des Bereichs Prozentsatz unter der Registerkarte "Zusammenfassung" in eine Tabellenkalkulation für die Analyse. Der Anteil der Fläche zeigt die Blutgefäß-Dichte. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1–4.3.4 für jedes einzelne Bild.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifizierung des Adipocyte Größe21 (ergänzende Abbildung 3)<ol>
<li>Importieren Sie die gespeicherten Bilder von Adipozyten auf ImageJ.</li>
		<li>Um die Skalierung des Bildes einzustellen, Messen Sie die Länge der Skala in Pixel durch eine Linie, die Waage mit einem bekannten Abstand auf das Bild mit dem geradlinigen Auswahlwerkzeug nachzeichnen. Wählen Sie auf der Registerkarte "Analyze" "Set Scale" . Die Entfernung der Linie, die vor verfolgt wurde wird automatisch in Pixel berechnet.</li>
		<li>Feld "Skalierung festlegen" Anzeige erscheint. Geben Sie die bekannten Abstand und Einheit der Länge. Wählen Sie "Global" zu den Maßstab für alle importierten Bilder anwenden, und klicken Sie auf "OK".</li>
		<li>Wählen Sie Bereich als die Methode der Messung unter der Registerkarte "Analyze" "wählen Sie " Set Messungen " . Es erscheint eine Liste verschiedener Optionen für Messungen. Wählen Sie die Option "Bereich" und klicken Sie auf "OK".</li>
		<li>Mit der Freihand-Auswahl-Werkzeug zeichnen Sie den Umfang der einzelnen Adipocyte von Interesse. Auf der Registerkarte "Analyze" wählen Sie den Befehl "Messen (Strg + M)" , und das Gebiet der Adipocyte erscheint. Wiederholen Sie diesen Vorgang für andere Adipozyten im Bild. Hinweis: Um genaue Messungen zu gewährleisten, verwenden Sie mehrere Bilder für die Quantifizierung.</li>
		<li>Kopieren Sie und fügen Sie die Flächenmaße in eine Kalkulationstabelle zur weiteren Analyse der Daten ein.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Obwohl herkömmliche Techniken wie Histologie und Cryosection Vorteile für die Beobachtung von intrazellulären Struktur bieten, bietet ganz-Mount Färbung eine andere Perspektive in Fettgewebe Forschung, die 3D Visualisierung der zellulären ermöglicht Architektur der gering verarbeitete Gewebe.
Um erfolgreich durchzuführen, ganz-Mount zu beflecken, sollten folgende Hinweise berücksichtigt werden. Verschiedenen Fettgewebe-Depots können verschiedene Immunostaining Ergebnissen führen; Daher sollte ...

Fettgewebe ist ein wesentliches Organ zur Speicherung von Energie und zeichnet sich durch dynamische Umbau und fast unbegrenzte Erweiterung1. Neben Energie-Homöostase spielt Fettgewebe auch eine wesentliche Rolle in Hormonausschüttung von mehr als 50 Adipokine Ganzkörper-metabolische Funktion2zu modulieren. Fettgewebe hat eine vielfältige Architektur, bestehend aus verschiedenen Zelltypen, einschließlich Reifen Adipozyten, Fibroblasten, Endothelzellen, Immunzellen und Adipocyte Progenitor Zellen3. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Fettleibigkeit und anderen Stoffwechselstörungen wesentlich ändern können, Fettgewebe Funktion und ihrer Mikroumgebung, die beinhaltet, aber beschränkt sich nicht auf die Erweiterung der Adipozyten, Infiltration von Entzündungszellen (z.B. Makrophagen), und vaskuläre Dysfunktion3.
Konventionelle morphologische Techniken wie Histologie und Kryoschneiden demonstrieren mehrere Einschränkungen bei der Untersuchung adipöser Biologie wie lange chemische Verarbeitungsschritte, Gewebe schrumpfen und Struktur Verzerrung3führen kann, 4. Darüber hinaus sind diese 2D Techniken nicht ausreicht, um interzelluläre Wechselwirkungen von verschiedenen Zelltypen ausgeübt zu beobachten, wie die Abschnitte bezogen auf das gesamte Gewebe3kleinere Regionen beschränkt sind. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der Fluoreszenz-Bildgebung, ganze-Mount Färbung nicht weitere invasive Schritte, z. B. einbetten, Schnitt und Dehydrierung erfordert; so, dies vermeidet das Problem der abnehmenden Antikörperbesonderheit. Als solches ist es eine einfache und effiziente Methode zur bildgebenden Fettgewebe mit besseren Schutz der Adipocyte Morphologie und insgesamt Fettgewebe Struktur5. Daher ganz-Mount Färbung wie eine schnelle und kostengünstige Immunolabeling-Technik gegründet wurde, um Fettgewebe 3D-Architektur1,6,7,8zu erhalten.
Trotz der Erhaltung der Fettgewebe Morphologie mit Nutzung der gesamten-Mount Färbung ist diese Technik jedoch noch nicht in der Lage, innere Strukturen unter der Lipid-Oberfläche des Gewebes sichtbar zu machen. Mehrere aktuelle Studien9,10 entstanden Gewebe clearing Techniken kombiniert mit ganz-Mount Immunolabeling1,6 , um umfassende 3D Visualisierung im Fettgewebe zu ermöglichen. Insbesondere wurden Dichte neuronale und Gefäßsystem Netze in den letzten Studien9,10,11,12 mit 3D-Volumen Bildgebung visualisiert. In der Tat ist es wichtig, seine Biologie zu studieren, studieren die neuronale und vaskuläre Plastizität des Fettgewebes unter verschiedenen physiologischen Bedingungen. Immunolabeling-fähigen dreidimensionale Bildgebung Lösungsmittel geclearte Organe (iDISCO +) Gewebe Clearing ist ein Prozess, bestehend aus Methanol Vorbehandlung, Immunolabeling, und das clearing von Gewebe Undurchsichtigkeit mit organischen chemischen Reagenzien Dichlormethan (DCM ) und Dibenzyl Äther (DBE)13,14. Durch das Fettgewebe völlig transparent zu machen, erhalten Sie eine genauere Darstellung der Anatomie des Gewebes wie Blutgefäße und neuronalen Fasern9,10. IDISCO + hat Vorteile, es kompatibel mit verschiedenen Antikörpern und fluoreszierende Reporter11,14 ist, und sie Erfolg in mehreren Organen und sogar Embryoes14 hat. Die wichtigste Einschränkung ist jedoch eine lange Inkubationszeit, in der 18 bis 20 Tagen erforderlich sind, um das gesamte Experiment zu vervollständigen.
Eine weitere wichtige Anwendung der gesamten-Mount Färbung ist die Visualisierung der Zelle Schicksal in Kombination mit einer Linie-Tracing-System. Linie die Ablaufverfolgung ist die Kennzeichnung eines bestimmten Gens/Markers in eine Zelle, die an alle Tochterzellen weitergegeben werden kann und über Zeit15konserviert ist. Als solches ist es ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um das Schicksal einer Zelle Nachkommen15. Seit den 1990er Jahren das Cre-LoxP rekombinante System geworden ein leistungsfähiger Ansatz für die Linie Ablaufverfolgung in lebenden Organismen15. Wenn eine Mauslinie, die Cre, ein DNA-Enzym Rekombinase, drückt mit einer anderen Maus mit dem Ausdruck eines Reporters, der neben einer LoxP-STOP-LoxP-Sequenz ist überschritten wird, ist das Reporter-Protein ausgedrückt15.
Für das gesamte-Mount zu beflecken, eignet sich die Verwendung von fluoreszierenden multicolor Reporter für imaging von Fettgewebe, denn es minimale Störungen mit intrazellulären Aktivitäten des Adipocyte16 ermöglicht. Traditionelle Reporter Fleck jedoch in der Regel Zytoplasma, macht es schwierig, die Abstammung des weißen Adipozyten, verfolgen die zytoplasmatischen Inhalt17beschränkt haben. Um dieses Problem zu überwinden, ist die Verwendung von fluoreszierenden TdTomato/Membran Membrane-springen eGFP (mT/mG) Reporter Marker ein ideales Werkzeug. Membran-bezogenen TdTomato drückt sich in Cre-negativen Zellen18. Auf Cre Exzision tritt eine Umstellung auf die Expression von Membran-gezielte eGFP, eignet sich dieser Reporter für die Verfolgung der Linie Adipocyte Stammväter17,18 (Ergänzende Abbildung 1).
Dieses Papier soll vorsehen, dass ein detailliertes Protokoll vollständig-hängen Färbung und zeigen, wie es mit anderen Techniken zur Untersuchung der Entwicklung und Physiologie des Fettgewebes kombiniert werden kann. Zwei Beispiele für Anwendungen, die in diesem Protokoll beschrieben sind seine Verwendung mit 1) multicolor Reporter Mauslinien unterschiedlicher Herkunft von Adipozyten und (2) Gewebe löschen um weitere visualisieren die neuronale Arborization im weißen Fettgewebe (WAT) zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>LipidTox</td><td>Life Technologies</td><td>H34477</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1 Primärantikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z(CH)</td><td></td></tr><tr><td>TH (Tyrosinhydroxylase) Primärantikörper</td><td>Millipore</td><td>AB152, AB1542</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Färbung</td><td>BD Pharmingen</td><td>564907</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R Konfokalmikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Konfokales Mikroskop</td></tr><tr><td>Ultramikroskop I</td><td>LaVision BioTec</td><td></td><td>Light Blattbild Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Sekundärantikörper</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>Wellenlängen 488, 594 und 647 verwendet</td></tr><tr><td>Gereinigte Ratte Anti-Maus CD16/CD32</td><td>BioSciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzylether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A452-1</td><td></td></tr><tr><td>30% Wasserstoffperoxid</td><td>BIO BASIC CANADA INC</td><td>HC4060</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J7126</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Lektin Kit I, Fluorescein gekennzeichnet mit</td><td>VECTOR</td><td>LABORATORIES FLK-2100</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA497GA</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hard Set Eindeckmedium mit DAPI</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tierisches Serum (Ziege, Esel)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung von 3d weißen fettgewebe schachts ganz-mount färbung

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Fettgewebe ist ein wichtiges Stoffwechselorgan mit hoher Plastizität und reagieren auf Reize aus der Umwelt und Nährstoff-Status. Als solche haben verschiedene Techniken entwickelt, um die Morphologie und Biologie des Fettgewebes zu studieren. Allerdings sind herkömmliche Visualisierungsmethoden beschränkt sich auf die Untersuchung des Gewebes in 2D-Schnitte, Nichtbeachtung die 3D Architektur des gesamten Organs zu erfassen. Hier präsentieren wir Ihnen ganze-Mount Färbung, eine immunhistochemische Methode, die intakt Fettgewebe Morphologie mit minimalen Bearbeitungsschritten bewahrt. Daher bestehen die Strukturen der Adipozyten und anderen zellulären Komponenten ohne Verzerrung, die repräsentativsten 3D-Visualisierung des Gewebes zu erreichen. Darüber hinaus ganz-Mount Färbung mit Abstammung-Tracing-Methoden zur Zelle Schicksal Entscheidungen bestimmen kombinierbar. Diese Technik hat jedoch einige Einschränkungen, die korrekte Information über tiefere Teile des Fettgewebes. Um diese Einschränkung zu umgehen, ganz-Mount Färbung weiter kombinierbar mit Gewebe clearing-Techniken, um die Undurchsichtigkeit der Gewebe zu entfernen und ermöglichen vollständige Visualisierung der gesamten Fettgewebe Anatomie mit Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie. Daher können eine höhere Auflösung und eine genauere Darstellung der Fettgewebe Strukturen mit der Kombination dieser Techniken erfasst werden.

Aufgrund der Fragilität des Fettgewebes führt Methoden mit mehreren Verarbeitungsschritten und schneiden zu Entstellung von Fettgewebe Morphologie3 (Abbildung 1A). Jedoch kann ganze-Mount Färbung die Morphologie der Adipozyten gewährleisten genaue Interpretation der Ergebnisse (Abb. 1 b) bewahren.
Übermäßige Fixierung des Fettgewebes führt zu Fixiermittel-induzierte Autofluoreszenz. Wie in ...

Der Schwerpunkt der vorliegenden Studie soll die gesamte-Mount Immunostaining und Visualisierung Technik als eine ideale Methode für die 3D Darstellung von Fettgewebe Architektur und zellulären Komponente zeigen.

Visualisierung von 3D weißen Fettgewebe Schachts ganz-Mount Färbung

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Fettbiologie zu beantworten, wie z. B. wie sich interzelluläre Wechselwirkungen und Fettgewebephysiologie bei verschiedenen Stoffwechselbedingungen wie Fasten und Adipositas verändern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die ursprüngliche Fett-3D-Struktur optimal bewahrt und langwierige Verarbeitungsschritte vermeidet, die normalerweise für die konventionelle Immunhistochemie erforderlich sind. Obwohl diese Methode Einblick in die Struktur des Fettgewebes geben kann, kann es auch auf andere Organsysteme, wie das Nervensystem, durch Vollmontage Färbung des Gehirns angewendet werden.Im Allgemeinen, Personen neu zu dieser Methode wird wegen der Schwierigkeiten bei der Gewinnung von Eigentum Gewebestellen kämpfen, die richtige Fixierungszeit zu finden, und die optimale Antikörperkonzentrationen. Nachdem die Zerlegung abgeschlossen ist, übertragen Sie die Schale mit den Gewebeproben in 1%Paraformaldehyd vom Eis auf Raumtemperatur für eine Stunde. Dann übertragen Sie das Gewebe entweder auf eine 12 oder 24-Well-Zell-Kulturplatte für eine schnellere Wäsche.Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die vollwertige Färbung sofort nach der Zerlegung beginnen muss und dass es keine Pausenpunkte zwischen jedem Schritt gibt. Waschen Sie das Gewebe mit PBS-0.3T auf einem Shaker, der bei 22 Grad gekippt ist, mit einer Geschwindigkeit zwischen 20 und 25 Neigungen pro Minute bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Wiederholen Sie diese Wäsche zwei weitere Male.Fügen Sie danach etwa 0,5 bis einen Milliliter Sperrpuffer hinzu, der 5% Tierserum enthält. Inkubieren Sie die Platte auf einem Shaker unter den vorherigen Bedingungen für eine Stunde. Aspirieren Sie die Blockierende Lösung, und fügen Sie auf Milliliter der primären Antikörper in PBS-0.3T mit 1%Tierserum zu jedem Brunnen verdünnt.Inkubieren Sie die Platte über Nacht auf einem Shaker bei vier Grad Celsius mit einer Neigung von 22 Grad und einer Geschwindigkeit von 20 bis 25 Neigungen pro Minute. Verwenden Sie am nächsten Tag PBS-0.3T, um das Gewebe bei Raumtemperatur fünf Minuten lang zu waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche zwei weitere Male.Fügen Sie dann zwischen 0,5 und einem Milliliter geeigneter und verdünnter Sekundärantikörperlösungen zu jedem Brunnen hinzu. Die Platte in Aluminiumfolie wickeln und eine Stunde lang auf einem Shaker bei Raumtemperatur bebrüten. Danach die Platte zweimal mit PBS-0.3T bei Raumtemperatur für fünf Minuten pro Wäsche waschen.Wenn während des neutralen Lipidflecks eine Visualisierung von Flüssigkeitströpfchen erforderlich ist, waschen Sie sie zweimal mit 1x PBS mit jeder Fünf-Minuten-Waschzeit. Fügen Sie den neutralen Lipidfleck in PBS verdünnt, und inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Um mit der Bildgebung zu beginnen, legen Sie das Gewebe mit Zangen flach auf einen 24 mal 60 Millimeter großen Glasdeckel.Wenn Eine Kernfärbung mit DAPI gewünscht wird, fügen Sie ein bis zwei Tropfen eines Montagemediums hinzu, das DAPI enthält, um das Gewebe vollständig zu versenken und zu verhindern, dass es austrocknet. Platzieren Sie dann das Dia auf einem invertierten konfokalen Lasermikroskopsystem. Um Bilder von vollwertigem Gebeikgewebe an mehreren Brennebenen zu erhalten, führen Sie Z-Stacks von 100 bis 150 Mikrometern Tiefe mit einer Schrittgröße von vier bis sechs Mikrometern bei der gewünschten Vergrößerung durch.In dieser Studie wird die Vollfärbung verwendet, um die Fettgewebearchitektur zu erhalten. Im Gegensatz zu Methoden, die mehrere Verarbeitungsschritte und Schnitte beinhalten, die zu einer Entstellung der Fettgewebemorphologie führen können, kann die Vollmontage-Färbemethode die Morphologie von Adipozyten erhalten und so die Genauigkeit bei der Interpretation der Ergebnisse gewährleisten. Die Überfixierung des Fettgewebes führt zu fixativ-induzierter Fluoreszenz, die durch überlappende identische Regionen, wie z.B. in den hier gesehenen Tyrosinhydroxylase- und PECAM-1-Signalen, angezeigt werden kann.Richtig fixierte, vollmontierte Fleckenproben zeigen jedoch getrennte und unterschiedliche Signale, was darauf hinweist, dass diese Signale keine Autofluoreszenz sind. Die Bildgebung von vollwertigem gebeiztem Fettgewebe ermöglicht die Quantifizierung morphologischer Veränderungen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen. Insbesondere ist Fettgewebe stark vaskularisiert, was bei schnellen Veränderungen des Energieniveaus wichtig ist, um die metabolische Homöostase zu vermitteln.Zum Beispiel zeigen C57 schwarze 6J-Mäuse, die 24 Stunden Fasten durchlaufen, eine deutlich kleinere Adipozytengröße, die auf Lipolyse hinweist, und einen Trend zu erhöhter Blutgefäßdichte im Vergleich zu kontinuierlich gefütterten Mäusen. Durch das Löschen von Fettgeweben mit iDISCO+ können Fettgewebe optisch transparent werden. Die Immunolabelierung von Fettgewebe, das durch die Gewebeklärung gegangen ist, zeigt eine viel dichtere neuronale Arborisierung im Vergleich zu der, die bei der Vollfärbung ohne Gewebeklärung bei der gleichen Vergrößerung beobachtet wurde.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Ihre Proben nicht mehr als eine Stunde bei Raumtemperatur in PFA zu überfixieren, da dies andernfalls die Hintergrundautofluoreszenz erhöht. Diese Fixierungszeit kann jedoch verlängert werden, wenn die Proben auf vier Grad Celsius festgelegt sind. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Quantifizierung mit ImageJ durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. wie sich die zelluläre Architektur, wie Adipozytenstandorte und die Blutgefäßdichte, als Reaktion auf verschiedene physiologische Bedingungen verändern.

visualization-3d-white-adipose-tissue-structure-using-whole-mount

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Um hochauflösende Bilder von fluoreszenzmarkierten Zellen in großen Geweben zu erhalten, sollten idealerweise die biologischen Proben ohne Schnitte abgebildet werden. 3DISCO ist ein unkompliziertes Gewebereinigungsverfahren, das auf sequentieller Inkubation mit organischen Lösungsmitteln basiert. Nach der Freigabe werden die Organe transparent, was einen End-to-End-Laserscan der Probe ermöglicht.

Imaging Geräumte Intact Biological Systems auf zellulärer Ebene durch 3DISCO

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren für den 3D-Vergleich von ganzem Herzen Herzmuskelgewebe mit MRI. Dies ist für die genaue Beurteilung der intramyokardialer Injektionen in der Infarktrandzone eines chronischen Schweinemodell eines Myokardinfarkts entworfen.

3D Whole-Herz Myocardial Gewebeanalyse

Diese Arbeit stellt ein neuartiges Verarbeitungs- und Abbildungsprotokoll für eine dicke, dreidimensionale Gewebequerschnittsanalyse dar, die die vollständige Ausnutzung konfokaler Bildgebungsmodalitäten ermöglicht. Dieses Protokoll bewahrt die Antigenität und stellt ein robustes System zur Analyse der Hauthistologie und potenziell anderer Gewebetypen dar.

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Aufgrund der hohen Fettgehalt hat Fettgewebe herausgefordert, mit traditionellen histologischen Methoden zu visualisieren. Adipo-Clear ist ein Gewebe, Technik, robuste Kennzeichnung und hohe Volumetrische fluoreszierende Abbildungsleistung des Fettgewebes können, löschen. Hier beschreiben wir die Methoden für die Probenvorbereitung, Vorbehandlung, Beizen, clearing und Montage für die Bildgebung.

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New Schiff Blutbildung und sympathische Innervation spielen entscheidende Rolle im Fettgewebe, das umgestaltet. Es bleiben jedoch technische Probleme zu visualisieren und Fettgewebe quantitativ zu messen. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um erfolgreich zu kennzeichnen und quantitativ vergleichen die dichten der Blutgefäße und Nervenfasern in verschiedenen Fettgewebe.

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Hier beschreiben wir eine einfache, kostengünstige und schnelle Clearing-Methode, um die 3D-Struktur von Maus- und menschlichem weiß-fettgewebe mithilfe einer Kombination von Markern zu lösen, um Vaskulatur, Kerne, Immunzellen, Neuronen und Lipid-Tröpfchen-Beschichtungsproteine durch fluoreszierende Bildgebung zu visualisieren.

Untersuchung der Adipose-Gewebestruktur durch Methylsalicylat-Clearing und 3D-Bildgebung

Funktionelle Bildgebung und Quantifizierung von thermogenen Fettdepots in Mäusen mit einem mikro-PET/MR-bildgebenden Ansatz.

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Ein Leitfaden zur Untersuchung der intramuskulären Fettbildung und ihres zellulären Ursprungs in der Skelettmuskulatur

Präadipozyten werden aus der stromalen Gefäßfraktion des interskapularen braunen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen isoliert und zu Zellen differenziert, die Lipidtröpfchen akkumulieren, molekulare Marker exprimieren und die mitochondriale Morphologie reifer brauner Adipozyten zeigen. Diese Zellen werden weiter mittels Immunfluoreszenz und Transmissionselektronenmikroskopie analysiert.

Differenzierung und Bildgebung von braunen Adipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion des interscapularen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen

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