Bewertung des Zusammenspiels zwischen dem Komplementprotein C1q und Hyaluronsäure bei der Förderung der Zelladhäsion
15. Juni 2019
Die Komplementkomponente C1q ist ein in der Gewebemikroumgebung hochgradig exprimiertes pro-inflammatorisches Molekül, das mit der extrazellulären Matrix interagieren kann. Hier beschreiben wir eine Methode, um zu testen, wie C1q, das an Hyaluronsäure gebunden ist, die Zellhaftung beeinflusst.
Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung des Zusammenspiels zwischen dem Komplementprotein C1q und Hyaluronsäure bei der Förderung der Zelladhäsion. Wir haben vor kurzem definiert, dass die Komplementkomponente C1q ein Molekül des angeborenen Immunsystems stark im Tumor und Plazenta Mikroumgebung exprimiert ist und in der Lage ist, mit Einer komponente der extrazellulären Matrix zu interagieren. In diesem Fall Hyaluronsäure.
Wir schlagen eine Methode zur Untersuchung der biologischen Funktionen von Proteinen in der gesamten ekronomischen Umgebung vor. Um die Fähigkeit dieser Moleküle zu untersuchen, die Zellteilungseigenschaften von extrazellulären Matrixfaktoren zu formen. Um zu untersuchen, wie diese Wechselwirkung von den Zellen im Gewebe der Umwelt wahrgenommen werden kann, haben wir diese einfache Methode eingerichtet, bei der binäre Zellen aus menschlichen Geweben an C1q haften durften, die an die extrazelluläre Matrix gebunden sind, in diesem Fall Hyaluronsäure.
Für das Beschichtungsverfahren ist der erste Schritt die Bindung von hochmolekularer Hyaluronsäure an 96 gut gewebebeschichtete Mikroplatten. Für die Beschichtung wird Hyaluronsäure in 0,1 Mol Kohlenstoffpuffer PH 9.6 in einer Konzentration von 15 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt. Und sanftes Pfeifen wird erwidert, um eine homogene Lösung zu erreichen.
Zur Beschichtung der Brunnen werden 100 Mikroliter der Lösung verwendet. Die Platte wird dann bei vier Grad Celsius über Nacht übertragen. Am nächsten Tag Vakuum aspirieren die behandelten Brunnen.
Einmal mit dPBS waschen. Fügen Sie entweder C1q oder BSA in die entsprechenden Bohrungen. C1q ist heute in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter kommerziell erhältlich und wird in einer Konzentration von 25 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt.
Und dPBS mit 0,5%BSA und 0,7 Millimole Calcium und Magnesium und divalente Kationen. BSA LPS frei wird bei einer Konzentration von 0,5% und Datum PBF verwendet. Die Platte wird dann über Nacht bei vier Grad Celsius übertragen.
C1q dosisabhängige Wechselwirkungen mit immobilisierter Hyaluronsäure werden durch enzymgebundene Immun-SA bestimmt. Zellenbeschriftung mit schnellem DiI. Der lipophile Tracer schnell DiI wird verwendet, um die Zellen von Interesse zu kennzeichnen. Zellen, die in dPBS resuspendiert werden, werden in der Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter verwendet.
Fast DiI wird einbis 100 direkt in die Zellsuspension verdünnt. Die Zellsuspension wird manuell gemischt und bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten übertragen. Nach fünf Minuten Inkubation die Zellsuspension mischen und diesen Vorgang noch zweimal wiederholen.
Um den Überschuss an schnellem DiI zu entfernen, fügen Sie 10 Milliliter dPBS hinzu. Biegen Sie sieben Minuten lang sanft auf und ab und zentrieren Sie sich bei 250 g. Setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter des humanen endophilen Serum-freien Mediums in Gegenwart von 0,1%BSA aus.
Zellen Haftung auf Hyaluronsäure C1q Matrizen. Vakuum-Aspirat der dPBS aus den beschichteten Brunnen. Verteilen Sie 100 Mikroliter beschrifteter Zellsuspension auf die beschichteten Brunnen.
200 Mikroliter beschrifteter Zellen werden in einem Ependure-Rohr auseinandergenommen, um für die Standard-Kurvenerzeugung verwendet zu werden. Inkubieren Sie die Platte für 35 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator.
Die unausgewogenen Zellen vorsichtig ansaugen. Einmal mit dPBS mit 0,5%BSA und 0,7 Millimolen Calcium und Magnesium waschen. Lys die anhaftenden Zellen durch Zugabe von 200 Mikroliter Lysepuffer.
Gleichzeitig bereiten Sie die Standardkurve auf ein bis zwei serielle Verdünnung der beschrifteten Zellen im Lysepuffer vor. Führen Sie das Ablesen des Blütensignals bei unendlichen F 200 T-can-Instrumenten mit 544 Nanometern als Anregungswellenlänge und 590 Nanometern als Emissionswellenlänge durch. Repräsentative Ergebnisse.
Wie die repräsentativen Ergebnisse zeigen, ist es offensichtlich, dass die Zelladhäsion auf Hyaluronsäure C1q als stark verbessert im Vergleich zu HA allein oder HA gebundenb BSA fand. Der Prozentsatz der anhaftenden Zellen in jeder Matrix wird auf der Grundlage der Standardkurve berechnet. Schlussfolgerungen. In unseren Experimenten haben wir zunächst die Fähigkeit der Komplementkomponente C12 bewertet, die extrazelluläre Matrix in diesem Fall Hyaluronsäure mit einem Arisalmetall zu binden.
Zweitens analysierten wir die Fähigkeit menschlicher Primärzellen, die mit fluoreszierendem Farbstoff gefärbt sind, gebundene Hyaluronsäure zu verfolgen. Das Modell, das wir in dieser Studie vorgeschlagen haben, ist eine einfachere schnellere und billigere Methode als Alternative zum 3D-Modell von extrazellulären Matrixgerüsten für die Bewertung dieser zellulären Reaktion auf eine Kombination von Reizen.
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Überblick
Diese Studie untersucht die Wechselwirkung zwischen der Komplementkomponente C1q und Hyaluronsäure, mit Fokus darauf, wie diese Wechselwirkung die Zelladhäsion beeinflusst. C1q, ein pro-inflammatorisches Molekül, wird signifikant in der Tumor- und Plazenta-Mikroumgebung exprimiert.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Immunologie
Hintergrund
- C1q ist Teil des angeborenen Immunsystems.
- Es wird in bestimmten Gewebe-Mikroumgebungen stark exprimiert.
- C1q interagiert mit Komponenten der extrazellulären Matrix.
- Hyaluronsäure ist eine Schlüsselkomponente der extrazellulären Matrix.
Zweck der Studie
- Um die Rolle von C1q in der Zelladhäsion zu bewerten.
- Um zu untersuchen, wie C1q, das an Hyaluronsäure gebunden ist, das Zellverhalten beeinflusst.
- Um eine Methode zur Untersuchung von Proteinwechselwirkungen in der extrazellulären Umgebung zu entwickeln.
Verwendete Methoden
- Es wurden binäre Zellen verwendet, die aus menschlichen Geweben gewonnen wurden.
- Zellen wurden erlaubt, an C1q gebunden an Hyaluronsäure zu adhieren.
- Ein umfassendes Verfahren wurde für die Bewertung etabliert.
- Biologische Funktionen von Proteinen wurden im Kontext der extrazellulären Matrix bewertet.
Hauptergebnisse
- Die Wechselwirkung zwischen C1q und Hyaluronsäure fördert die Zelladhäsion.
- Zellen reagieren auf das Vorhandensein von C1q in der extrazellulären Matrix.
- Diese Methode liefert Einblicke in Zellteilungseigenschaften, die von extrazellulären Faktoren beeinflusst werden.
- Die Erkenntnisse könnten Auswirkungen auf das Verständnis von Immunreaktionen in Gewebeumgebungen haben.
Schlussfolgerungen
- C1q spielt eine bedeutende Rolle in der Zelladhäsion durch seine Wechselwirkung mit Hyaluronsäure.
- Die entwickelte Methode kann angewendet werden, um weitere Proteinwechselwirkungen zu untersuchen.
- Das Verständnis dieser Wechselwirkungen kann das Wissen über Immunsystemfunktionen in verschiedenen Geweben erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Understanding how complement protein C1q modulates extracellular matrix components like hyaluronic acid provides mechanistic insight into tumor-stroma interactions that drive adhesion-mediated progression. This assay enables early de-risking of targets involved in microenvironmental remodeling by quantifying how immune-derived signals alter matrix-dependent cell behavior. The method supports target validation in immuno-oncology by linking innate immune effectors to functional extracellular matrix changes relevant to metastatic competence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how C1q binding to hyaluronic acid alters matrix properties to influence tumor cell adhesion, supporting functional target validation of microenvironmental mediators.
- Operational Value: Enables hypothesis testing of complement-driven matrix remodeling in a controlled, reproducible format using primary human tumor-derived cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence-based readouts of cell adhesion to C1q-HA matrices, enabling dose-response analysis of protein-matrix interactions.
- Operational Value: Uses a standardized 96-well coating protocol with defined concentrations of HA (15 µg/mL) and C1q (25 µg/mL) to ensure assay reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models how tumor-expressed C1q reshapes HA-mediated adhesion, offering a disease-relevant system to study stromal activation in neoplasia.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical work by providing a scalable method to evaluate matrix-targeted interventions using clinically relevant human cell inputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic screening, where matrix-dependent adhesion serves as a functional readout of pathway modulation in the tumor microenvironment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by testing whether C1q-HA interaction drives pro-adhesive phenotypes in primary human tumor cells.
- Screening: Delivers standardized, quantitative adhesion outputs compatible with medium-throughput evaluation of modulators of protein-matrix binding.
- Analytics: Fluorescence signal quantification via standard curve enables precise comparison of adhesion conditions across HA, C1q-HA, and BSA-HA matrices.
- Translational Research: Uses human tumor-derived cells and physiologically relevant matrix components to enhance translational confidence in microenvironmental targeting strategies.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted to study other extracellular matrix proteins and immune mediators beyond C1q and HA, supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in tumor-stroma communication by isolating the effect of C1q on HA-dependent adhesion.
- Operational Value: Defined coating and blocking steps (e.g., overnight 4°C incubation, dPBS washes) promote assay standardization and inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by quantifying how immune matrix interactions influence early tumorigenic behaviors like anchorage-dependent growth.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in complement-matrix crosstalk based on functional adhesion outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein coating, cell culture, and fluorescence-based quantification techniques.
- Dependent on access to fluorescence microplate readers capable of excitation at 544 nm and emission at 590 nm for fast DiI detection.
- Necessitates standardization of cell labeling protocols (e.g., fast DiI dilution, incubation times) to ensure consistent signal across experiments.
- Adaptation to other matrix proteins may require optimization of coating buffers and incubation conditions to maintain protein functionality.
- Limitations include reliance on 2D adhesion models, which may not fully capture 3D stromal complexity observed in vivo.
