Isolierung von Maus epidermalen Keratinozyten und ihrer In-Vitro-Clonogenen Kultur

Ziel dieses Protokolls ist es, epidermale Keratinozyten aus der dorsalen Haut erwachsener Mäuse für eine Vielzahl nachgelagerter Anwendungen wie Molekularbiologie, Biochemie, Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und primäre In-vitro-Anwendungen (z. B. clonogene Keratinozyten).

Unsere Methode zur Gewinnung von epidermalen Zellen von erwachsenen Mäusen ist nützlich für nachgelagerte Anwendungen wie Keratinozytenstammzellen. Unsere Technik ist sehr reproduzierbar und kann in Verbindung mit In-vivo-Verfahren bei Mäusen im Rahmen des Hautkarzinogenesemodells eingesetzt werden. Nach der Ernte von dorsalen Hautproben von eingeschläferten erwachsenen Mäusen verwenden Sie autoklavierte Zangen und ein Skalpell, um eine dorsale Haut zu einer Zeit behaarte Seite in eine dünne Petrischale zu legen und das subkutane Gewebe einschließlich des Fettes aus dem ventralen Hautgewebe abzuschrotten, bis das Gewebe halbdurchlässig ist.

Legen Sie die abgekratzte Haut in PBS, bis alle anderen verbleibenden Skins verarbeitet sind. Dann verwenden Sie ein Skalpell, um die Hautproben in 0,5 mal 1,5 Zentimeter Streifen zu schneiden. Legen Sie die Streifen behaarte Seite in eine sterile Petrischale, bevor Sie die Proben behaarte Seite auf der Oberfläche einer 20 Milliliter PBS plus zwei x Gentamicin-Lösung, ergänzt mit 0,25%Trypsin in einem Kunststoff 100 x 20 Millimeter Petrischale für zwei Stunden bei 32 Grad Celsius.

Am Ende der Inkubation eine sterile, plastische, quadratische Petrischale mit 15 Milliliter Erntemedium bei einer Steigung von 30 Grad aufstellen und mit gebogenen Zangen vorsichtig einen schwimmenden Hautstreifen in die Schale übertragen. Halten Sie eine neue Skalpellklinge in einem senkrechten Winkel zur Haut und mit ausreichender, aber nicht übermäßiger Kraft, schrotten Sie die Epidermis und die Haare von der Probe in das Medium ab. Wenn alle Streifen abgekratzt sind, dekantieren Sie sorgfältig die epidermale Zelle, die Überstand enthält, in ein steriles 60-Milliliter-Glas, das einen 1,5 Zoll großen magnetischen Rührstab enthält, und spülen Sie die Petrischale mit zusätzlichem Erntemittel ab, um alle verbleibenden epidermalen Zellen zu sammeln.

Bringen Sie das endige Volumen im Glas auf 30 Milliliter mit frischem Medium und rühren Sie die epidermale Zelllösung bei 100 Umdrehungen pro Minute 20 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Rührinkubation in einem Biosicherheitsschrank die Rührstange entfernen und die Zelllösung durch ein 70-Mikrometer-Sieb in ein 50 Milliliter Konisches Rohr filtern. Verwenden Sie Zangen und dann eine Pipette, um die Haare und die Stratum corneum Materialien durch das Sieb zu drücken, um das Gewebe zu manipulieren, um die gefangenen Haarzellen freizugeben und weitere fünf Milliliter Erntemedium verwenden, um die verbleibenden gefangenen Haarzellen in die Röhre freizugeben.

Es ist wichtig, dass die epidermalen Zellen und die Haare manipuliert werden, um die Zellen aus den Haarfollikel zu befreien. Bringen Sie das Gesamtvolumen in die Röhre bis zu 50 Milliliter mit frischem Medium und sammeln Sie das Zellfiltrat durch Zentrifugation. Das Pellet in 5 Milliliter frischem Erntemedium in ca. 20 Triturationen mit einer 5-Milliliter-Pipette wieder aufhängen.

Nehmen Sie 0,5 Milliliter der einbis zu 20 Verdünnung und übertragen Sie sie in ein 2 Milliliter Mikrofuge-Rohr. Nach dem sorgfältigen Mischen der Probe 200 Mikroliter aus dem Mikrofugenrohr nehmen und vorsichtig mit einem gleichen Volumen von 0,4% Trypan-Blau-Lösung mischen. Mischen Sie diese Lösung dreimal und übertragen Sie die Zellen auf ein Hämozytometer zum Zählen von nukleatierten Keratinozyten.

Bewerten Sie alle dunkelblauen Zellen als nicht lebensfähige Zellen und punkten Sie mit kleinen Gold- und rosafarbenen Zellen als lebensfähige Zellen. Die Lebensfähigkeit beträgt durchschnittlich etwa 80 % und der endgültige Keratinozytenertrag pro Maus sollte etwa 30 Millionen lebensfähige Zellen betragen. Nach dem Zählen, sammeln Sie die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation, und für die Massenkultur resuspendieren zwei bis vier mal 10 bis die sechsten lebensfähigen Keratinozyten pro 35 Millimeter Petrischale in 2 Milliliter Zellkulturmedium.

Für einen clonogenen Koloniebildungstest setzen Sie die Zellen um ein mal 10 bis die dritten Keratinozyten pro vier Milliliter modifiziertes William es E Medium mit Ergänzungen in Serumkonzentration pro kollagenbeschichteter 60-Millimeter-Petrischale auf röntgenbestrahlten Schweizer Maus 3T3-Feederschichten wieder aus. Für die Massenkultur, wachsen die Kulturen bei 32 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für die entsprechende Zellkulturperiode. Änderung des Mediums 24 Stunden nach der ersten Aussaat für die Massenkultur und dreimal pro Woche danach.

Am Ende der klonalen Kultur aspirieren Sie das Medium und fixieren Sie die Kolonien in 10%gepuffertformalin über Nacht bei Raumtemperatur. Am nächsten Morgen färben die Kolonien mit 0,5% Rhodamine B in autoklaviertem Wasser für eine Stunde, bevor sie das Geschirr in kaltem autoklaven Wasser spülen, bis das Wasser klar läuft. Dann neigen Sie die Gerichte auf ihren Deckeln zu trocknen, bevor Sie die Kolonien zählen.

Hier werden typische Ergebnisse von Keratinozytenkolonien-Formationstests nach verschiedenen topischen Behandlungen gezeigt. Haarfollikel-Stammzellen machen in der Regel etwa 9% der Zellen aus adulter C57BL/6 Maus dorsale Haut isoliert, wie durch Fluss zytometrische Färbung für Maus Haarfollikel Stammzellmarker beurteilt. In dieser Abbildung können die Wachstumsmerkmale von Keratinozytenstammzellkolonien nach Kultur unter vier verschiedenen mittleren Bedingungen beobachtet werden.

Nach diesem Verfahren können die Zellen für Durchflusszytometrie, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, Zellkultur und molekularbiologische Analysen verwendet werden. Diese Technik hat es uns ermöglicht festzustellen, dass die Anzahl der epidermalen Stammzellen ein quantitatives und komplexes Merkmal ist, das zur Identifizierung eines neuen Stammzell-Regulierungsgens führt.