Name: Quantifizierung der Leukozyten Egress über Lymphgefäße aus murinen Haut und Tumoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Erfahren Sie die Photokonversion zur quantitativen Analyse des Leukozyten-Egress aus muriner Haut und Tumoren mittels Kaede-Transgen-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung endogener Immunzellpopulationen in vivo.

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Die Autoren möchten Dr. Marcus Bosenberg danken für die Bereitstellung YUMM 1.1 und 1.7 YUMM murinen Melanom Linien und Dr. Deborah J. Fowell für die Bereitstellung von B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr Mäuse im Einvernehmen mit RIKEN BRC durch nationale Bio-Ressource des MEXT, Japan.

Alle tierischen Protokolle wurden von den institutionellen Animal Care und Use Committee an der Oregon Health & Science University genehmigt.
1. Induktion von Entzündungen und FITC Malerei der Maus Pinna
<ol><li>In einem Laminar-Flow-Haube, betäuben Mausklick C57Bl/6 mit verdampftem Isofluorane (bei 3-5 % Isofluorane induzieren und pflegen auf 1-3 % Isofluorane; Sauerstoff Durchflussmenge bei 0,5-1,0 L/min). Richtige Anesthetization zu gewährleisten, durch die Überwachung des Verlust Pedal-Reflex, unwillkürliche Bewegungen und reduzierte Atemfrequenz.</li>
	<li>Legen Sie ein Ohr flach mit der Bauchseite das Ohr nach oben. Pipettieren 20 µL 5 % FITC Lösung aufgelöst in 1:1 Aceton: Dibutyl Phthalat (DBP) auf die ventrale Seite des Ohr Ohrmuschel. Lassen Sie das Ohr ein paar Sekunden trocknen.</li>
	<li>24 h nach dem Auftragen FITC einschläfern die Mäuse über CO2-Exposition durch zervikale Dislokation gefolgt. Sammeln Sie das Ohr Ohrmuschel in PBS durch die Ohren vom Kopf mit einer Schere zu trennen. Sammeln Sie die zervikalen dLNs und leisten--Entwässerung LNs in PBS mit einer Pinzette die LNs getrennt vom umgebenden Gewebe. Leisten--Entwässerung LNs dient als negative Kontrollen auf das Vorhandensein von FITC+/Kaede rot+ Leukozyten. Entsorgen Sie Kadaver pro institutionelle Protokoll. Hinweis: Die optimale Zeit Post Ladungszustand zur Analyse hängt von Zelltyp und bekannte wandernde Verhalten. Dendritische Zellen können beispielsweise in dLNs bereits als 6 h Post DBP-Anwendung erkannt werden.</li>
</ol>(2) Induktion von Entzündungen und Ladungszustand der Maus Pinna
<ol><li>Betäuben Sie in einem Laminar-Flow-Haube Kaede-Tg Maus (Hintergrund C57Bl/6) durch intraperitoneale Injektion von 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin in Kochsalzlösung aufgelöst. Richtige Anesthetization zu gewährleisten, wie in Schritt 1.1 beschrieben.</li>
	<li>Legen Sie ein Ohr flach mit der Bauchseite das Ohr nach oben. Pipettieren 20 µL einer 1:1 Aceton: DBP auf der ventralen Seite des Ohr Pinna. Lassen Sie das Ohr ein paar Sekunden trocknen.</li>
	<li>Schneiden Sie nach Anwendung der DBP einen Schlitz in ein Stück Alufolie und ziehen Sie das Ohr durch den Schlitz, das Ohr auf die violetten Lichtquelle aussetzen. Legen Sie das Ohr flach mit der dorsalen Seite nach oben mit doppelseitigem Klebeband, um das Ohr an der Folie zu sichern.</li>
	<li>Positionieren Sie das Ohr direkt unter der Lichtquelle und Photoconvert für 3 min mit einer 405 nm Lichtquelle mit 100 mW Leistung.</li>
	<li>24 h nach Ladungszustand, einschläfern Kaede-Tg-Mäuse und das Ohr Ohrmuschel, zervikale LNs und inguinalen LNs zu ernten, wie in Schritt 1.3 beschrieben. Hinweis: Neben Überlegungen in Schritt 1.3 zitiert, die Rate der Verbreitung bestimmt den Zeitpunkt der Analyse wie der Verlust von Kaede rot in sich schnell teilenden Zellen auftreten wird.</li>
</ol>(3) Vaccinia Infektion der Maus Pinna und FITC Anwendung
<ol><li>Eine C57Bl/6-Maus mit verdampftem Isofluorane zu betäuben, wie in Schritt 1.1 beschrieben.</li>
	<li>Die Bauchseite des Ohres flach zu legen. Pipettieren 5 x 106 Plaque bilden Einheiten (PFU) des Vaccinia Virus (VacV) in 10 µL PBS auf Ohr Pinna verdünnt. Mit einer 29-Gauge-Nadel, stechen Sie die Ohrmuschel 25 Mal40.</li>
	<li>24 h nach der Infektion, VacV-infizierte Mäuse mit Isofluorane zu betäuben, wie unter Schritt 1.1 und Pipettieren 20 µL 5 % FITC in Aceton auf der Bauchseite der Ohr-Pinna gelöst. Lassen Sie das Ohr ein paar Sekunden trocknen.</li>
	<li>24 h nach dem Auftragen FITC einschläfern die Mäuse und das Ohr Ohrmuschel, zervikale LNs und inguinalen LNs zu sammeln, wie in Schritt 1.3 beschrieben. Hinweis: FITC kann zu jeder Zeitpunkt Post Infektion DC Menschenhandel in verschiedenen 24 h Abständen bestimmen angewendet werden. Wir berichteten bereits, dass DC-Migration auf dLNs auf ähnlichem Niveau von Tag 1 bis 3 Post-Infektion41aufrechterhalten wird.</li>
</ol>4. Vaccinia Infektion der Maus Pinna und Ladungszustand.
<ol><li>Kaede-Tg Maus mit verdampftem Isofluorane zu betäuben, wie in Schritt 1.1 beschrieben.</li>
	<li>Das Ohr Ohrmuschel mit VacV zu infizieren, wie in Schritt 3.2 beschrieben.</li>
	<li>24 h nach der Infektion, Kaede VacV-infizierten Mäusen wie in Schritt 2.1 beschrieben zu betäuben und Ladungszustand durchführen, wie 2.3-2.4 beschrieben.</li>
	<li>24 h nach Ladungszustand, einschläfern die Mäuse und das Ohr Ohrmuschel, zervikale LNs und inguinalen LNs zu ernten, wie in Schritt 1.3 beschrieben. Hinweis: Wie bereits erwähnt in Schritt 3.4 kann Ladungszustand bei jeder Zeitpunkt Post Infektion verabreicht werden.</li>
</ol>(5) Ohr und Lymphknoten Verarbeitung für Durchflusszytometrie
<ol><li>Erstellen Sie einzelne Zellsuspensionen von Ohr Ohrmuschel: schälen auseinander ventralen und dorsalen Rand mit zwei paar Pinzette und Ort mit der Innenseite nach unten in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 1 mg/mL Kollagenase D und 80 U/mL DNase verdünnt im Ohr Ohr Pinna Hank es gepuffert salzhaltige Lösung (HBSS) (mit Ca2 + und Mg2 +). Inkubation bei 37 ° C für 30 min. Presse das verdaute Gewebe durch ein 70 µm Nylon Zelle Sieb.</li>
	<li>Erstellen Sie einzelne Zellsuspensionen von LNs: Brunnen von einer 24-Well-Platte mit 1 mg/mL Kollagenase D und 80 U/mL DNase verdünnt in HBSS LNs entgegenbringen. Öffnen Sie den Lymphknoten Kapsel mit zwei 29-Gauge Nadeln und inkubieren Sie die Lymphknoten bei 37 ° C für 30 min. Presse das verdaute Gewebe durch ein 70 µm Nylon Zelle Sieb zu necken.</li>
</ol>6. intrakutane Melanom Tumor Implantation und Ladungszustand.
<ol><li>Rasieren Sie das Fell von der Mitte des Rückens Mausklick Kaede-Tg mit einen elektrischen Rasierapparat.</li>
	<li>Positionieren Sie eine 29-Gauge-Nadel in der Mitte des Rückens zwischen der linken und rechten oberen Scapulae und Mikrodialysemembranen injizieren Sie 5 x 105 Tumorzellen (in 50 µL Kochsalzlösung verdünnt) in die Haut von Mäusen, Kaede-Tg. Tumoren müssen sorgfältig positioniert werden, um Lymphdrainage zu bestimmten Lymphknoten (alsolinks und rechts brachial LNs für Tumoren in der Mitte des oberen Rückens platziert) zu gewährleisten. Vermeiden Sie den Tumor über dLN, da direkte Ladungszustand der LNs durch die Hauttumor führen kann.</li>
	<li>Die Tumoren wachsen auf gewünschte Größe (100-650 mm3) zu ermöglichen.</li>
	<li>Betäuben Sie einen Tag vor der Entnahme von Gewebe, Kaede-Tg Maus zu, wie unter 2.1 beschrieben und Rasieren Sie jede neu nachgewachsene Fell rund um den Tumor zu.</li>
	<li>Schneiden Sie ein kreisrundes Loch in Alufolie und durchziehen Sie den Tumor, den Tumor auf die Lichtquelle aussetzen. Schneiden Sie das Loch etwas kleiner als der Tumor zu verhindern, dass den Tumor wieder durch das Loch zu fallen, und minimieren Sie die Umwandlung der benachbarten, keinen Tumor Haut.</li>
	<li>Positionieren Sie den Tumor direkt unterhalb der Lichtquelle und Photoconvert für 5 min mit einer 405 nm Lichtquelle mit 200 mW Leistung.</li>
	<li>24 h nach Ladungszustand, einschläfern die Mäuse, wie in Schritt 1.3 beschrieben. Sammeln Sie die Tumoren, brachial dLNs und leisten--Entwässerung LNs in PBS. Schneiden Sie die Tumoren von der umgebenden Haut mit einer Schere und entfernen Sie LNs zu, wie in Schritt 1.3 beschrieben.</li>
</ol>(7) Tumor und Lymphknoten Verarbeitung für Durchflusszytometrie
<ol><li>Erstellen Sie einzelne Zellsuspensionen von Tumoren: Tumoren mit einer Schere in Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 1 mg/mL Kollagenase D und 80 U/mL DNase verdünnt in HBSS Blatt vor den Mund. Inkubation bei 37 ° C für 1 h Presse das verdaute Gewebe durch ein 70 µm Nylon Sieb.</li>
	<li>Erstellen Sie einzelne Zelle Aussetzung der Lymphknoten, wie im Schritt 5.2 beschrieben.</li>
</ol>(8) Antikörper für die Durchflusszytometrie Färbung
<ol><li>Führen Sie nach verdauen das Gewebe in einzelnen Zellsuspensionen, standard Flow Cytometry befleckenden Techniken um die Zellen mit Markierungen von Interesse zu beschriften. Kurz, Pipettieren 2 x 106 Zellen in einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Proben mit Fc-Block (1 µg/mL) für 20 min auf Eis; Waschen Sie sich zweimal mit FACs-Puffer (1 % Rinderserumalbumin mit PBS-Puffer). Den Proben lebenden/Toten Fleck (verdünnt mit PBS-Puffer) hinzugefügt und inkubieren Sie für 15 min auf Eis; Waschen Sie sich zweimal mit FACs-Puffer. Brüten Sie mit Primärantikörpern (Table of Materials) in FACs Puffer für 30 min auf Eis verdünnt; Waschen Sie sich zweimal mit FACs-Puffer. Hinweis: Kaede grüne und rote Fluoreszenz zu mit FITC und PE Fluorophore Überschneidungen Kaede; Somit können nicht in Kombination mit Kaede Proteine FITC und PE-konjugierten Antikörpern verwendet werden.</li>
	<li>Laufen Sie nach der Färbung die Proben auf einem Durchflusszytometer. Alternativ, befestigen Sie die Zellen mit 2 % PFA.</li>
</ol>9. Flow Cytometry Analysis
<ol><li>Legen Sie die FITC (Kaede grün) und PE (Kaede rot) Kanal PMT Spannungen auf 70-80 % des gesamten Bereichs (zentrieren Bevölkerung um ungefähr 104) mit ex-Vivo Kaede grün oder rot Kaede einfarbige Splenocyten oder Blut. Hinweis: Kompensieren Sie nicht die Kaede grün (FITC) und Kaede rot (PE) Kanäle wie dadurch größere Signal verteilt wird.<ol>
<li>Um einfarbige Kaede Steuerelemente erstellen, eine Milz oder Blut aus Kaede-Tg Maus zu sammeln. Lyse der roten Blutkörperchen mit ACK-Puffer, dann die Zellen in zwei Gruppen unterteilen: unbekehrt Kaede grün und konvertierte Kaede rot.</li>
		<li>Für einfarbig Kaede auszusetzen rot-Steuerelemente, die Zellen in 1 mL PBS und Photoconvert in einer 24-Well-Platte für 5 min mit einem 405 nm Lichtquellen mit einer Leistung von 100 mW. Verwenden Sie diese Zellen einstellen von Kaede grün (FITC) und Kaede rote PMT Spannungen auf das Durchflusszytometer (Schritt 9.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald die Spannungen für die Kaede Proteine eingestellt wurde, für alle anderen Primärantikörper Flecken mit Single-Fluorophore beschriftet Entschädigung Perlen pro des Herstellers zu kompensieren.</li>
	<li>Laufen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer, Daten zu sammeln. Hinweis: Das Protein Kaede wird kontinuierlich durch die Zellen produziert. Dies bedeutet, dass 24 h nach Ladungszustand, umgebaute Zellen werden doppelt positiv für Kaede grün und Kaede rot wie neu synthetisierte Kaede (grün) Protein in der Zelle angesammelt hat.</li>
	<li>Analysieren Sie die Daten mithilfe von FlowJo Software oder eine ähnliche Software.</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Obwohl der Leukozyten Egress von peripheren, nicht-lymphatischen Geweben für die Initiierung und Auflösung der Immunantwort ankommt, sind die molekularen Mechanismen, die ausgehenden Regeln kaum erforscht. Diese Wissenslücke ist vor allem auf hohe Verfügbarkeit von Werkzeugen für die Quantifizierung in Vivo. Hier beschreiben wir die Verwendung von Photoconvertible Mäusen (Kaede-Tg) zu quantifizieren endogenen Leukozyten Austritt aus der Haut und Tumoren eine direkte Direktvergleich mit FITC-Lack in entzündliche ...

Periphere Gewebe Immunantworten sind geprägt durch Leukozyten Einstellung zu den Standorten von Entzündungen, sondern auch durch Mechanismen, die ihre spätere Aufbewahrung zu Regeln. Somit richtet sich schützende Immunität durch kumulative zellulären und molekularen Mechanismen, die bestimmen, ob ein Leukozyten eingibt, Aufenthalte innerhalb, oder besser gesagt aus peripheren Gewebe über Lymphgefäße migriert. Wichtig ist, ist die Neigung für Leukozyten Gewebe durch Lymphgefäße (genannt Egress) beenden ihre speziellen Funktionen verbunden. Dendritische Zellen (DC) erwerben Wanderungsverhalten in Reaktion auf Reifung Signale führt zu Antigen-Transport und Präsentation in Entleerung Lymphknoten (dLN), ein Prozess, der für adaptive Immunität1erforderlich ist. Aufräumvorgang myeloische Zellen wie Makrophagen und Neutrophilen, dienen der Apoptotic Rückstand durch Phagozytose zu löschen. Während der bakteriellen Infektion Neutrophilen Brandschutzzeichen Gewebe und letztlich Apoptose in dLNs2 und in einem Modell der DSS-induzierte Kolitis, Daten unterstützen die Hypothese, dass Makrophagen Egress lokale Entzündung3lösen muss. Ob Neutrophilen und Makrophagen Egress Auftritt in allen entzündlichen zusammenhängen, ist allerdings unbekannt. Beweise für die T-Lymphozyten Egress von Steady-State4,5,6,7, infizierte8und entzündeten4,9,10, 11,12 periphere, nicht-lymphatischen Gewebe zeigt, dass T-Zellen aktiv umwälzen, obwohl die gewebebasierten Signale, die diese Ausfahrt fahren schlecht verständlich bleiben. Mehrere Studien identifizierten Signale für gerichtete Migration in Richtung Entwässerung lymphatische Kapillaren und die anschließende Brandschutzzeichen einschließlich Chemokin (C-C-Motiv) Liganden 21 (CCL21) und seines Rezeptors CCR74,11, 13, Chemokin (C-X-C Motiv) Liganden 12 (CXCL12) und sein Rezeptor CXCR42,14, sowie Sphingosine-1-Phosphat (S1P)10,15,16. Diese Mechanismen sind nicht in allen Kontexten tätig, und ob sie Ausgang alle Zelltypen bestimmen, bleibt eine offene Frage. Wichtig ist, bedarf weiterer Einblick in die Mechanismen, die für Ausstieg und seine funktionelle Relevanz bei der Krankheit gelten quantitative in-Vivo -Methoden der Analyse.
Verschiedene Methoden wurden verwendet, um Ausstieg in mehreren Tiermodellen in Vivo einschließlich direkter Kanülierung der Lymphgefäße, Adoptiv Transfer von ex-Vivo mit der Bezeichnung Leukozyten, transdermale Anwendung von fluoreszierenden Tracer zu quantifizieren, Einspritzung der beschriftete Partikel und in Vivo Ladungszustand17,18. Direkte Kanülierung der afferenten Maus Lymphgefäße ist schwierig und Kleintiere begrenzt durch die Menge an Flüssigkeit, die gesammelt werden können. So Kanülierung vor allem bei großen Tieren durchgeführt wurde (zB., Schafe) wo solche chirurgischen Manipulationen sind praktisch. Diese Studien liefern direkte Hinweise auf das Vorhandensein des lymphatischen und myeloischen Zellen in Lymphknoten10,19,20. Darüber hinaus zeigen Schafe Modelle, dass akute und chronische Entzündungen Lymphozyten Präsenz in Lymphe durch fast 100-fold10,21 erhöht.
Adoptiveltern Übertragung von beschrifteten und genetisch manipulierter Lymphozyten hat vor allem ergeben, dass CCR7 für den Ausstieg von CD4 benötigt+ T-Zellen von akut entzündeten Haut5,11, während der Vorbehandlung von Lymphozyten mit dem kleinen Molekül S1P-Rezeptor-Agonist hemmt FTY720, nur teilweise ihren Ausgang10. Interessanterweise der Egress von übertragenen Lymphozyten von chronisch entzündete Haut ist CCR7-unabhängige10, aber erfordern teilweise CXCR49. Adoptiv-Transfer Experimente, liefern jedoch physiologisch Zahlen von Ex-Vivo aktivierte und beschriftete Lymphozyten in das Gewebe durch Injektion, die biomechanische Umwelt von Geweben und erhöhten interstitiellen Fluiddrücke verändert das erste lymphatische Kapillaren öffnen und ändern ihre Transport-Eigenschaften-22. Als alternative, transdermale Anwendung von Fluorescein erfolgt (FITC) in das Vorhandensein oder Fehlen von dermalen Reizstoffe (zB., Dibutyl Phthalat, DBP) oder Infektion23,24 ermöglicht die Verfolgung von phagocytic Zellen, die Tracer zu sammeln und zu dLNs migrieren. In ähnlicher Weise können Eindringmittel beschriftete Tumoren phagocytic Zellen zu verfolgen, die Tumor Material25verschlungen haben. Diese Methoden haben wichtige Einblicke in die Mechanismen zur Verfügung gestellt, die regieren DC Ausgang13,14,17,26,27 , aber sind nicht in der Lage, nicht-phagocytic verfolgen Lymphozyten und Interpretation können durch kostenlose Lymphdrainage des löslichen FITC so Kennzeichnung nicht migrierend LN ansässige DCs erschwert werden.
Alternativ ist intravitalen Mikroskopie ein leistungsfähiges Werkzeug, das in Vivo Verfolgung von physiologisch relevanten Leukozyten Populationen in Echtzeit28,29ermöglicht. In Kombination mit dem Reporter Mäuse und Antikörper-basierten in Vivo immunofluorescent Kennzeichnung intravitalen Mikroskopie ergab die komplexe räumliche und zeitliche Dynamik der immunen Zellen des Drogenhandels, einschließlich interstitielle Migration30 , Seelenwanderung über das lymphatische Endothel, Passage innerhalb der lymphatischen Lumen und Migration auf LN Eintrag28,31. Breite Akzeptanz der intravitalen bildgebenden Verfahren wird durch Kosten, notwendige Know-how zum Einrichten, begrenzt und beschränkt Durchsatz zur Quantifizierung der mehrere Zelltypen. Dennoch werden Kupplung quantitative Methoden, die Populationsdynamik analysieren Gewebe mit intravitalen Bildgebung zusätzliche und wichtige mechanistischen in Bezug auf die Mechanismen der Motilität und Migration in Richtung und im lymphatischen Kapillaren Einblick 18 , 31 , 32.
Infolgedessen in Vivo Ladungszustand entstanden als eine Methode, die in Situ zu etikettieren, erlaubt unabhängig von phagocytic Tätigkeit und für die Quantifizierung der physiologischen Leukozyten Ausgang (wenn in Verbindung mit Durchflusszytometrie) in der fehlen oder Vorhandensein von Herausforderung. Kaede-Tg Mäuse express konstitutiv ein Protein isoliert von Stony Coral, die grüne Fluoreszenz (Kaede grün) aufweist, bis UV-Licht ausgesetzt nach denen es irreversibel zu rote Fluoreszenz (Kaede rot)33umwandelt. Photoconverted Zellen können verfolgt werden, wie sie von Seiten der peripheren Gewebe Brandschutzzeichen und reichern sich in dLNs. Dies und andere ähnliche Photoconvertible Maus Modelle34,35 ergaben sich wichtige Biologie einschließlich konstitutive Egress von regulatorischen T-Zellen von Haut36, CXCR4-abhängige B Zelle Austritt von Peyer Patches37 , Mobilisierung von Residenten Speicher T-Zellen auf Peptid erneut herausfordern38und breiten Leukozyten Egress von Tumor Mikroumgebungen39. Hier führen wir einen direkten Vergleich der Ladungszustand mit transdermalen FITC Anwendung im Rahmen der kutanen Entzündung und Infektion mit der Photoconvertible-Methode zum direkten Vergleich der vorhandenen Daten zu ermöglichen. Wir zeigen Ladungszustand im implantierten Tumoren und beschreiben die Umwandlungs-Leistungsfähigkeit und selektive Egress von Tumor Mikroumgebungen. So, wir argumentieren, dass die weitere Anwendung dieser Methoden benötigt wird, um die kritische Biologie der Leukozyten Egress von Tumoren, aufzuklären, die erhebliche Auswirkungen auf die Interpretation intratumorale Leukozyten Komplexität, anti-Tumor Immunität haben wird und Ansprechen auf die Therapie.

<table><tbody><tr><td>Kollagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>4536282001</td><td></td></tr><tr><td>Silver-LED-405B Lichtquelle mit optischer Faser und Kollimtor</td><td>Prizmatix Ltd</td><td>V8144</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanat Isomer I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4274</td><td></td></tr><tr><td>Dibutylphthalat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>524980</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2440-02</td><td></td></tr><tr><td>29-Gauge-Spritzen</td><td>Exel International</td><td>26029</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>70 μm Zellsiebe</td><td>VWR</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Caisson</td><td>HBL06</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Purified Anti-Mouse CD16/CD32</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-M001</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD11c (Klon N418)</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 MHCII (Klon M5/114.15.2)</td><td>BD Pharmingen</td><td>562363</td><td></td></tr><tr><td>BV421 CD3e (Klon 145-2C11)</td><td>Biolegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>APC CD8a (Klon 53-6.7)</td><td>TonBo Biosciences</td><td>20-0081-u100</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 CD45 (Klon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>BV650 CD19 (Klon 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115541</td><td></td></tr><tr><td>PercCP-Cy5.5 Ly6C (Klon HK1.4)</td><td>Biolegend</td><td>128011</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 F4/80 (Klon BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123121</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ly6G (Klon 1A8)</td><td>Biolegend</td><td>127623</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD11b (Klon M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101241</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD45 (Klon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103155</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD4 (Klon RM4-5)</td><td>BD Biosciences</td><td>563726</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (Fraktion V)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Anit-Ratte und Anti-Hamster Igk / Negativkontrolle Kompensation Partikelset</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>Fortessa Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10 Software</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung der leukozyten egress über lymphgefäße aus murinen haut und tumoren

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Leukozyten-Ausstieg aus den peripheren Geweben, Lymphknoten ist nicht nur wichtig für die Immunüberwachung und Einleitung, sondern trägt auch zur Lösung der peripheren Gewebe Antworten. Während eine Vielzahl von Methoden werden verwendet, um die Leukozyten Ausstieg aus den nicht-lymphatischen, peripheren Geweben zu quantifizieren, bleiben die zellulären und molekularen Mechanismen, die Kontext-abhängige ausgehenden Regeln schlecht verstanden. Hier beschreiben wir die Verwendung von in Situ Ladungszustand für Quantitative Analyse der Leukozyten Ausstieg aus murinen Haut und Tumoren. Ladungszustand ermöglicht die direkte Kennzeichnung von Leukozyten in Hautgewebe aufhalten. Obwohl die Exposition der Haut gegenüber UV-Licht induziert lokale Entzündungsreaktionen Leukozyten Infiltrate und geprägt vaskulären Undichtigkeit in einem Direktvergleich mit transdermalen Anwendung von fluoreszierenden Tracern Ladungszustand speziell wandernde dendritische Zellenbevölkerungen beschriftet und aktiviert gleichzeitig die Quantifizierung der myeloischen und lymphatischen Egress von kutanen Mikroumgebungen und Tumoren. Die Mechanismen der Leukozyten Egress bleiben eine fehlende Komponente in unserem Verständnis der intratumorale Leukozyten Komplexität und damit die Anwendung der hier beschriebenen Tools bieten einzigartige Einblicke in die Dynamik der Tumor immun Mikroumgebungen beide im Steady State und im Ansprechen auf die Therapie.

Zuerst wollten wir replizieren Ladungszustand Ergebnisse veröffentlicht in der Literatur zu bewerten die Effizienz und die damit verbundenen Entzündung in der Maus Haut festzulegen. Der Ohr-Pinna 100 mW UV-Licht ausgesetzt war (405 nm) für 3 min33wie zuvor beschrieben. Einzelne Zellsuspensionen generiert aus dem Ohr Haut oder zervikalen dLNs unmittelbar nach der Exposition einen 78 % Wirkungsgrad von allen CD45 offenbart+ Leukozyten in der Haut mit keine...

Hier zeigen wir die Methoden zur in Vivo Quantifizierung der Leukozyten Ausstieg aus naiv, entzündet, und bösartigen murinen Haut. Wir führen einen direkten Vergleich der beiden Modelle: transdermale FITC Anwendung und in Situ Ladungszustand. Darüber hinaus zeigen wir den Nutzen der Ladungszustand für die Verfolgung von Leukozyten Egress von kutanen Tumoren.

Quantifizierung der Leukozyten Egress über Lymphgefäße aus murinen Haut und Tumoren

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

Photoconversion bietet eine nachvollziehbare In-vivo-Methode für die quantitative Analyse von Leukozyten-Egress für einen mechanistischen Einblick in Leukozyten-Residenz und Exit-Dynamik von mehreren Gewebestandorten in krankheitskranken Zuständen. Nun, hier zeigen wir den Nutzen der Leukozytenverfolgung von Hauttumoren. Die Anwendung dieses Assays auf andere Gewebe und Krankheiten ist nur durch die Fähigkeit zur Verabreichung von Licht begrenzt.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, die Quantifizierung endogener statt übertragener Immunzellpopulationen als Folge von entzündeten Geweben in vivo zu ermöglichen. Um Entzündungen zu induzieren, nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, verwenden Sie eine Mikropipette, um 20 Mikroliter Dibutylphthalat oder DBP zu verabreichen, auf die ventrale Seite der Ohrpinna einer anästhesierten Kaede transgene Maus. Nachdem Sie das DBP trocknen lassen, ziehen Sie das Ohr durch einen Schlitz in einem Stück Aluminiumfolie und verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um das Ohr flach an der Folie mit der dorsalen Seite nach oben zu befestigen.Positionieren Sie dann, dass Sie sich direkt unter einer 405 Nanometer Lichtquelle befinden, und fotokonvertieren für drei Minuten bei 100 Milliwatt Leistung. Bei einer Impfung verwenden Sie eine Mikropipette, um 5 mal 10 bis zur 6. Plaque bildenden Einheiten des Impfvirus in 10 Mikroliter PBS auf die Ohrpinna einer anästhesierten Kaede transgene Maus zu verabreichen und die Pinna 25 Mal zu stochern. 24 Stunden später, Photoconvert die Pinna, wie gerade gezeigt.Zum entsprechenden experimentellen Zeitpunkt ernten Sie die Pinnae und die zervikalen und leistenden Lymphknoten und verwenden Sie zwei Pinzettenpaare, um die ventrale und dorsale Seite jeder Pinna auseinander zu schälen. Dann legen Sie die Lymphknoten und die Pinna-Stücke, mit der Innenseite des Ohres nach unten, in einzelne Brunnen einer 24-Well-Platte mit 1 Milligramm pro Milliliter Kollagenase D und 80 Einheiten pro Milliliter Dnase in HBSS mit Kalzium und Magnesium verdünnt. Verwenden Sie zwei 29-Meter-Nadeln, um jede Lymphknotenkapsel zu necken und die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius zu platzieren.Am Ende der Inkubation drücken Sie die verdauten Pinna und Lymphknotengewebe durch separate 70 Micron Nylon-Zell-Siebe, um einzellige Suspensionen jedes Gewebes zu erhalten. Wenn die Tumoren auf die entsprechende experimentelle Größe angewachsen sind, rasieren Sie jedes neu nachgewachsene Fell um die Tumorstelle und ziehen Sie den Tumor durch ein kreisförmiges Loch, das in ein Stück Aluminiumfolie geschnitten ist. Positionieren Sie den Tumor direkt unter der 405 Nanometer Lichtquelle und photoconvert für 5 Minuten bei 200 Milliwatt Leistung.24 Stunden nach der Photokonversion ernten Sie die Tumore und brachialen und leistenden Lymphknoten von jedem Tier und verwenden Sie eine Schere, um die Tumore in einzelnen Brunnen einer 24-Well-Platte mit Collagenase D und DNase in HBSS zu zerkleinern. Legen Sie die Lymphknoten in separate Brunnen und necken Sie die Kapseln, wie gerade gezeigt. Nachdem Sie die Tumore für eine Stunde und die Lymphknoten für eine halbe Stunde bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, drücken Sie das verdaute Gewebe durch separate 70 Micron-Siebe, um einzellige Suspensionen jedes Gewebes zu erhalten.Um die einzelzelligen Suspensionen durch Durchflusszytometrie zu analysieren, sammeln Sie zuerst die Milz oder das Blut von einer Kaede transgene Maus und lyse die roten Blutkörperchen mit Ammoniumchlorid Kaliumpuffer. Teilen Sie die Zellen in eine unkonvertierte Kaede FITC und eine konvertierte Kaede PE-Population und setzen Sie die einfarbigen Kaede PE-Zellen in einem Milliliter PBS in einem Brunnen einer 24-Well-Platte wieder auf, und dann die Zellen für 5 Minuten unter einer 405 Nanometer Lichtquelle bei 100 Milliwatt Leistung fotoconvert. Verwenden Sie anschließend die fotokonvertierten Kaede PE-Zellen und die nicht konvertierten Kaede FITC-Zellen, um die Photomultiplierspannungen auf 70 bis 80 % des Gesamtbereichs jedes Fluoreszenzkanals einzustellen.Sobald die Spannungen für die Kaede-Proteine eingestellt sind, kompensieren Sie alle anderen primären Antikörperflecken mit einzelnen Fluorophor-markierten Kompensationsperlen, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie dann die Proben auf dem Durchflusszytometer gemäß den standardmäßigen zytometrischen Analyseprotokollen durch. Einzelzellige Suspensionen, die unmittelbar nach der Photokonversion von der Ohrhaut oder den zervikal entwässernden Lymphknoten erzeugt werden, zeigen eine 78%ige Umwandlungseffizienz aller CD45-positiven Leukozyten in der Haut, ohne dass konvertierte Zellen in den entwässernden Lymphknoten beobachtet werden.Die Quantifizierung der Anzahl der infiltrierenden CD45-positiven Leukozyten in fotokonvertierten Ohren Null und 24 Stunden nach der Umwandlung zeigt, dass die violette Lichtexposition eine statistisch signifikante Zunahme der Leukozyteninfiltration verursacht. Dieser Anstieg der CD45-positiven Leukozyteninfiltration ist jedoch im Vergleich zur Infiltration, die durch einen starken entzündungshemmenden Reiz wie das Impfvirus induziert wird, gering. Photokonversion erhöht auch die vaskuläre Permeaität in der Ohrpinne, gemessen durch Miles Assay, zusammen mit dem Hinweis, dass Die Auswirkungen von violettem Licht auf Gewebeentzündungen bei der Optimierung von Dosis, Expositionszeit und Dateninterpretation berücksichtigt werden sollten.Die zytometrische Analyse von dissoziierten Tumorzellen von fotokonvertierten Tieren zeigt eine signifikante Umwandlung intratumoraler CD45-positiver Zellen von Kaede FITC-positiv in Kaede PE-positiv, während die Entwässerung von Lymphknotenzellen unkonvertiert bleibt. Die Photokonversionseffizienz von CD45-positiven Leukozyten variierte signifikant zwischen Tumortypen und -größen, wobei CD45-positive Leukozyten bei kleinen Melanomtumoren die effizienteste Photokonversion demonstrierten. Mit zunehmendem Tumorvolumen nimmt die Umwandlungseffizienz auf rund 50% ab. Melanin hat einen auffälligen Einfluss auf die Photokonversionseffizienz mit einer maximalen Photokonvertierung von CD45-positiven Zellen, die bei Melanin produzierenden Tumoren von nur etwa 30% bei kleineren Tumoren beobachtet werden, die auf 10% sinkt, wenn sich das Tumorvolumen 400 Kubikmillimeter nähert.Die Untersuchung von tumorentwässernden Lymphknoten 24 Stunden nach der Photokonversion zeigt das Vorhandensein von Kaede roten positiven Immunzellen verschiedener Phänotypen und zeigt damit die Auswanderung von Leukozyten aus dem photokonvertierten Tumor. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die Kinetik des stationären Zustands und des entzündeten Leukozytenumsatzes im peripheren Gewebe aufzudecken. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass nur das Gewebe von Interesse fotokonvertiert ist, da unbeabsichtigte Photokonvertierung des umgebenden Gewebes Ihre Ergebnisse beeinträchtigt.Personen, die neu bei dieser Methode sind, sollten die Expositionszeit für die Umwandlung ihres Gewebes sowie die Dauer der Zeit vor der Gewebeentnahme auf der Grundlage der Dynamik von Leukozyten von Interesse optimieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kürzlich entwickelte Bildgebungsverfahren mittels Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) kann helfen erläutern die Rolle spielt das Lymphsystem in Krebsmetastasen, Immunantwort, Wundheilung und anderen lymphatischen-assoziierten Krankheiten.

Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

Dieses Video zeigt einen Assay zur Überwachung der dendritischen Zellmigration nach einer Balleninfektion mit Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG bei Mäusen. Bei einer bakteriellen Infektion werden aktivierte DC-Zellen der Haut mit einem zellpermeablen Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFSE)-Farbstoff markiert. Nach einem geeigneten Intervall für die DC-Migration in den kehlkehlchendrainierenden Lymphknoten werden die Knotenzellen isoliert und einer Immunfärbung auf...

Ein CFSE-basierter Assay zur Überwachung der Migration dendritischer Zellen der Haut zu drainierenden Lymphknoten bei infizierten Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur detaillierten Bewertung von Leukozyten-Untergruppen innerhalb der Tumormikroumgebung in einem Maustumormodell. Chemerin-exprimierende B16-Melanomzellen wurden subkutan in syngene Mäuse implantiert. Zellen aus der Tumormikroumgebung wurden dann gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert, was eine detaillierte Analyse der Leukozyten-Untergruppe ermöglichte.

Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell

Ein Assay an Mäusen zur Verfolgung der Zellmigration von der Haut zum drainierenden Lymphknoten wird beschrieben, der die Charakterisierung von dendritischen Zellen der Haut ermöglicht, die nach einer Balleninfektion mit Bacille Calmette-Guérin zum Lymphknoten mobilisiert wurden.

Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bazillus Calmette-Guérin

Protokolle für die quantitative Bewertung der Lymphozyten Chemotaxis und Migration sind wichtige Werkzeuge für die Immunologie Forschung. Hier wird eine in-vitro- Protokoll beschrieben, dass Genehmigungen in Echtzeit, Multiplex, Bewertung von Zellwanderung sowie eine ergänzende in Vivo Technik ermöglicht Tracking von native Zellen Milz.

Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

In diesem Protokoll werden Lymphozyten in die obere Kammer eines Transmigrationssystems gelegt, die durch eine poröse Membran von der unteren Kammer getrennt sind. Chemokin wird der unteren Kammer hinzugefügt, was eine aktive Migration entlang eines Chemokingradienten induziert. Nach 48 h werden Lymphozyten in beiden Kammern gezählt, um die Transmigration zu quantitieren.

Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Hier zeigen wir, wie man eine intravitale Mikroskopie auf postkapillaren Venulen des Maus-Cremaster-Muskels durchführt. Häufig angewendet auf verschiedene Modelle von Entzündungen und Sepsis, insbesondere solche, die durch Chemokine und Zytokine induziert werden, heben wir ihre Relevanz in der Untersuchung von Muskopathien mit übertriebener Muskel-Leukozyten-Infiltration hervor.

Leukozyten-Infiltration von Cremaster-Muskeln bei Mäusen bewertet durch Intravital-Mikroskopie

Hier beschreiben wir eine präzise Methode zum Sammeln von Thoraxkanallymphozyten und zur Beobachtung der Migration von darm-tropischen Lymphozyten in Ratten-Peyer-Pflastern für 3 Stunden mit Zeitrafferfotografie. Diese Technik kann klären, wie die Dynamik von Lymphozyten unter entzündlichen Bedingungen beeinflusst wird.

Mikroskopische Beobachtung der Lymphozytendynamik in Rat Peyers Patches

Melanom ist eine sehr aggressive Krankheit, die sich schnell auf andere Organe ausbreitet. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebung in Verbindung mit 3D-Rendering zur Überwachung des Volumens der Leistenlymphknoten im Braf/Pten-Mausmodell des metastasierenden Melanoms.

Analyse des Lymphknotenvolumens mittels Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebung im gentechnisch veränderten Mausmodell des Melanoms von Braf/Pten

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur magnetischen Bead-basierten Isolierung von murinen Endothelzellen aus dermalen lymphatischen Kapillaren beschrieben. Die isolierten lymphatischen Endothelzellen können für nachgelagerte In-vitro-Experimente und Proteinexpressionsanalysen verwendet werden.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

Erfahren Sie die Photokonversion zur quantitativen Analyse des Leukozyten-Egress aus muriner Haut und Tumoren mittels Kaede-Transgen-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung endogener Immunzellpopulationen in vivo.

Quantifizierung der Leukozyten Egress über Lymphgefäße aus murinen Haut und Tumoren

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