Name: Gründung von Zelllinien überexprimiert DR3 um die Apoptotic Antwort auf Anti-mitotische Therapeutika zu bewerten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung stabiler Zelllinien mit retroviraler Transfektion zur Überexpression von DR3 in HT29-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung apoptotischer Mechanismen bei antimiotischen Therapeutika.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des 53110000117 (zu g.w.) und 043222019 (zu X.W.) an der Tsinghua University unterstützt.

Bitte beachten Sie, dass alle Maus-Experimente, die hier beschrieben wurden genehmigt und im Einklang mit den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der Tsinghua University durchgeführt.
1. Generation DR3 Überexpression Zell-Linien
<ol><li>Das Plasmid für DR3 Ausdruck (pMXs IRES-DR3-Flag "") zu konstruieren, durch Einfügen von Full-length DR3 cDNA mit 3 x Flagge am C-Terminus in retroviral Vektor Blasticidin IRES pMXs an den Standorten der Beschränkung der BamHI/XhoI.</li>
	<li>Plat-A Zellen in 60 mm Schalen mit 4 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) wachsen. Am nächste Tag, wenn die Zellen erreichen 80-90 % Zusammenfluss, transfizieren Zellen mit 2 μg des Plasmids pMXs-IRES-DR3-FLAG verwenden Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) gemäß des Herstellers manuelle20.</li>
	<li>Nach 72 h sammeln des Überstands, Filtrat der Medien mit einem 0,45 μm Sterilfilter und halten die virale Aussetzung im Dunkeln bei 4 ° C.</li>
	<li>Wachsen Sie HT29-Zellen in DMEM in einer 60 mm Petrischale und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2.</li>
	<li>Infizieren Sie am nächsten Tag, wenn die Zellen 30 % - 50 % Zusammenfluss erreichen, die Zellen mit 2 mL virale Suspension in Anwesenheit von 8 μg des 1,5-Dimethyl-1,5-Diazaundecamethylene Polymethobromide pro Milliliter der viralen Suspension. Aspirieren Sie nach 4-6 h Inkubation bei 37 ° C die virale Aussetzung, 4 mL frische DMEM hinzufügen und die Schüssel in den Inkubator zurück.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Medien aus der Gerichte 24 h Postinfection und waschen Sie Zellen mit 2 mL PBS vorgewärmte sorgfältig zu. Fügen Sie 1 mL Trypsin-EDTA zu den Zellen und bei 37 ° C für 3 min inkubieren.</li>
	<li>Stoppen Sie nach der Beobachtung unter dem Mikroskop bei 10facher Vergrößerung, die meisten Zellen getrennt haben die Trypsinization mit 2 mL des kompletten DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS). Sammeln Sie die Zellsuspension in einer 15 mL Tube und Zentrifugieren der Zellen bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL DMEM. Mischen Sie gut durch sanft auf und ab pipettieren. Verdünnen Sie die Zellen durch Faktoren von 30, 100 und 300. Samen der Zellen in 150 mm Schalen mit 20 mL DMEM mit 1 µg/mL Blasticidin. ~ 1-2 Wochen bei einem 37 ° C Inkubator mit 5 % CO2 inkubieren.</li>
	<li>Während dieser Zeit beobachten Sie die Kolonien jeden Tag mit einem inversen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Markieren Sie die gut isolierten Kolonien an der Unterseite der Schale, wenn der Kolonie-Durchmesser ca. 1-2 mm beträgt.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 3 mL vorgewärmten PBS. Fügen Sie 2 Milliliter Trypsin-EDTA in ein 60 Millimeter-Teller. Verwenden Sie sterile Pinzetten abholen autoklaviert sterile Klonen Zylinder, und legen Sie sie in die 60 Millimeter-Teller. Abholung der Zylinder mit Trypsin-EDTA und legen Sie sie sanft über den markierten Kolonien. Stellen Sie sicher alle Klonen Zylinder nur eine Kolonie enthält und Kontamination mit nahe gelegenen Kolonien vermeiden.</li>
	<li>Das Gericht in den Inkubator für 3 Minuten zurück.</li>
	<li>Überprüfen Sie nach 3 min die Zellen unter dem Mikroskop bei 10facher Vergrößerung zu sehen, ob sie getrennt haben. Wenn die Zellen erhöht haben, fügen Sie 70 μL Kulturmedium für jeden Zylinder, die Trypsin zu inaktivieren hinzu. Mischen Sie vorsichtig die Zellsuspension mit einer 200 μl Pipette. Achten Sie darauf, nicht den Zylinder während dieses Prozesses zu bewegen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension von jeder Kolonie auf zwei 24-Well-Platten mit 1 mL DMEM pro Bohrloch. Fügen Sie 30 μl Zellsuspension pro Bohrloch in der Platte A und 70 μL in den entsprechenden Bohrungen in Platte B. Label die Platten richtig und setzen Sie sie wieder in den Inkubator.</li>
</ol>2. Überprüfung der Überexpression Zelllinie DR3
<ol><li>Wenn die Zellen in Platte B am Zusammenfluss von 90 % sind, entfernen Sie das Medium und sorgfältig waschen der Zellen mit 1 mL PBS. Vollständig zu entfernen Sie PBS und lösen Sie die Zellen mit 50 μL von 1 x SDS-PAGE laden Puffer. Übertragen Sie die Zelle Lysates von 24-Well-Platte auf 1,5 mL Zentrifuge Röhren und Kochen Sie die Proben 10 min bei 100 ° C.</li>
	<li>Laufen Sie die Proben auf 10 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) Gel mit einer konstanten Spannung von 80 V für 15 min und dann bei 120 V für 1 h.</li>
	<li>Übertragen das Protein zu einer Polyvinylidene Fluorid (PVDF) Membran durch nasse Übertragung bei einem konstanten Strom von 400 mA für 2 h.</li>
	<li>Testausdruck DR3 in verschiedene Klone mit Anti-FLAG Antikörper, Verwendung der Wildtyp HT29-Zellen als Negativkontrolle (Abbildung 1). Verdünnen Sie den primären Antikörper mit einem Faktor von 5.000 bei 5 % fettfreie Milch, die in TBST aufgelöst wird (Tris-gepufferte Kochsalzlösung enthält 0,1 % Tween-20). Über Nacht inkubieren Sie die Membran mit FLAG Antikörper bei 4 ° C.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran mit TBST durch Schütteln es auf einen decoloring Shaker bei 200 u/min bei RT. Aktualisierung TBST alle 5 min für eine Gesamtmenge von 15 min Waschzeit.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit Anti-Maus Sekundärantikörper verdünnt um den Faktor 10.000 in 5 % fettfreie Milch bei 4 ° C für 5-6 h.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran wieder wie in Schritt 2.5 beschrieben.</li>
	<li>Erkennen den FLAG-Ausdruck mit westlichen verstärkte Chemilumineszenz (ECL) Substrat und Bild die Membran mit einem Gel-Dokumentations-System (siehe Tabelle der Materialien). Identifizieren Sie die Klone DR3 als positive Klone auszudrücken.</li>
	<li>Übertragen Sie die Klone in Platte A, die positive Klone in Platte B zu einem 6-Well-Platte entsprechen und weiterhin die Zellen bis in 10 cm Gerichte wachsen zu verstärken. Gefrorenen Vorräte an die Zellen wachsen aus positive Klone zu machen und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.</li>
</ol>3. Bewertung der apoptotische Reaktion der Zellen auf Antimitotic Agents
Hinweis: Diazonamide ist eine neue Klasse von marine Naturprodukt, das hat bemerkenswerte Ereignisse in hemmen Wachstum von Krebszellen, die anderen Tubulin destabilisieren Agenten21widerspiegelt. Seine Wirkungsweise bleibt jedoch unklar. Um die zelluläre Reaktion der Zellen auf antimitotic Agents zu testen, wurden Paclitaxel und Diazonamide zur Behandlung von Wildtyp HT29 und HT29-DR3 Zellen. Die Medikamente wurden in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), 10 mM Bestände machen gelöst und dann weiter zu verschiedenen Konzentrationen verdünnt: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1.000 nM, 3.000 nM und 10.000 nM in DMSO.
<ol><li>Sammeln Sie HT29 und HT29-DR3 Zellen durch Trypsinization. Messen Sie die Zelldichte über eine automatische Zelle Zähler. Dann Samen Sie Zellen in 12-Well-Platten in DMEM bei einer Dichte von 3 x 104 Zellen pro Bohrloch. Am nächsten Tag, fügen Sie 10 nM Diazonamide und verwenden Sie 1 % DMSO als Negativkontrolle zu. Nach 48 h Behandlung Bild der Zellen unter dem Mikroskop bei 10 X Vergrößerung (Abbildung 2).</li>
	<li>Samen HT29 und HT29-DR3 Zellen in 96-Well-Platten in DMEM bei einer Dichte von 3 x 103 Zellen pro Bohrloch und lassen sie Sie über Nacht bei 37 ° c wachsen Fügen Sie Dosis-Eskalation Diazonamide Konzentrationen von 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM und 100 nM in jede Vertiefung, mit 1 % DMSO als Negativkontrolle.</li>
	<li>Messen Sie nach 48 h der Behandlung die Zellviabilität mit einem Lumineszenz-basierte Zelle Lebensfähigkeit Assay Kit laut Handbuch des Herstellers.<ol>
<li>Nehmen Sie die 96-Well-Platte aus dem Inkubator und bei RT für ca. 30 min. stehen lassen. Fügen Sie dann 50 µL Assays Reagenzien in jede Vertiefung schütteln die Platte bei RT für 2 min zur lyse der Zellen und inkubieren Sie die Platte bei RT für eine weitere 10 min. bestimmen die Lumineszenz von jedem Bohrloch mit einer Mikrotestplatte Reader (Abbildung 3). Hinweis: Die Zellviabilität stellt die relative Lumineszenzintensität jedes gut zu gut behandelt, die das Steuerelement mit 1 % DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie sechs Wochen alten weibliche BALB/c nackte Mäusen für eine in Vivo Studie14. Hinweis: Die Mäuse konnten unter bestimmten Pathogen-freies Bedingungen gehalten werden.<ol>
<li>Trypsinize HT29 und HT29-DR3 Zelle, und halten Sie dann die Trypsinization mit DMEM bei 37 ° c vorgewärmt Sammeln die Zellsuspension in ein 50 mL-Tube und Zentrifugieren der Zellen bei 1.000 u/min für 10 min bei RT. verwerfen der Überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in DMEM Medium ohne FBS. Die Zellen wieder Zentrifugieren und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit PBS-Puffer.</li>
		<li>Zählen der Zellen unter Verwendung eines automatischen Zelle Zählers und verdünnen die Zellen zu einer Konzentration von 2,5 x 107 Zellen/mL mit PBS. Generieren Sie Tumoren durch eine subkutane Injektion von 200 μl Zellsuspension HT29 oder HT29-DR3 in die Rechte Flanke der jede Maus (5 x 106 Zellen/Maus)22.</li>
		<li>Das Tumorvolumen (TV) mit Bremssättel jeden 2 d nach der Transplantation zu messen. TV Gerät mit folgender Formel berechnen: TV = 1 / 2L x b x B (hier, W: Tumor Breite, L: Tumor Länge). Wenn das durchschnittliche Tumorvolumen ca. 100 mm3erreicht, zufällig die Mäuse in der Steuerung oder in der behandelten Gruppe (n = 6 pro Gruppe) und die Behandlung einleiten.</li>
		<li>Paclitaxel Lösung wie folgt zubereiten. Erstens lösen Sie Paclitaxel in Ethanol bei 5 % des Gesamtvolumens komplett auf, und fügen Sie 5 % von der letzte Band der Polyoxyl 35 hydriertes Rizinusöl. Schließlich machen die restlichen 90 % des Volumens mit D5W (5 % Dextrose in Wasser, pH-Wert 7,4).</li>
		<li>Injizieren der Paclitaxel intravenös in einer Dosierung von 20 mg/kg 3 X pro Woche für zwei Wochen. Messen Sie das Volumen und Körper Tumorgewicht 3 x eine Woche14. Beenden Sie das Experiment zu und einschläfern Sie die Tiere, wenn das Körpergewicht verringert sich um 20 % oder das Tumorvolumen etwa 2.000 mm3 erreicht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Recillas-Targa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+strategies+for+gene+transfer%2C+expression%2C+knockdown%2C+and+chromatin+influence+in+mammalian+cell+lines+and+transgenic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals.</a> Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+BCR%2FABL-induced+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Animal models of BCR/ABL-induced leukemias.</a> Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+correction+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+ex+vivo+gene+therapy.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England.</a> Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).</li>
<li>Roesler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-generation%2C+self-inactivating+gp91%28phox%29+lentivector+corrects+the+oxidase+defect+in+NOD%2FSCID+mouse-repopulating+peripheral+blood-mobilized+CD34%2B+cells+from+patients+with+X-linked+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease.</a> Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).</li>
<li>Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+heart+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">The evolution of heart gene delivery vectors.</a> The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).</li>
<li>Zhou, J., Giannakakou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+microtubules+for+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry+-+Anti-Cancer+Agents%22%5BJournal%5D)">Targeting microtubules for cancer chemotherapy.</a> Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).</li>
<li>Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-targeted+agents%3A+when+mitochondria+become+essential+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).</li>
<li>Bhalla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-targeted+anticancer+agents+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis.</a> Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).</li>
<li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li>
<li>Bhat, K. M., Setaluri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-associated+proteins+as+targets+in+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).</li>
<li>Bates, D., Eastman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+destabilising+agents%3A+far+more+than+just+antimitotic+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).</li>
<li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-mitotic+chemotherapeutics+promote+apoptosis+through+TL1A-activated+death+receptor+3+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells.</a> Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).</li>
<li>Marsters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apo-3%2C+a+new+member+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family%2C+contains+a+death+domain+and+activates+apoptosis+and+NF-kappa+B%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B.</a> Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).</li>
<li>Chinnaiyan, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+by+DR3%2C+a+death+domain-containing+receptor+related+to+TNFR-1+and+CD95%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95.</a> Science. 274 (5289), 990-992 (1996).</li>
<li>Xu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+receptor+3+mediates+TNFSF15-+and+TNFalpha-induced+endothelial+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).</li>
<li>Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TL1A-induced+NF-kappaB+activation+and+c-IAP2+production+prevent+DR3-mediated+apoptosis+in+TF-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).</li>
<li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+of+TWEAK-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways of TWEAK-induced cell death.</a> Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning%3A+powerful+tools+in+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li>
<li>Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diazonamide+toxins+reveal+an+unexpected+function+for+ornithine+delta-amino+transferase+in+mitotic+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).</li>
<li>Hassan, M. S., von Holzen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Model%3A+Xenograft+Mouse+Models+in+Esophageal+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma.</a> Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).</li>
<li>Potter, H., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection by electroporation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 9, Unit9 3 (2010).</li>
<li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effects+of+transfection%3A+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).</li>
<li>Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+responses+in+the+HeLa+proteome+subsequent+to+transient+plasmid-mediated+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).</li>
<li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+the+toxicogenomics+and+the+genotoxic+potential+of+a+cationic+lipid-based+gene+delivery+nanosystem+in+human+alveolar+epithelial+a549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verzollen.

In diesem Manuskript beschreiben wir eine Methode um HT29-DR3 stabilen Zelllinien zu generieren. HT29-DR3 Zellen stellen ein Modell für die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die DR3, Apoptose induziert durch antimitotic Agents beiträgt. Dieser Ansatz ist vielseitig und wiederholbar. Um den Erfolg des Verfahrens zu gewährleisten, müssen vier Schritte des Protokolls berücksichtigt werden. Zuerst, um einen hohen produzieren genug Virustiter empfiehlt es sich, DNA-Transfektion durchführen, wenn die Plat-A-Zellen am Z...

Heterologe Genexpression wird oft eingesetzt, um die Funktion von Genen von Interesse zu untersuchen. Zwei Methoden, transiente und stabile Transfektion werden hauptsächlich in den Zellen und Molekularbiologie verwendet, um ein Segment von DNA oder RNA in einem Host Zelle1,2einfügen. Transient transfizierten DNA oder RNA werden nicht an Tochterzellen, weitergegeben also die genetische Veränderung nur für einen kurzen Zeitraum beibehalten werden kann. Auf der anderen Seite sind stabil transfizierten Zellen exogenen Gene in das Wirtsgenom Zelle, Erhaltung der seinen Ausdruck in der Zell-Linie integriert. So ist beständigen Transfection eine Methode, die normalerweise reserviert ist für die Erforschung langfristiger Genregulation. Die stabile Zelllinie kann auch transplantiert werden, wie Xenotransplantate in Mausmodellen für in Vivo 3studieren. Beständigen Transfection kann in zwei Kategorien unterteilt werden: virale und nonviral. Im Vergleich zu nonviral Transfektion, kann virale Infektion Gene in einer größeren Vielfalt von menschlichen Zellen mit einer höheren Effizienz4,5,6,7übertragen. Darüber hinaus bietet eine stabile Zelllinie aus einem einzigen Klon den Vorteil klonalen Reinheit und Homogenität.
Unkontrolliertem Zellwachstum und Division sind die am meisten charakteristischen Merkmale von Krebs. Im klinischen sind antimitotic Agents die primären Behandlungen für viele Arten von Tumoren8. Jedoch können nicht einige erheblichen Einschränkungen der antimitotic Agents ignoriert werden. Zuerst diese Chemotherapien können auch normale Zellen zusammen mit den unerwünschten Krebszellen töten und somit schwere Nebenwirkungen8führen können. Zweite, antitubulin Medikamente sind nicht wirksam gegen alle Arten von Tumoren, trotz Tubulin der allgegenwärtige Ausdruck in einer Vielzahl verschiedener Gewebe als ein Zellskelett Protein9,10. Es ist unklar, warum antitubulin Agenten vielversprechende Wirksamkeit gegen zeigte Eierstock-, Lungen- und hämatologischen Krebserkrankungen in der klinischen Behandlung, aber nicht in Niere, Darm oder Pankreaskarzinome11. Schließlich können auch Patienten mit der gleichen Art des Tumors auf die Mitosehemmstoffen anders auf unvorhersehbare Weise reagieren. Gibt es möglicherweise ein wichtiger Effektor-Molekül, das die Empfindlichkeit der verschiedenen Patienten antimitotic Agents, wodurch die unterschiedlichen Ergebnisse in klinischen Behandlung12gesehen betrifft. Daher sollte die potenzielle differentielle Befindlichkeiten der Patienten antimitotic Behandlung berücksichtigt werden um therapeutische Interventionen13zu optimieren.
Ein Hochdurchsatz-Vollständiggenom SiRNA-Bibliothek-Bildschirm gezeigt, dass DR3 Zuschlag lichtempfindlichen Zellen resistent gegen antimitotic Drogen eine Rolle für DR3 Chemotherapie-induzierte Apoptose14verwickelt sein könnte. Als Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor (TNFR)-Superfamilie berichtet DR3 Zellapoptose in verschiedenen Systemen15,16,17,18zu vermitteln. So brachen wir zu stabilen Zelllinien überexprimiert DR3 um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, mit denen antimitotic Drogen Apoptose induzieren. Eine entsprechende Zellenmodell für das Studium DR3 Überexpression menschlichen Dickdarm-Krebs-Zelllinie HT29, arrangiert für die DR3-defizienten sein gefunden wurde. Darüber hinaus in der Klinik Doppelpunkt Krebsarten sind unempfindlich gegen Antimitotic Drogen19.
In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode, die die Generation eine stabile Zelllinie HT29-DR3 durch retroviral Infektion ermöglicht. Weiter zeigen wir wie man DR3 Ausdruck in diesen Zellen verwenden westliche Beflecken zu validieren und wie die Empfindlichkeit gegenüber antimitotic Agents beurteilt mithilfe einer Zelle Lebensfähigkeit Assay und morphologische Beobachtung. Die Zellen werden aus einzelnen Klone verstärkt und somit haben den Vorteil von einem homogenen genetischen Hintergrund. Darüber hinaus erlaubt die FLAG-Tag auf DR3 zur Visualisierung von zellulären DR3 durch Mikroskopie und Analyse von gen-Ausdruck und Protein-Interaktion durch biochemische Ansätze. Darüber hinaus kann die Zellen xenografted bei Mäusen, Tumorprogression als Reaktion auf Mitosehemmstoffen in Vivo14weiter zu analysieren.
Die hier vorgestellten HT29-DR3-Zellsystem angeboten ein wirksames Instrument für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der wie Mitosehemmstoffen Krebs Zellen14töten. Da Überexpression und Knockdown Zelllinien gemeinsamen Werkzeuge für das Studium der Genfunktion sind, kann dieses Protokoll leicht mit anderen Genen von Zinsen oder anderen Zelllinien angepasst und so verwandelte sich in einen extensiv genutzte Ansatz.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>C11965500BT</td><td>Ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicilin/Streptomycin</td></tr><tr><td>Lumineszierender Zellviabilitätsassay</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Selleck</td><td>S1150</td><td></td></tr><tr><td>pMXs-IRES-Blasicidin</td><td>Cell Biolabs</td><td>RTV-016</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>C14190500BT</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromid</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-134220</td>&nbsp<td></td></tr><tr><td>; Transfektionsreagenz</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-Sekundärantikörper</td><td>Jackson ImmumoResearch</td><td>115-035-166</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag-Antikörper</td><td>Sigma</td><td>F-3165</td><td></td></tr><tr><td>HT29 Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>plat-A Zelllinie</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Klonierungszylinder</td><td>Sigma</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>Multimode-Reader für die Zellbildgebung</td><td>Biotek</td><td>BTCYT3MV</td><td></td></tr><tr><td>CKX53 Inverses Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Zellkulturplatten</td><td>Nest</td><td>712001</td><td></td></tr><tr><td>60-mm-Zellkulturplatten</td><td>Nest</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>15-ml-Zentrifugenröhrchen</td><td>Nest</td><td></td><td></td>601052</tr><tr><td>0,22 μm m Sterilfilter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5810000327</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Weiße Polystyrol Mikrotiterplatte&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3903</td><td></td></tr><tr><td>Western ECL Substrat</td><td>BIO-RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000</td><td>GE Gesundheitswesen</td><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Entfärbender Schüttler&nbsp;</td><td>HINOTECH</td><td>TS-2000A</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierter Zellzähler</td><td>BIO-RAD</td><td>TC 20</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduziertes Serum Medium</td><td>Thermo</td><td>Fisher 31985070</td><td></td></tr></tbody></table>

gründung von zelllinien überexprimiert dr3 um die apoptotic antwort auf anti-mitotische therapeutika zu bewerten

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Die Funktion eines Gens von Interesse kann erreicht werden, durch die Manipulation der Ebene des Ausdrucks, wie seinen Ausdruck mit Knockdown Zelllinien verringern oder erhöhen ihren Ausdruck mit Überexpression Zelllinien. Transiente und stabile Transfektion sind zwei Methoden, die häufig für exogene Genexpression verwendet werden. Transiente Transfektion eignet sich nur für kurzfristige Ausdruck, während beständigen Transfection erlaubt exogenen Gene in das Wirtsgenom Zelle integriert werden, wo wird es kontinuierlich zum Ausdruck gebracht werden. Infolgedessen wird beständigen Transfection normalerweise für die Forschung in langfristige genetische Regulation eingesetzt. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll um eine stabile Zelllinie überexprimierenden tagged Tod Rezeptor 3 (DR3) DR3 Funktion erkunden zu generieren. Wir entschieden uns für einzelne Klone nach einer retroviralen Infektion um die Homogenität und Reinheit der stabilen Zelllinien erhalten. Die stabilen Zelllinien erzeugt unter Verwendung dieses Protokolls Rendern DR3-defizienten HT29-Zellen empfindlich gegenüber antimitotic Medikamente, somit Neuaufbau der Apoptotic Antwort in HT29-Zellen. Darüber hinaus das FLAG Tag auf DR3 kompensiert die Nichtverfügbarkeit von guten DR3 Antikörper und erleichtert die biochemische Untersuchung des molekularen Mechanismus mit dem antimitotic Agents Apoptose induzieren.

Eine Charakterisierung der HT29-Zellen stabil auszudrücken DR3 ist in Abbildung 1dargestellt. Die Klone express unterschiedlicher DR3, während die Wildtyp Zellen, die als Negativkontrolle dienen, exogene Genexpression nicht angezeigt werden. Hier zeigen wir nur fünf Klone, darunter Klonen 1 und 5 express DR3 auf höchste Niveau. Wir entschieden uns für Klon 1 und 5 für die folgenden Experimente.
Die ...

Aufbau einer stabilen Zelllinie überexprimierenden gen des Interesses Genfunktion zu studieren kann durch stabile Transfektion-Kommissionierung einzelnen Klone nach transfecting sie über retroviralen Infektion durchgeführt werden. Hier zeigen wir, dass HT29-DR3 Zelllinien erzeugt auf diese Weise die Mechanismen aufzuklären, welche, die Tod Rezeptor 3 (DR3) zum Mitosehemmstoffen-induzierten Apoptose beiträgt.

Gründung von Zelllinien überexprimiert DR3 um die Apoptotic Antwort auf Anti-mitotische Therapeutika zu bewerten

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

Überexexemitende Gene in Zellen ist ein wichtiger Weg, um die Genfunktion zu untersuchen. Durch stabile Transfektion mit dem Retrovirus können endogene Gene in das Wirtsgenom integriert und kontinuierlich exprimiert werden. Wir nahmen einzelne Kolonien der retroviralen Infektion auf und erzeugten stabile Zelllinien, die MIT FLAG-tags DR3 überdezentrale.Die Zelllinien kompensierten die Nichtverfügbarkeit guter DR3-Antikörper und lieferten hervorragende Werkzeuge für die DR3-Funktionsstudie nach in vitro und in vivo. Wir erzeugten die DR3-Überexpressionszelllinien, indem wir eine einzige Kolonie der retroviralen Infektion aufgriffen. Zelllinien aus einer einzigen Kolonie könnten die Homogenität und Reinheit erhalten.Darüber hinaus ist das Protokoll einfach und einfach zu handhaben. Um dieses Verfahren zu beginnen, wachsen Plat-A-Zellen über Nacht in 60-Millimeter-Gerichte mit vier Milliliter DMEM. Wenn Zellen 80 bis 90 % Konfluss erreichen, verwenden Sie Transfektionsreagenz, um sie mit zwei Mikrogramm des konstruierten Plasmids zu transfekieren, wie im Handbuch des Herstellers beschrieben.Nach 72 Stunden, sammeln Sie den Überstand. Mit einem 0,45 Mikrometer sterilen Filter, filtern Sie die Medien, und halten Sie die virale Suspension im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Als nächstes wachsen HT29-Zellen über Nacht in einer 60-Millimeter-Schale mit DMEM, die die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren.Wenn die Zellen 30 bis 50% Konfluss erreichen, infizieren Sie sie mit zwei Milliliterviral viraler Suspension in Gegenwart von acht Mikrogramm Polybren pro Milliliter viraler Suspension. Inkubieren Sie die infizierten Zellen bei 37 Grad Celsius für vier bis sechs Stunden. Dann, aspirieren Sie die virale Suspension.Fügen Sie vier Milliliter frisches DMEM hinzu und geben Sie das Gericht in den Inkubator zurück. Nach einer 24-stündigen Infektion die Medien von den Tellern entfernen und die Zellen vorsichtig mit zwei Millilitern vorgewärmter PBS waschen. Fügen Sie einen Milliliter Trypsin EDTA hinzu und brüten Sie die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Beobachten Sie mit einem Mikroskop bei der 10-fachen Vergrößerung die Zellen, um sicherzustellen, dass sich die meisten von ihnen gelöst haben. Danach fügen Sie zwei Milliliter DMEM mit 10%FBS hinzu, um die Trypsinisierung zu stoppen, und sammeln Sie die Zellsuspension in einer 15-Milliliter-Röhre. Zentrifuge bei 200 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur, und entfernen Sie den Überstand.Das Zellpellet in 10 Milliliter DMEM wieder aufhängen und sanft nach oben und unten pipette auf und ab, um es zu mischen. Anschließend verdünnen Sie die Zellen mit Faktoren von 30, 100 und 300. Samen der Zellen sind 150-Millimeter-Gerichte, die jeweils 20 Milliliter DMEM enthalten, die Blasticidin in einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter enthalten.Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für etwa ein bis zwei Wochen inkubieren. Während dieser Zeit verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung, um die Kolonien jeden Tag zu beobachten. Markieren Sie die gut isolierten Kolonien auf dem Boden der Schale, wenn der Durchmesser der Kolonien etwa ein bis zwei Millimeter beträgt.Wenn die Inkubationszeit abgeschlossen ist, das Medium ansaugen und die Zellen mit drei Millilitern vorgewärmtem PBS waschen. Fügen Sie zwei Milliliter Trypsin EDTA in eine 60-Millimeter-Schale. Verwenden Sie sterile Zangen, um autoklavierte sterile Klonzylinder aufzunehmen und in die Schüssel zu legen.Dann nehmen Sie die Zylinder, die jetzt jeweils etwa 30 Mikroliter Trypsin EDTA enthalten, und legen Sie sie vorsichtig über die markierten Kolonien. Bringen Sie das Gericht für drei Minuten in den Brutkasten zurück. Überprüfen Sie danach die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie sich gelöst haben.Wenn die Zellen angehoben haben, bei 70 Mikroliter Kulturmedium zu jedem Zylinder, um das Trypsin zu inaktivieren. Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um die Zellsuspension sanft zu mischen, um sicherzustellen, dass der Zylinder beim Mischen nicht bewegt wird. Legen Sie zwei 24-Well-Platten fest und beschriften Sie sie Mitblech A und Platte B. Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter DMEM hinzu.Fügen Sie 30 Mikroliter Zellsuspension zu jedem Brunnen der Platte A hinzu und fügen Sie 70 Mikroliter zu den entsprechenden Plattenbrunnen B hinzu. Legen Sie die Platten wieder in den Inkubator. Wenn die Zellen in Platte B bei 90% Zusammenfluss sind, entfernen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Milliliter PBS. Die PBS wurden vollständig entfernt, und fügen Sie 50 Mikroliter 1X SDS-PAGE-Ladepuffer hinzu, um die Zellen zu lysieren.Nach fünf Minuten die Zelle lysieren von der 24-Well-Platte auf 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhren. Kochen Sie die Proben bei 100 Grad Celsius für 10 Minuten. Führen Sie die Proben auf 10%SDS Gel mit einer konstanten Spannung von 80 Volt für 15 Minuten und dann bei 120 Volt für eine Stunde.Dann übertragen Sie das Protein durch Nasstransfer bei einem konstanten Strom von 400 Milliampere für zwei Stunden auf eine Polyvinylidenfluoridmembran. Verdünnen Sie den primären Antikörper um den Faktor 5.000 in 5% fettfreier Milch, die in TBST gelöst wird. Fügen Sie den FLAG-Antikörper in die Membran ein und brüten Sie über Nacht bei vier Grad Celsius.Mit einem Auf 200 Umdrehungen pro Minute eingestellten Entfärbungs-Shaker die Membran 15 Minuten lang mit TBST waschen und den TBST alle fünf Minuten erfrischen. Verdünnen Sie dann einen Anti-Maus-Sekundärantikörper um den Faktor 10 000 in 5% fettfreier Milch. Inkubieren Sie die Membran mit verdünntem Sekundärantikörper bei vier Grad Celsius für fünf bis sechs Stunden.Waschen Sie die Membran wieder auf dem Entfärbungsshaker, wie zuvor beschrieben. Verwenden Sie anschließend die westliche verbesserte Chemilumineszenz und ein Gel-Dokumentationssystem, um die Membran abzubilden und den FLAG-Ausdruck zu erkennen. Sammeln Sie zunächst sowohl HT29- als auch HT29-DR3-Zellen durch Trypsinisierung, und verwenden Sie einen automatischen Zellzähler, um die Zelldichte zu messen.Säen Sie die Zellen in die Brunnen von 12-Well-Platten mit DMEM mit einer Dichte von 30.000 Zellen pro Brunnen, und inkubieren über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Am nächsten Tag 10 Nanomolar Diazonamid in jeden Brunnen geben, der Zellen enthält, die 1%DMSO als Negativkontrolle verwenden, und übertragen Sie die Platten zu einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Nach 48 Stunden Behandlung, bilden die Zellen unter dem Mikroskop mit der 10-fachen Vergrößerung.Als nächstes säen Sie sowohl HT29- als auch HT29-DR3-Zellen in die Brunnen der 96-Well-Platte mit DMEM mit einer Dichte von 3.000 Zellen pro Brunnen und lassen sie über Nacht bei 37 Grad Celsius wachsen. Am nächsten Tag, fügen Sie dosiseskalierende Diazonamid-Konzentrationen, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie nach 48 Stunden Behandlung ein auf Lumineszenz basierendes Zelllebensfähigkeits-Assay-Kit, um die Zelllebensfähigkeit zu messen.Entfernen Sie die 96-Well-Platte aus dem Inkubator und lassen Sie sie ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dann fügen Sie 50 Mikroliter Assay-Reagenzien zu jedem Brunnen hinzu und schütteln Sie die Platte für zwei Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu lysieren. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10 Minuten, und verwenden Sie dann einen Mikroplattenleser, um die Lumineszenz jedes Brunnens zu bestimmen.Die Charakterisierung von HT29-Zellen, die DR3 stabil exprimieren, zeigt, dass die Klone unterschiedliche DR3-Werte ausdrücken, während die Wildtypzellen keine exogene Genexpression zeigen. Die Gene eins und fünf sind als Ausdruck der höchsten DR3-Werte angesehen und werden daher für weitere Experimente ausgewählt. Die Morphologie der HT29- und HT29-DR3-Zellen wird nach 48 Stunden Behandlung mit Diazonamid beobachtet.HT29-DR3-Zellen zeigen offensichtliche Apoptose mit einer gebrochenen Zellmembran und Zellablagerungen. HT29-Zellen zeigen jedoch nur mitotische Abnahme mit intakten Zellen, die eine aufgerundte Zellform aufweisen. Die Zelllebensfähigkeit dieser Zelltypen wird dann nach 48 Stunden Behandlung mit drei Nanomolaren Diazonamid bestimmt.HT29-DR3-Zellen haben einen Zelltod von über 80%, während die elterlichen HT29-Zellen nur eine leichte Reaktion in Form von mitotischem Arrest zeigen. Dies deutet darauf hin, dass die Überexpression von DR3 den Diazonamid-induzierten apoptotischen Weg in diesen Zellen rekonstituiert hat. Richtige serielle Verdünnungen sind wichtig, um eine optimale Dichte von einzelnen Klonen zu erhalten.Es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass jeder Klonzylinder nur eine Kolonie enthält und um zu vermeiden, dass nahegelegene Kolonien kontaminiert werden. Die DR3-überexexemitten Zelllinien erleichterten die biochemische Untersuchung der molekularen Mechanismen in vitro. Wir erzeugten HT29-DR3 Xenografts durch subkutane Injektion von HT29-DR3-Zellen, und es half, die Mechanismen der antimitotischen Wirkstoffe-induzierte Apoptose in vivo zu erarbeiten.Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Gene von Interesse in anderen Zelllinien zu studieren. Darüber hinaus ist Gen Knockout eine weitere Möglichkeit für funktionelle Studien, und unser Protokoll kann an die Gen-Knockdown-Systeme angepasst werden. Daher ist es allgemein anwendbar auf erhellengene Genfunktionen.Denken Sie daran, das Virus-Relay an den Müll zu bestimmten Containern zur Sicherheitsentsorgung zu legen.

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Research

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