Gemultiplexten fluoreszierende immunhistochemische Färbung, Bildverarbeitung und Analyse in histologischen Proben des Lymphoms

Lymphome sind histologisch komplexe Tumoren. Daher bietet multiplexierte fluoreszierende Immunhistochemie Vorteile gegenüber der herkömmlichen chromogenen Immunohistochemie, um Marker zu untersuchen, die für die Tumorzellen und die Mikroumgebung von Interesse sind. Diese Technik hat das Potenzial, die Bewertung von Antikörper-basierten Färbungen in histologischen Lymphomproben zu standardisieren, ein Prozess, der aufgrund der Komplexität der Tumormikroumgebung historisch schwierig war.

Insbesondere multiplexierte fluoreszierende Immunhistochemie und Spektralbildgebung ermöglicht die quantitative Messung mehrerer Flecken innerhalb eines einzigen Dias, wodurch die Beurteilung der Antigen-Co-Expression und der räumlichen Beziehung innerhalb des klinischen Materials ermöglicht wird. Beginnen Sie mit dem Eintauchen der entwachsten und rehydrierten Dias in einen Standard-Antigen-Abrufpuffer in einer Mikrowelle, die Glas speichern und wärmeinduzierte Epitop-Retrieval in einer geeigneten Mikrowelle durchführen. Führen Sie zusätzliche Runden des Mikrowellen-Strippings basierend auf der Position des Antikörpers in der endgültigen Multiplexsequenz durch.

Zum Beispiel erfordert der vierte Antikörper drei zusätzliche Runden Mikrowellen-Stripping vor der Färbung. Nach Abschluss des Abisoliervorgangs verwenden Sie Zangen und hitzebeständige Handschuhe, um die Dias bei Raumtemperatur für mindestens 10 Minuten abkühlend auf destilliertes Wasser zu übertragen. Wenn die Antigen-Retrieval-Lösung abgekühlt ist, blockieren Sie die Gewebeperoxidase-Aktivität mit einem kommerziellen Peroxidaseblock für 10 Minuten, gefolgt von einer fünfminütigen Wäsche in tris-gepufferter Salin, oder TBS, und einem nicht ionischen Reinigungsmittel.

Blockieren Sie jede unspezifische Färbung mit einer 10-minütigen Inkubation im Sperrpuffer, gefolgt von inkubationsweise mit dem primären Antikörper von Interesse bei Raumtemperatur für 30 Minuten und drei fünfminütigen Waschungen mit TBS-D-Puffer. Anschließend die Proben mit einem geeigneten Meerrettichperoxidase konjugierten Sekundärantikörper für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, gefolgt von drei Waschungen im TBS-D-Puffer, wie gezeigt. Nach der letzten Wäsche ein geeignetes tyramidbasiertes fluoreszierendes Reagenz auf die Dias für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur auftragen, gefolgt von drei fünfminütigen TBS-D-Waschungen.

Führen Sie eine zusätzliche Mikrowellen-basierte Stripping, um die primären und sekundären Antikörper in frischen Antigen-Retrieval-Lösung zu entfernen, wie gezeigt. Am Ende der Bergung die Dias in destilliertem Wasser abkühlen und die Bereiche auf den Dias ohne Gewebe mit Labortüchern trocknen. Inkubieren Sie Rutsche mit Dappy für 10 Minuten bei Raumtemperatur gefolgt von drei TBS-D-Waschungen.

Trocknen Sie dann die Dias sorgfältig mit Labortüchern, ohne das Gewebe zu kontaktieren, und montieren Sie die Proben mit einem geeigneten Montagemedium für die Bildgebung. Wählen Sie für das Scannen von Monoplex-Dias die entsprechenden Filter aus den Fluorophoren aus, die für die Kennzeichnung der Proben verwendet werden, und untersuchen Sie jeden Marker und den entsprechenden Fluoreszenzkanal, um eine geeignete Belichtungszeit für die Gewinnung eines sauberen Signals zu ermitteln, wobei der Schwerpunkt auf der Gewebekomponente liegt, die das stärkste Signal für den Marker aufweisen sollte. Um einen vergleichungsübergreifender Pixelintensität zu ermöglichen, verwenden Sie die Einstellung der Live-Kamera, um die Belichtungszeit in jedem einzelnen Kanal anzupassen, bis sich keine überbelichteten Bereiche im Live-Kamerabild befinden.

Wenn alle Dias gescannt wurden, erfassen Sie simulierte helle Feldbilder, um sie visuell mit dem normalen immunhistochemischen Muster zu vergleichen und um festzustellen, ob das Färbemuster korrekt ist. Um Gewebe-Mikroarray-Dias zu scannen, verwenden Sie den Gewebe-Mikroarray-Scan-Modus im Bildgebungssystem und einen geeigneten Autofokus-Algorithmus. Lassen Sie die Dias für ganze Gewebeteilfolien von einem qualifizierten Pathologen überprüfen, um optimale Bilder aus den repräsentativsten Tumorbereichen auszuwählen.

Bevor Sie mit der Analyse beginnen, wählen Sie einen Tumormarker aus, um die für die Analyse von Interesse endenden Zellen zu identifizieren. Lassen Sie einen Pathologen die Bilder überprüfen und entscheiden, ob eine Gewebesegmentierung erforderlich ist. Wählen Sie bei Bedarf die entsprechenden Kontrollbereiche für die Segmentierung aus und überprüfen Sie, ob die Bildanalysesoftware solche Regionen korrekt identifizieren kann.

Lassen Sie nach der Zellsegmentierung den Pathologen die Segmentierungskarte überprüfen, um die Genauigkeit des beabsichtigten Segmentierungsansatzes sicherzustellen, und überprüfen Sie einzelne Bilder, um festzustellen, ob die Zellsegmentierung angemessen ist oder ob eine zusätzliche Gewebesegmentierung erforderlich ist, um Regionen auszuwählen, die für Tumorzellen, Stroma und Nekrose angereichert sind. Bestimmen Sie dann den optischen Intensitäts-positiven Cutoff-Wert für jeden Marker in Verbindung mit dem Pathologen und generieren Histogramme in einem geeigneten Statistik-Softwareprogramm, um die Frequenzverteilung der Markerintensität pro Zelle zu analysieren. Um prozentuale Daten für bestimmte Interessenspunkte innerhalb definierter Zellen zu generieren, fügen Sie eine Pivot-Tabelle in das Datenblatt ein, und wählen Sie Summe aus, um den Positivitätsprozentsatz einer einzelnen Interessenmarkierung zu berechnen.

Die Gesamtzahl der Marker-positiven Zellen dividiert durch die Gesamtzahl wird berechnet. Das Ergebnis ist der Marker-positive Zellprozentsatz mit einem Kern oder einer Studiennummer. Um numerische Daten zu generieren, erhalten Sie die mittlere Intensität jedes Markers, der für alle Zellen in einer Stichprobe untersucht wird, um die mediane normalisierte Anzahl für jeden Marker jedes Kerns oder jeder Studiennummer zu extrahieren.

Hier werden repräsentative multiplexfluoreszierende immunhistochemische Bilder für eine diffuse große B-Zell-Lymphomprobe mit c-MYC- und BCL2-Genumlagerung gezeigt. Simulierte immunhistochemische Hellfeldbilder zeigen ein ähnliches Tumormarker-Färbungsmuster. Die Anwendung von multiplexfluoreszierenden immunhistochemischen Bildern auf ein T-Zell-Panel bei angioimmunoblastischen T-Zell-Lymphomen zeigt die Zellheterogenität der Tumorprobe.

Hier werden die Optimierung einer Tonsillenkontrollprobe und die daraus resultierende Datenanalyse dargestellt. Eine Vielzahl von Bildanalyse-Software-Programme können nach dem Unmix-Schritt verwendet werden, um Markerexpression und Lokalisierung in Tumorzellen und der Tumormikroumgebung zu quantitieren. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, die Koexpression mehrerer Marker innerhalb bestimmter Zelltypen in einzelnen Gewebeabschnitten des Lymphoms zu untersuchen.

Achten Sie darauf, hitzeinduzierte Verletzungen während der Mikrowaving-Schritte zu verhindern und sich der Sturzrisiken während der Scanschritte bewusst zu sein, die im Deck durchgeführt werden.