Name: Eine Immunohistopathologic Untersuchung der Folat-Rezeptor Beta Makrophagen und vaskuläre immun Mikroumgebung in riesige Zelle Arterienentzündung Profil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Erfahren Sie die immunhistochemische Analyse von Folat-Rezeptor Beta-Makrophagen in Arteria temporalis-Geweben bei Riesenzellarteriitis. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung immunologischer Infiltrate und potenzieller therapeutischer Ziele.

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Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung von Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, der Abteilung Rheumatologie/Abteilung Medizin und Molekularbiologie und histologischen Zentrallabor, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.

Alle beschriebene Methoden wurden von der Penn State Institutional Review Board genehmigt.
(1) histopathologische Vorbereitung und Verarbeitung nach Erhalt Schläfenarterie Biopsie
Hinweis: Die Schläfenarterie Biopsie (TAB) wird durch einen qualifizierten Chirurgen unter örtlicher Betäubung und sterilen Bedingungen durchgeführt. Nach chirurgisch Erhalt einen 3 cm arteriellen Abschnitt auf der mehr betroffenen Seite, die Probe ist in Formalin sofort für 24 h behoben, in 3 bis 4 mm Abschnitte unterteilt und eingebettet in Paraffin, sorgfältige Aufmerksamkeit auf die korrekte Ausrichtung des Gewebes im Block, ist dann bei Raumtemperatur gelagert. Probe-Auswahl erfolgt nach Überprüfung der medizinischen Aufzeichnungen. Die Diagnose basiert auf der American College of Rheumatology 1990 Kriterien, wonach Themen 3 5 Domains erfüllen: Alter > 50 Jahre, neue Kopfschmerzen, Schläfenarterie Zärtlichkeit, einer Erythrozyten Sedimentation Rate > 50 mm/Stunde von Westergren-Methode und eine abnorme Registerkarte. Aus Sicherheitsgründen müssen Schutzhandschuhe getragen werden zu allen Zeiten bei der Handhabung der Proben, Chemikalien und Antikörper.
<ol><li>Geschnitten Sie von den eingebetteten Blöcken 4-5 µm dicke Abschnitte mit einem Mikrotom. und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin (H & E). Verwenden Sie ein Steuerteil des ausgewählten Normalgewebe zur Qualitätssicherung.</li>
	<li>Schwimmer schneiden Abschnitte über einem warmen Wasserbad erwärmt bis 40 ° C zu Falten entfernen und mit einem beschichteten Objektträger mikroskopische abholen.  Platzieren Sie den Objektträger auf einem warmen Teller in einem 60 ° C Backofen für 60 Minuten trocknen und die Einhaltung des Abschnitts der Folie zu erleichtern.</li>
	<li>Platzieren Sie den Objektträger auf einem warmen Teller in einem 60 ° C Backofen für 60 Minuten trocknen und die Einhaltung des Abschnitts der Folie zu erleichtern.</li>
	<li>Montieren Sie 3 Abschnitte auf Objektträger.</li>
	<li>Legen Sie Folien in eine vertikale Rack und über Nacht bei 37 ° C für 24 h trocknen.</li>
	<li>Platzieren Sie Folien in einem Behälter und Speicher bei 4 ° C.</li>
</ol>2. die immunhistochemische Vorbereitung, entwachsen, Antigen-Retrieval und Färbung15,18,19,20
<ol><li>Laden Sie Folien Folie einbauen. Führen Sie das Gestell durch Gerichte wie folgt: zweimal in 100 % Xylol für 5 Minuten mit 10 Sekunden sanft Agitation alle 30 Sekunden einmal in 100 % igem Ethanol unter 10 Sekunden rühren, einmal in 90 % Ethanol unter 10 Sekunden rühren, einmal in 70 % igem Ethanol unter 10 Sekunden rühren , und zweimal in doppelt destilliertem H2O unter 10 Sekunden rühren. Hinweis: Umgang mit Xylol und Aceton sollte in belüfteten Hauben, Inhalation und Atemwege Toxizität zu vermeiden erfolgen.</li>
	<li>Abrufen des Antigens durch die Übertragung der Rack in einem Glasbehälter mit 200 mL 10 Mmol/L, pH 6.0 Citrat-Puffer auf 95 ° c vorgewärmt Stellen Sie den Timer für 30 Minuten im Wasserbad, dann für 20 Minuten dann spülen unter fließendem Wasser für 5 Minuten bei Zimmertemperatur abkühlen.</li>
	<li>Entfernen Sie endogene Peroxidase-Aktivität durch Inkubation in 200 mL Wasserstoffperoxid 3 % für 10 Minuten. Waschen Sie Objektträger in 200 µL Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBSS) 3 Mal.</li>
	<li>Entfernen Sie die Folien aus dem Rack und tupfen Sie jeweils vorsichtig, um überschüssigen Puffer zu wischen. Zum Beizen, fügen Sie 200 µL der folgenden primären Antikörper, Deckel rutscht auf Folien hinzufügen und 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubieren hinzu: Anti-FRB Antikörper verdünnt 1:800 Monoklonaler Maus Anti-Human CD68, Verdünnung 1: 200 Polyklonale Kaninchen Anti-CD3 1: 100 Verdünnung Hinweis: Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten Teile der Plazenta waren auch verarbeitet wie in Schritte 2.1 bis 2.9 und inkubierten mit Anti-FRB18 beschrieben und als Positivkontrolle verwendet. Färbung Ergebnisse wurden von der Suche nach der optimalen Antikörperkonzentration erhalten und wurde von titrieren des Antikörpers in doppelter Verdünnungen (z.B. 01:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1:800, 1:1600) durchgeführt.</li>
	<li>Entfernen Sie Deckglas nach Inkubation und entsorgen. Folien 3 Mal für 2 Minuten mit TBSS abspülen, abtropfen lassen und wischen Sie überschüssiges Puffer.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Sekundärantikörper Lösung mit biotinylierte Rabbit/Maus Sekundärantikörper mit unconjugated primären Antikörper gebunden, Gewebe-Antigen reagieren. Deckgläsern auf Folien und 45 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie Deckglas nach Inkubation und entsorgen. Folien 3 Mal für 2 Minuten mit TBS abspülen, abtropfen lassen und wischen Sie überschüssiges Puffer.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL des Diaminobenzidine (DAB) + Substratpuffer (Imidazol HCl)-Chromogen System und inkubieren Sie für 10 Minuten Färbung Muster zu visualisieren. Waschen Sie mit TBSS dann in fließendem Leitungswasser für 10 Minuten.</li>
	<li>Gegenfärbung mit Hämatoxylin für 3 Minuten.</li>
	<li>Montieren Sie die Folien, indem 70 µL Eindeckmedium auf der Oberfläche der Folie. Langsam kippen Sie das Deckglas auf den Eindeckmittel und vermeiden Sie Luftblasen, wie Sie es einrastet unten. Warten Sie 24 Stunden trocknen lassen.</li>
</ol>(3) histologischen und immunhistochemische (IHC) Analyse
Untersuchen Sie die H & E und IHC Abschnitte von GCA positive und normalen Probanden mit einem Lichtmikroskop gefärbt.
<ol><li>
Für die H & E gefärbt Abschnitte:
	<ol>
<li>Beurteilen Sie die Gefäßarchitektur und identifizieren Sie Endothelzellen in der Tunica Intima, glatten Muskelzellen in der Tunica Media und Fibroblasten und Vasa Vasorum in Tunica Adventitia21,22zu.</li>
		<li>GCA Funktionen, darunter Lymphozyten und Makrophagen/Histiocyte Infiltration, zelluläre Hyperplasie und internen elastischen Lamina Abbau zu identifizieren.</li>
		<li>Analysieren Sie das Lymphohistiocytic Infiltrat durch Identifizierung und Quantifizierung der Anzahl von Makrophagen im Verhältnis zu den Lymphozyten. Das Ausmaß der Störung der internen elastischen Lamina und hyperplastische Veränderungen in ihren Wohnsitz Zellen zu beurteilen und zu vergleichen mit Steuerelementen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Für die IHC gebeizt Abschnitte:
	<ol>
<li>Untersuchen Sie die Färbung Muster der FRB, nehmend von seinen Ausdruck durch eine bestimmte Art oder Arten von Zellen und deren Verteilung innerhalb der vaskulären Schichten und ihre Beziehung auf das gesamte Immunsystem Infiltrat, total Makrophagen Marker, Anti-CD68 und die Pfanne Lymphozyten Marker anti-CD3.</li>
		<li>Quantifizieren des Ausdrucks der FRB, CD68 und CD3 Zellen durch zählen der positiv gefärbten Zellen auf 10 mehrere zufällig ausgewählte Hochleistungs-Felder (hpf) und notieren Sie die Mittel. Hinweis: Identifizierung von diesen normalen und pathologischen Zellen und Strukturen wurden von einem zertifizierten Herz-Kreislauf-Pathologen (j.m.) durchgeführt und Rheumatologen (S.A.A) und die Ergebnisse für alle Fälle aufgezeichnet wurden.</li>
		<li>Aufnehmen Sie repräsentative Bilder mit einer Digitalkamera. Hinweis: Nach diesen Schritten kann verbleibende Aliquote bei-80 ° c gelagert werden</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKlippel%2C+JH+%22Primer+on+the+rheumatic+diseases%22">Primer on the rheumatic diseases</a>. , Springer Science & Business Media. (2008).</li>
<li>Weyand, C. M., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+mechanisms+in+medium+and+large-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis.</a> Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).</li>
<li>Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunopathology+of+giant+cell+arteritis%3A+diagnostic+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications.</a> Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).</li>
<li>Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+and+Th1+T-cell+responses+in+giant+cell+arteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis.</a> Circulation. 121, 906-915 (2010).</li>
<li>Mahr, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjunctive+methotrexate+for+treatment+of+giant+cell+arteritis%3A+an+individual+patient+data+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis.</a> Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).</li>
<li>Hoffman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicenter%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+trial+of+adjuvant+methotrexate+treatment+for+giant+cell+arteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis.</a> Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).</li>
<li>Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trial+of+Tocilizumab+in+Giant-Cell+Arteritis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).</li>
<li>Milman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tocilizumab+increased+sustained+glucocorticoid-free+remission+from+giant+cell+arteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis.</a> Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63(2017).</li>
<li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+folate+receptor+is+induced+during+macrophage+activation+and+can+be+used+to+target+drugs+to+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages.</a> Blood. 113 (2), 438-446 (2009).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor-beta+constitutes+a+marker+for+human+proinflammatory+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).</li>
<li>Salazar, M. D., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+folate+receptor%3A+what+does+it+promise+in+tissue-targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).</li>
<li>Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+development+of+folic-acid-based+receptor+targeting+for+imaging+and+therapy+of+cancer+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).</li>
<li>Puig-Kroger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor+beta+is+expressed+by+tumor-associated+macrophages+and+constitutes+a+marker+for+M2+anti-inflammatory%2Fregulatory+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages.</a> Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).</li>
<li>Nakashima-Matsushita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+folate+receptor+beta+and+its+possible+role+in+methotrexate+transport+in+synovial+macrophages+from+patients+with+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis.</a> Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).</li>
<li>vander Heijden, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor+beta+as+a+potential+delivery+route+for+novel+folate+antagonists+to+macrophages+in+the+synovial+tissue+of+rheumatoid+arthritis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients.</a> Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).</li>
<li>Jansen, G., Peters, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+in+folate+receptors+and+transporters%3A+implications+for+disease+and+treatment+of+immune+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pteridines%22%5BJournal%5D)">Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer.</a> Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).</li>
<li>Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+analysis+of+folate+receptor+beta+expression+and+distribution+in+giant+cell+arteritis+-+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study.</a> American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).</li>
<li>Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+folate+receptor+isoforms+in+normal+and+malignant+tissues+in+vivo+and+in+established+cell+lines.+Physiologic+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications.</a> Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).</li>
<li>Reiner, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+molecular+biology.+Macrophages+and+dendritic+cells.+Methods+and+protocols.+Preface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface.</a> Methods in Molecular Biology. 531, v-vi (2009).</li>
<li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13(2008).</li>
<li>Pawlina, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawlina%2C+W+%22Histology%3A+A+text+and+atlas+with+correlated+cell+and+molecular+biology%22">Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology</a>. , Walters Kluwer. (2016).</li>
<li>Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+V+%22Robbins+and+Cotran+pathologic+basis+of+disease%22">Robbins and Cotran pathologic basis of disease</a>. , Elsevier Saunders. (2015).</li>
<li>Dabbs, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDabbs%2C+DJ+%22Diagnostic+immunohistochemistry%22">Diagnostic immunohistochemistry</a>. , Elsevier, Inc. (2019).</li>
<li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor+type+beta+is+a+neutrophilic+lineage+marker+and+is+differentially+expressed+in+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia.</a> Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).</li>
<li>Holzapfel, G. A. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolzapfel%2C+GA+%22Collagen.+Structure+and+Mechanics%22">Collagen. Structure and Mechanics</a>. Fratzl, P. , Springer-Verlag. Heidelberg. 285-324 (2008).</li>
<li>Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathologic+Markers+Determining+Prognosis+in+Patients+with+Treated+or+Healing+Giant+Cell+Arteritis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis.</a> American Journal of Ophthalmology. , (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

GCA ist die häufigste Vaskulitis bei Erwachsenen, und pathologische Wahrzeichen steht beispielhaft für eine wirkungsvolle Kombination von T-Helfer-Lymphozyten und aktiviert Makrophagen, die auch in andere granulomatöse Erkrankungen oder Vasculopathies wie Sarkoidose gefunden werden können und granulomatöse Polyangiitis2,3. In GCA, die Schläfenarterie bietet eine gute Darstellung einer Mittel-groß dimensionierte Arterie und die TA-Biopsie gibt eine große Probe, di...

Riesige Zelle Arterienentzündung (GCA) ist eine entzündliche Erkrankung des mittleren bis großen Arterien, targeting der Aorta und seine Niederlassungen und ältere Erwachsene betroffen. Es stellt mit leichten bis schweren ischämischen Komplikationen wie Kopfschmerzen, Kieferschmerzen, Verlust der Sehkraft, Schlaganfall und Gewebe Gangrän. Die Diagnose wird durch hohe Entzündungsmarker wie Erythrozyten Sedimentation Rate (ESR) und ein eindeutiges histologischen Muster auf der Schläfenarterie Biopsie (TAB)1bestätigt. GCA ist die häufigste Vaskulitis Erwachsenen, und die Zugänglichkeit der Schläfenarterie erhalten für die Diagnose stellt einen Vorteil gegenüber anderen Vasculopathies, so dass man seine Pathogenese leichter zu studieren. Die typische Ergebnisse auf Registerkarte "beinhalten ein Infiltrat von Makrophagen/Histiozyten und T-Lymphozyten über alle vaskulären Schichten der Tunica Intima, Media und Adventitia mit gleichzeitiger Zerstörung der elastischen Lamina, die normalerweise diese trennt gefunden Fächer2. Die aktuelle Beweise zeigt, dass GCA ein unbekanntes Antigen beinhaltet, die dendritische Zellen in der vaskulären Adventitia aktiviert, gefolgt von der Einstellung des Helfers T (Th) Zellen, insbesondere Th1 und Th17-Subtypen, die absondern Interleukin-17 und Interferon-Gamma (IFG) beziehungsweise. IFG dann rekrutiert und aktiviert Makrophagen produzieren Zytokine und Proteasen. Dazu gehören Pro-inflammatorischen Zytokinen; einschließlich der IL-12, die wechselseitig Th1 Zellen, wodurch eine positive Rückkopplung aktiviert; Tumor-Nekrose-Faktor und Interleukin-6, die Arthritis und Fieber und Metalloproteasen, die verursachen Schäden der elastischen Lamina. Glukokortikoide (GC), die die Standardtherapie der chronischen darstellen, Steuern die Cytokine Bahnen teilweise mildernde Th17/IL-17, aber nicht die Th1/IFG Arm der Immunantwort3,4. Leider führt Absetzen des GC Rückfall der Erkrankung. Als alternative Modalität Methotrexat hat für GCA Behandlung umgewidmet worden, aber die gewünschte klinische Endpunkte wurden nicht konsequent erreicht, obwohl empfindlicher Biomarker für therapeutischen Überwachung5,6 nicht verwendet worden sein . Im Jahr 2017 wurde die Interleukin 6-Blocker, Tocilizumab, für die Behandlung von GCA genehmigt, wie effektiv Krankheitskontrolle und schonende Wirkung7,8Steroid nachgewiesen.
Bisher gibt es keine guten Biomarker für GCA. Infolgedessen ist es schwierig, zur Überwachung der Krankheitsaktivität und titrieren Dosen von verfügbaren Medikamenten, um negative Auswirkungen zu vermeiden und reduzieren die Belastung der Kosten für die Gesellschaft. Daher ist es unerlässlich, ein Kandidat Biomarker, dass korreliert mit Krankheitsaktivität, bieten neue Einblicke über die Pathogenese und Hilfe bei therapeutischen Entscheidungen suchen.
Die Dysregulation der Makrophagen Aktivierung ist ein kritischer Faktor in der Pathogenese der GCA. So kann ein wirksames Mittel zur Behandlung von GCA sein die gezielte Ausrichtung der aktivierten Makrophagen. Die Folsäure-Rezeptor-Beta (FRB) ist ein a1-Phosphatidylinositol-Glykoprotein, das auf der Zellmembran verankert ist in normalen Myelomonocytic Zellen, myeloische Leukämie-Zellen exprimiert und aktiviert Makrophagen. Die Liganden, Folsäure, ist ein wichtiges Vitamin in seiner reduzierten Form, der zelluläre DNA-Synthese, Methylierung und Reparatur9ermöglicht. FRB-Ausdruck wird in Autoimmunerkrankung und während der Karzinogenese induziert. Ihr Ausdruck ist auf der Oberfläche von Monozyten oder Pro-inflammatorischen M1 Makrophagen bei rheumatoider Arthritis oder auf entzündungshemmende M2-Makrophagen beschränkt in festen Orgel und myeloischen malignen Erkrankungen10,11,12 , 13. neben ihrer möglichen Rolle als Biomarker der aktivierten Makrophagen, FRB können selektive Drug Transport durch einen mehrstufigen Prozess, der mit die Rezeptorbindung, Folsäure, Antifolates oder Folat konjugiert Drogen an der Zelle beginnt Oberfläche, gefolgt von Verinnerlichung, Freigabe und eventuelle Lieferung des gewünschten Medikaments an die interne Zelle Maschinen12,14,15,16. Im Gegensatz zu FRB in Krebszellen exprimiert und aktiviert Makrophagen, FRB in normalen blutbildenden Zellen exprimiert ist nicht in der Lage zu binden Folate damit FRB/Folat-vermittelten Drug-Delivery FRB-positiven entzündlichen oder Krebszellen beschränkt.
In unserem vorangegangenen Studie zeigten wir zum ersten Mal, das FRB in GCA Makrophagen zum Ausdruck bringt und seinen Ausdruck korreliert mit CD68 + und Endothelin Rezeptor Beta-Makrophagen, die GCA Pathogenese17beitragen. In diesem Bericht beschreiben wir die histopathologische und immunhistochemische Methoden zur Beurteilung der FRB Makrophagen und analysiert den gesamten Lymphozyten und Makrophagen zählt, um Einblick in die FRB Position in der GCA vaskulären Landschaft.

<table><tbody><tr><td>Mikrotom</td><td>Reichert-Jung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>einfache und mattierte Objektträger und Deckgläser</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vertikales Gestell</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Olympus BX60&nbsp; Mikroskop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol-Aceton</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>in destilliertem Wasser</td><td></td><td></td><td>Konzentrationen 100%, 90%, 70%</td></tr><tr><td>Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)&nbsp;</td><td>Dako Wash BufferS3006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3% Wasserstoffperoxid in TBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidin (DAB)</td><td>Sigma Fast Tablettenset Chemisches</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Permount Eindeckmedium</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SP-15-100</td><td></td></tr><tr><td>Harleco Gill's III Hämatoxylin</td><td>Fiisher Scientific 23-750-019</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Harleco Eosin Y 1% alkoholische Stammlösung</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>23-749-977</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Zitronensäure-Monohydrat (pH 6,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyklonaler Kaninchen-Anti-Folat-Rezeptor beta&nbsp;</td><td>Manohar Ratnam</td><td></td><td>optimiert bei 1:800</td></tr><tr><td>Monoklonale Maus Anti-Human-CD68</td><td>Dako&nbsp;</td><td>M071801</td><td>optimiert bei 1:200</td></tr><tr><td>Polyklonales Kaninchen Anti-CD3</td><td>Agilent Dako</td><td>A0452</td><td>optimiert bei 1:100</td></tr><tr><td>Polymer Ziege Anti-Kaninchen/Maus Sekundärantikörper</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazentagewebe</td><td></td><td></td><td>&nbsp; für FRB-Positivkontrolle</td></tr></tbody></table>

eine immunohistopathologic untersuchung der folat-rezeptor beta makrophagen und vaskuläre immun mikroumgebung in riesige zelle arterienentzündung profil

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Riesige Zelle Arterienentzündung (GCA) ist eine chronische immunvermittelte Erkrankung des Mittel-groß dimensionierte Arterien, die ältere Erwachsenen betrifft. GCA Manifeste mit Arthritis und okklusive Symptome von Kopfschmerzen, Schlaganfall oder vision Verlust. Makrophagen und T-Helfer-Lymphozyten die Gefäßwand zu infiltrieren und eine Pro-inflammatorische Reaktion, die zu Schiff Schaden und Ischämie führen zu produzieren. Bisher gibt es keine GCA-Biomarker, die Krankheit Aktivität und Guide therapeutische Reaktion überwachen können.
Folat-Rezeptor-Beta (FRB) ist ein Glycosylphosphatidylinositole Protein, das auf Zellmembranen verankert ist und normalerweise ausgedrückt in der Myelomonocytic Linie und in der Mehrzahl der myeloischen Leukämie-Zellen sowie in Tumor und rheumatoide synovialen Makrophagen, wo seinen Ausdruck mit der Schwere der Erkrankung korreliert. Die Fähigkeit der FRB, Folat Verbindungen, Folsäure-Konjugate und Strukturähnliche Medikamente binden hat es ein druggable Ziel in Krebs und entzündliche Erkrankung Forschung gemacht. Dieser Bericht beschreibt die histologischen und immunhistochemische Methoden verwendet, um Ausdruck und Verteilung der FRB in Bezug auf GCAimmunopathology zu bewerten.
Formalin fixiert und Paraffin-eingebetteten Schläfenarterie Biopsien von GCA und normalen Kontrollen waren voller Flecken mit Hämatoxylin und Eosin prüfen Gewebe Histologie und pathognomonische Funktionen ermitteln. Immunohistochemistry diente, FRB, CD68 und CD3 Ausdruck zu erkennen. Eine mikroskopische Analyse wurde durchgeführt, um die Anzahl der positiv gefärbten Zellen auf 10 ausgewählten high-power-Bereich Sektionen und ihre jeweiligen Standorte in der Arterienwand zu quantifizieren.
Lymphohistiocytic (LH) Entzündung begleitet von Intima-Hyperplasie und gestörten elastischen Lamina galt in GCA mit keine Kontrollen gefunden. Das LH Infiltrat bestand aus ca. 60 % Lymphozyten und 40 % Makrophagen. FRB Ausdruck beschränkte sich auf Makrophagen, bestehend aus 31 % der CD68 + Makrophagen Gesamtbevölkerung und in der Media und Adventitia lokalisiert. Keine FRB wurde in Steuerelementen gesehen.
Dieses Protokoll zeigt ein eindeutiges numerisches und räumliche Muster der FRB Makrophagen im Verhältnis zu der vaskulären immun Mikroumgebung in GCA.

Histologischen Befunde
Der H &amp; E Flecken in normalen Proben nachgewiesen normale arterielle Anatomie mit Endothelzellen in der Tunica Intima, glatten Muskelzellen in der Tunica Media und eine heterogene Kollagen-Matrix die Fibroblasten und Feeder Schiffe gehören genannt Vasa vasorum in Tunica Adventitia. Es gibt keine entzündlichen Infiltrat identifiziert. GCA positive zeitliche Arterien zeigte mäßige bis sc...

Das Protokoll zeigt die Verwendung der histologischen Untersuchung und immunhistochemische Profil Folat Rezeptor Beta-Makrophagen und seine Beziehung zu der gesamten Immunzelle Schläfenarterie Biopsien in riesige Zelle Arterienentzündung zu infiltrieren.

Eine Immunohistopathologic Untersuchung der Folat-Rezeptor Beta Makrophagen und vaskuläre immun Mikroumgebung in riesige Zelle Arterienentzündung Profil

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Dieses immunhistochemische und histopathologische Protokoll kann verwendet werden, um Folatrezeptor Beta zu untersuchen, das ein Kandidatenprotein mit potenziellem prognostischen und therapeutischen Wert für die vaskuläre Mikroumgebung bei Riesenzellarteritis ist. Dieses Protokoll ist bewährt und weit verbreitet und kann verwendet werden, um die Folatrezeptor-Beta-Attribute in zeitlichen Arteriengeweben zu erforschen, auch nach langzeitlagerung. Um Gewebeabschnitte zu erhalten, verwenden Sie ein Mikrotome, um vier bis fünf Mikrometer dicke Abschnitte von paraffineingebetteten temporalen Arterien zu schneiden, die jeden Abschnitt in einem 40 Grad Celsius Wasserbad schweben, wie sie erhalten werden, um Falten zu entfernen.Verwenden Sie Glasmikroskop-Dias, um drei Abschnitte pro Rutsche zu erfassen, und wärmen Sie die Dias auf einer wärmenden Platte, in einem 60-Grad-Celsius-Ofen für 60 Minuten. Wenn die Abschnitte an den Dias kleben haben, legen Sie die Dias in ein vertikales Rack zum Trocknen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Übertragen Sie die Dias am nächsten Tag für mindestens 12 Stunden in einen Diabehälter zur Lagerung bei vier Grad Celsius.Als nächstes gleitet die Last in ein Diaregal und hydratisiert das Gewebe mit zwei fünfminütigen, 100%xylen-Tauchionen und einer absteigenden, fünfminütigen Ethanol-Tauchserie pro Konzentration, mit 10 Sekunden Erregung alle 30 Sekunden. Nach dem 70%Ethanol-Eintauchen die Dias zweimal in doppelt destilliertem Wasser für fünf Minuten abspülen, mit 10 Sekunden Aufrührer alle 30 Sekunden. Für die Antigen-Retrieval, übertragen Sie das Rack in einen Glasbehälter mit 200 Mikroliter 95 Grad Celsius, 10 Millimolar pro Liter Citratpuffer für 30 Minuten.Lassen Sie die Dias am Ende der Inkubation 20 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie sie fünf Minuten lang mit fließendem Wasser abspülen. Um die endogene Peroxidase-Aktivität zu entfernen, verwenden Sie zunächst einen hydrophoben Marker, um einen Kreis um jede Gewebeprobe zu ziehen, bevor Sie die Proben in 200 Mikroliter 3%Wasserstoffperoxid für 10 Minuten inkubieren, gefolgt von 3 Waschungen in 200 Micolitern Tris-gepufferter Salzlösung, oder TBSS, pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche, tab jede Rutsche sanft, um überschüssigepuffer zu entfernen und fügen Sie 200 Mikroliter des primären Antikörper-Cocktail von Interesse und eine Abdeckung Rutschen zu jeder Rutsche für eine einstündige Inkubation in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur.Am Ende der Inkubation die Deckelschlüpfer entsorgen und die Dias mit drei zweiminütigen Wäbungen in frischem TBSS spülen. Nach dem Entfernen des überschüssigen Puffers 200 Mikroliter einer geeigneten biotinylierten Sekundärantikörperlösung und einen Deckelschlupf zu jedem Schlitten für eine 45-minütige Inkubation in der feuchten Kammer bei Raumtemperatur hinzufügen. Nachdem Sie die Deckelbelege verworfen haben, spülen Sie die Dias wie gezeigt mit TBSS ab.Entfernen Sie alle überschüssigen Puffer. Und beschriften Sie die Abschnitte mit 200 Mikroliter DAB-Substratpuffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Dias mit TBSS und fließendem Leitungswasser für 10 Minuten waschen, bevor Sie drei Minuten lang mit Hämatoxylin kontern.Fügen Sie dann 70 Mikroliter eines geeigneten Montagemediums zu jedem Schlitten hinzu und kippen Sie langsam einen Glasabdeckstreifen auf das Montagemedium, um Blasen zu vermeiden, wenn der Deckelschlupf eingelassen wird. Legen Sie das Dia für die histopathologische Analyse auf die Bühne eines Lichtmikroskops und bewerten Sie die Gefäßarchitektur des ersten Gewebeabschnitts. Quantifizieren Sie dann die Anzahl der Makrophagen relativ zur Anzahl der Lymphozyten pro Abschnitt.Für die immunhistochemische Analyse untersuchen Sie das Folatrezeptor-Beta-Färbungsmuster auf jedem Gewebeabschnitt und quantifizieren die Anzahl der Folatrezeptor-Beta-positiven, CD68-positiven und CD3-positiven Zellen in 10 zufällig ausgewählten Hochleistungsfeldern pro Abschnitt. Hämatoxylin- und Eosinfärbungen in normalen Proben zeigen eine normale arterielle Anatomie mit Endothelzellen in der Tunika-Intima, glatten Muskelzellen in den Tunika-Medien und einer heterogenen Kollagenmatrix, die Fibroblasten und Feedergefäße namens Vasa vasorum in der Tunika-Adventitia umfasst. Riesenzellarteritis positive zeitliche Arterien zeigen eine mittelschwere bis schwere Entzündung, mit Aggregaten und Makrophagen, oder Histiozyten, Lymphozyten, gelegentlichen Plasmazellen und multinukleierten Riesenzellen.Luminal Verengung ist auch festgestellt, und begleitet von intimverdickung und eine 90%Störung der internen elastischen Lamina. CD3-positive Lymphozyten und CD68-positive Makrophagen sind auch in allen riesenzellartibilisierenden Proben vorhanden, wobei ähnliche Färbungsmuster in allen Biopsien beobachtet werden. Die Färbung für Folatrezeptor-Beta ist auf Makrophagen und multinukleierte Riesenzellen beschränkt, die bevorzugt auf die Adventitia und medienlokalisieren.Bemerkenswert ist, dass die Folatrezeptor-Beta etwa 30 % der gesamten Makrophagen ausmachte. Die zeitliche ArterienbiopsieVerarbeitung, Schneiden und Entwachsung erfordern sorgfältige Geschicklichkeit, um nachfolgende Schritte durchzuführen. Die Diainterpretation erfordert die Expertise eines erfahrenen kardiovaskulären Pathologen.Erinnern Sie die Betrachter daran, kontakt- und Atemschutzvorkehrungen wie Handschuhe und belüftete Kapuzen beim Umgang mit Proben und Reagenzien zu verwenden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Quantifizierung des relativen Verhältnisses von Makrophagen unter den gesamten infiltrierten Immunzellpopulationen in der Biopsie der Schläfenarterien. Bei der immunhistochemischen Färbung eines von einer Autoimmunerkrankung betroffenen Gewebeabschnitts werden die Immunzellen selektiv mit spezifischen Rezeptoren angefärbt, um sie visuell vom Rest der Zellen zu unterscheiden.

Immunhistochemie zur Untersuchung der Beziehung zwischen Makrophagen und infiltrierten Immunzellen

Der Artikel beschreibt eine leicht einfach...

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

Makrophagen sind Plastikzellen des hämatopoetischen Systems, die eine entscheidende Rolle bei der schützenden Immunität und Homöostase haben. In diesem Bericht beschreiben wir optimierte in vitro- Techniken zur phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von pfropf-infiltrierenden regulatorischen Makrophagen, die sich im transplantierten Organ unter toleranten Bedingungen ansammeln.

Funktionelle Charakterisierung von regulatorischen Makrophagen, die eine pfropfreaktive Immunität hemmen

Dieses Protokoll liefert eine Analyse der Makrophagen-Subpopulationen in das erwachsene Maus-Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie und ist hilfreich für die Untersuchung von mehreren Markern, die von diesen Zellen exprimiert werden.

Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Target-spezifische Sonden stellen ein innovatives Tool für die Analyse der molekularer Mechanismen, wie z. B. Protein-Expression in verschiedenen Arten von Krankheiten (z. B. Entzündungen, Infektionen und Tumorgenese). In dieser Studie beschreiben wir eine quantitative dreidimensionale tomographische Bewertung der intestinalen Makrophagen Infiltration in einem Mausmodell der Kolitis mit F4/80-spezifische Fluoreszenz-vermittelten Tomographie.

Fluoreszenz-vermittelten Tomographie für die Erkennung und Quantifizierung von murinen Makrophagen bedingte Darmentzündung

Monozyten sind wichtige Vermittler des Arteriogenesis im Rahmen der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit. Mit einem Basalmembran-wie Matrix und intravitalen Mikroskopie, untersucht dieses Protokoll Monocyte homing und im Zusammenhang mit Tumor-Angiogenese nach Monocyte-Injektion in die Femoral Arterie Ligatur Mausmodell.

Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit

Dieser Artikel stellt einen nützlichen In-vitro-Assay dar, um die Fähigkeit des konditionierten Mediums aus Tumorzellen zu bewerten, Makrophagen anzuziehen.

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Die vorliegende Studie bietet ein modifiziertes Protokoll zur Isolierung von Synovialmakrophagen und Fibroblasten aus murinem entzündlichem Arthritisgewebe.

Isolierung und Kultivierung von primären Synovialmakrophagen und Fibroblasten aus murinem Arthritisgewebe

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um die Interaktion von primären humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen mit einem Tumorsphäroid in einer dreidimensionalen (3D) Kollagen-I-Matrix zu untersuchen, mit der Möglichkeit, den Einfluss löslicher und physikalischer Eigenschaften der Mikroumgebung auf die Zellinvasion zu vergleichen.

Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

Angesichts der begrenzten Xenotransplantat-Modelle, die zur Untersuchung von Interaktionen zwischen humanen CART- und myeloischen Zellen zur Verfügung stehen, haben wir in vitro und in vivo Modelle etabliert, um die Auswirkungen menschlicher Makrophagen auf CART-Zellen zu verstehen. Die Ergebnisse können möglicherweise verallgemeinert werden, um die Rolle von Makrophagen in der Tumormikroumgebung zu bewerten und Makrophagen-gezielte Immuntherapien zu testen.

Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen myeloischen Zellen und CAR-T-Zellen in vitro und in vivo

Erfahren Sie die immunhistochemische Analyse von Folat-Rezeptor Beta-Makrophagen in Arteria temporalis-Geweben bei Riesenzellarteriitis. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung immunologischer Infiltrate und potenzieller therapeutischer Ziele.

Eine Immunohistopathologic Untersuchung der Folat-Rezeptor Beta Makrophagen und vaskuläre immun Mikroumgebung in riesige Zelle Arterienentzündung Profil (Video) | JoVE Journal

Eine Immunohistopathologic Untersuchung der Folat-Rezeptor Beta Makrophagen und vaskuläre immun Mikroumgebung in riesige Zelle Arterienentzündung Profil

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