Name: Listeria monocytogenes Infektion des Gehirns (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Lernen Sie eine Perfusionsmethode zur Quantifizierung von Listeria monocytogenes im Gehirn, die Blutgefäßbakterien ausschließt. Diese Technik ermöglicht präzise Untersuchungen zur Blut-Hirn-Schranke.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch US Public Health Service gewähren AI103806 von den National Institutes of Health.

Alle Tiere sind gepflegt und behandelt mit größter Sorgfalt um Beschwerden im Verlauf des Verfahrens zu minimieren. Das Verfahren ist in Übereinstimmung mit den institutionellen Animal Care und Use Committee und alle staatlichen und lokalen Gesetze durchgeführt werden. Auch beachten Sie, dass die Labor-Experimente nach Biosafety Level 2 Richtlinien durchgeführt werden.
1. Wachstum von L. Monocytogenes für Studien an Mäusen Infektion
<ol><li>
Autoklaven 500 mL Brain Heart Infusion (BHI) Agar Medium in einem 1 L-Erlenmeyer-Kolben Nährboden Platten vorbereiten. Lassen Sie die Medien im Wasserbad 56 ° C abkühlen und fügen Sie dann in einer Endkonzentration von 100 µg/mL Streptomycin.
	<ol>
<li>Gießen Sie 25 mL Medien/Petrischale in Petrischale Teller. Lassen Sie die Platten trocken bei Raumtemperatur (22 oc-25 ° C). Bei Bedarf können die Platten bei 37 ° C, bis es komplett trocken getrocknet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mit einem sterilen Impfkeimen Schleife und aseptische Technik, erhalten eine volle Schleife von gefrorenen L. Monocytogenes Stamm 10403S11,12 aus einem Lager Kultur eingefroren in der BHI Medien plus 30 % Glycerin und pflegen in einem-80 ° C Gefrierschrank.
	<ol>
<li>Streifen der L. Monocytogenes auf einer BHI Agar/Streptomycin Platte, so dass einzelne Bakterienkolonien isoliert werden können. Legen Sie die Platten in einem 37 ° C über Nacht Inkubator (18 h bis 24 h), um L. Monocytogenes Kolonien wachsen.</li>
		<li>Mit einer sterilen Impfkeimen Schleife, wählen Sie ein einzelnes L. Monocytogenes Kolonie von der BHI-Agar-Platte und die Kolonie in ein steriles Röhrchen mit 5 mL BHI-Bouillon mit 100 µg/mL Streptomycin impfen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inkubieren Sie L. Monocytogenes Kultur Rohr leicht geneigt, bei 30 Grad über Nacht in einem statischen Inkubator.
	<ol>
<li>Überprüfen Sie am folgenden Tag, die L. Monocytogenes Kultur für Wachstum (die BHI-Medien werden trübe) und Vortex kurz darauf eine homogene Suspension der Kultur.</li>
		<li>Aseptisch entfernen Sie eine 1 mL Aliquot der bakteriellen Kultur und messen die Extinktion bei 600 nm (OD600) mit einem Spektralphotometer. Hinweis: Sterile BHI-Bouillon dient als Rohling für das Spektrophotometer vor der Messung der optischen Dichte von L. Monocytogenes Kultur lesen. L. Monocytogenes Kultur kann auch verdünnt werden (zwei zu fünffache) im BHI vor dem Lesen der optischen Dichte.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Anzahl von L. Monocytogenes Kolonie bildende Einheiten (KBE) pro mL BHI Kultur durch Ausplattieren 10-divisibel serielle Verdünnungen der Kultur. Dies ist nützlich, um eine Beziehung zwischen der optischen Dichte von L. Monocytogenes Kultur und die Anzahl der Bakterien pro mL Kultur zu etablieren. In der Regel entspricht ein OD600 von 1.0 für eine L. Monocytogenes Kultur ca. 1 x 109 KBE Bakterien pro mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung von L. Monocytogenes für Infektion der Mäuse
<ol><li>Achtzehn bis vierundzwanzig Stunden vor tierischen Infektion wachsen L. Monocytogenes Kulturen im BHI-Bouillon mit 100 µg/mL Streptomycin und bestimmen die OD600/ ~ KBE pro mL wie in Schritt 1 angegeben. Hinweis: Mäuse sind in der Regel eine Woche vor Infektion bestellt und sind an der Tierhaltung vor der Infektion, die Untersuchungen müssen eingewöhnt. In dieser Studie 6 – 8 Wochen alten weibliche Mäusen BALB/c (5 Mäusen pro Gruppe) wurden in einer Barriere-Umgebung in der Harvard Medical School BSL2-Niveau tierisches Containment Anlage untergebracht und versorgt Nahrung und Wasser Ad Libitum.</li>
	<li>Bestimmung der Höhe der L. Monocytogenes Kultur verpflichtet, jede Maus basierend auf infizieren die ~ KBE pro mL Bakterienkultur. Nehmen Sie eine Verdünnung der L. Monocytogenes Kultur in sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung pH 7,2 (PBS) an die entsprechende Konzentration von Bakterien. Mäuse sind in der Regel intravenös mit 200 µL PBS mit 1 – 2 × 104 KBE von Bakterien/Tier infiziert.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Anzahl von L. Monocytogenes in das Inokulum durch Ausplattieren 10-divisibel Verdünnungsreihen auf BHI Agarplatten mit 100 µg/mL Streptomycin. Inkubieren Sie die Platten in einem Inkubator 37 ° C über Nacht die Anzahl von L. Monocytogenes geimpft per Mausklick wie folgt bestimmen: Inokulum (CFU) = (Anzahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor) / mL verchromt x Volumen (mL) injiziert</li>
</ol>3. Infektion von Mäusen mit L. Monocytogenes über intravenöse Tail Vene Injektion
<ol><li>
Entfernen Sie die Deckel und Lebensmittel-Behälter aus dem Käfig mit den Mäusen zu, und legen Sie den Käfig unter einer 250 W Infrarot-Wärmelampe für 5 min. Hinweis: Diese Methode ermöglicht die Rute Venen zu erweitern, um sicherzustellen, dass Injektionen leichter durchzuführen sind.<ol>
<li>Legen Sie das Tier vorsichtig in eine entsprechend dimensionierte Maus bewegungseinschränkende Gerät um sicher das Tier während der Schweif Vene Spritzen zurückzuhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mischen Sie das L. Monocytogenes Inokulum (Schritt 2.2) und laden Sie das Inokulum in eine 1 mL Spritze mit einer 26 G-Nadel ausgestattet.</li>
	<li>Suchen Sie eine seitliche Schweif Vene der Maus und Reinigen der Einstichstelle mit einem Alkoholtupfer oder ein Spray 75 % Ethanol.</li>
	<li>
Spritzen Sie sanft die Maus mit 200 µL der L. Monocytogenes Suspension in eine seitliche Schweif Vene mit der Spritze mit der Nadel 26 G.
	<ol>
<li>Verwenden Sie Baumwolle Gaze kurz Druck auf die Injektionsstelle, eine Blutung zu stoppen, und das Tier in einen neuen Käfig. Hinweis: Führen Sie diesen Vorgang für alle Mäuse injiziert werden und markieren Sie den Käfig mit entsprechenden Beschriftungen. Um festzustellen, die nach der Injektion Konzentration des Inokulums L. Monocytogenes , wiederholen Sie Schritt 2.3 mit der Restbetrag des Inokulums. Die intravenöse L. Monocytogenes -Infektion Inokulum pro Maus wird berichtet, wie die durchschnittliche KBE aus den vor- und nach der Injektion Inokulum Proben gemessen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die infizierten Tiere täglich zu überwachen, und notieren Sie offensichtlichen Anzeichen von Krankheit (z. B. gekräuselte Fell, Buckliger Haltung, träge Bewegung, Gewichtsabnahme). Entfernen Sie Tiere, die anscheinend deutlich moribund vor 72 Stunden nach der Infektion (z. B. 24, 48 Stunden nach der Infektion) aus der Studie und menschlich zu opfern. Weiterhin täglich bis zu 72 Stunden nach der Infektion alle verbleibenden Tiere geopfert werden. Hinweis: Die 50 % letale Dosis (LD50) für L. Monocytogenes Stamm 10403S bei Mäusen BALB/c ist ~ 1 – 2 x 104 KBE/Tier. Mäuse infiziert mit LD50 Dosen von L. Monocytogenes unter Verwendung dieses Protokolls können Anzeichen einer Krankheit aufweisen, wie oben angegeben, und Ermittler könnte erwarten, dass die Mäuse zu erliegen, die Infektion nach 72 h nach der Infektion.</li>
</ol>4. Präparation und kardiale Perfusion der Mäuse infiziert mit L. monocytogenes
<ol><li>
Bei 72 h nach der Infektion (oder an eine zuvor gewünschten Zeitpunkt) einschläfern Sie die infizierte Mäuse mit einem Protokoll genehmigt durch die institutionelle Tier-Ethik-Kommission, wie CO2 Erstickung durch zervikale Dislokation gefolgt. Hinweis: Wenn die Blutentnahme durchgeführt werden soll, minimieren Sie zerreißen der Blutgefäße während der Durchführung zervikale Dislokation.<ol>
<li>Bestätigen Sie, dass Mäuse durch das Fehlen einer Pfote zuckenden Antwort eingeschläfert worden sind. Hinweis: Wenn kardiale Perfusion durchgeführt werden soll, richten Sie eine automatische Pumpe/Perfusion System mit einer Durchflussrate von 4 mL Volumen/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie das Tier auf dem Rücken in einer Dissektion Pfanne und tragen Sie 75 % Ethanol auf die Bauchhaut Fell Oberfläche auf.</li>
	<li>Mit Schere, machen Sie einen Schnitt in der Bauchdecke und erweitern Sie den Schnitt knapp unterhalb des Brustkorbs zu.</li>
	<li>Setzen Sie die Membran und viszeralen Organe. Hinweis: Achten Sie darauf, alle viszeralen Organe zu zerfleischen.</li>
	<li>Öffnen Sie der Brusthöhle durch die Membrane schneiden und schneiden Sie den Brustkorb auf bilateraler Ebene um den linken Ventrikel des Herzens verfügbar zu machen.</li>
	<li>Mit stumpfen Pinzette, sanft zu erfassen, das Herz und legen Sie eine Nadel 21 G Schmetterling in den linken Ventrikel auf Perfusion System angeschlossen und dann schneiden Sie vorsichtig den rechten Vorhof sammeln das Blut (~0.2 mL) in ein 2 mL Röhrchen mit 10 mM ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), Gerinnung zu verhindern. Eine schematische Darstellung der kardialen Perfusion in der Maus ist in Abbildung 2dargestellt. Hinweis: Wenn die Durchblutung nicht durchgeführt werden soll, Blut erfasst durch Herzpunktion mit einer 1 mL Spritze und schnell übertragen in eine 2 mL-Röhrchen mit 10 mM EDTA, Gerinnung zu verhindern. L. Monocytogenes -infizierte Organe sind dann wie beschrieben (Schritt 5.1) geerntet.</li>
	<li>Perfusion beginnen und das Tier 4 min mit 15 – 20 mL PBS mit 10 mM EDTA durchspülen. Hinweis: Bewerten Sie Perfusion durch Beobachtung der Blut und PBS-EDTA Lösung fließt durch den rechten Vorhof und in die Pfanne, Dissektion. Das Gehirn und Leber erscheint nach kompletten Perfusion sicherzustellen, dass die verbleibende Bakterien aus den geernteten Organe und nicht das zirkulierende Blut sind blanchiert.</li>
</ol>5. Organraub und Bestimmung der bakteriellen Belastungen
<ol><li>Folgenden Perfusion, Ernte Organe (z.B. Leber, Milz) indem Sie sorgfältig jede Gefäßsystem und Bänder befestigt und die Organe separat in ein steriles 15 mL konische Röhrchen mit 5 mL sterilem kalt (4 ° C) PBS zu platzieren. Speichern Sie Proben auf Eis, bis weitere Verarbeitung erfolgt.</li>
	<li>
Um das Gehirn zu ernten, enthaupten Sie den Kopf hinter den Ohren mit einer Schere und schneiden Sie die Kopfhaut Haut dazwischen das Tier Augen hinunter die Mittellinie. Bei Bedarf schneiden Sie überschüssiges Gewebe der Schere gegen den Schädel gedrückt zu halten.
	<ol>
<li>Sanft legen Sie eine Spitze der Schere in das Foramen Magnum (die Öffnung in der Schädelbasis, durch den das Rückenmark verläuft) und seitlich in den Schädel auf beiden Seiten schneiden.</li>
		<li>Schneiden Sie sanft dem Schädel dazwischen das Nagetier Augen hinunter die Mittellinie, wobei Sie auf seitlichen Druck ausüben. Vermeiden Sie Störung des Gehirns und erhalten Sie minimalen Kontakt zwischen Hirngewebe und die Schere zu.</li>
		<li>Mit feiner Spitze Pinzette, öffnen Sie den Schädel um das Gehirn und legen Sie einen Spachtel zwischen der Unterseite des Gehirns und der Schädelbasis, das Gehirn zu entfernen. Hinweis: Dadurch reißen des Gehirns Nervenfasern.</li>
		<li>Übertragen Sie sorgfältig das Gehirn auf eine 15 mL konische Röhrchen mit 5 mL sterilem kaltem PBS.</li>
		<li>Verwerfen Sie die Maus Kadaver zu, und wiederholen Sie diese Schritte für die verbleibenden Tiere. Hinweis: Sobald alle Organe geerntet worden sind, reinigen Sie die Prozedur und bereiten auf die Orgel Homogenisierung bakterielle Belastungen zu bestimmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reinigen Sie und Sterilisieren Sie die Spitze des einen Gewebe-Homogenisator gelegt in eine biologische Kabinett durch Einfügen von der Spitze und läuft den Homogenisator für 10 s sequenziell in 5 % Chlorid, steriles Wasser, 75 % Ethanol, steriles Wasser in einem separaten 15 mL konische Röhrchen enthalten.</li>
	<li>
Homogenisieren der infizierten Gehirn (~ 20 s auf Einstellung 6, max. u/min) in der 15 mL konische Röhre bis keine sichtbaren gewebefragmente bleiben.
	<ol>
<li>Sauber Homogenisator wie unter Punkt 5.3 beschrieben, Bakterien zu verhindern Kontamination der nächsten Orgel-Probe übertragen.</li>
		<li>Führen Sie den Prozess der Homogenisierung für alle anderen Organe (z.B. Leber, Milz).</li>
		<li>Sobald die Homogenisierung abgeschlossen ist, Reinigen der Homogenisator wie im Schritt 5.3 und Store bis zur weiteren Verwendung beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
10-divisibel serielle Verdünnungen der Orgel Homogenates in sterilen PBS vorzubereiten und Platte die Verdünnungen auf BHI Agar/Streptomycin Platten zu ermitteln, die KBE pro Organ. Hinweis: Eine ähnliche Methode wird durchgeführt, um festzustellen, die KBE pro mL Blut.<ol>
<li>Nachdem alle Verdünnungen überzogen sind, übertragen Sie die Platten in einem Inkubator 37 ° C über Nacht.</li>
		<li>Am folgenden Tag, die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte, die Gesamtzahl der Bakterien pro Organ oder mL Blut wie folgt zu bestimmen: KBE/Orgel = (Anzahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor) / mL Homogenat vernickelt X 5 KBE/mL Blut = (Anzahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor) / mL Blut überzogen</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Radoshevich, L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+towards+a+complete+picture+of+its+physiology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).</li>
<li>de Noordhout, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+listeriosis%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).</li>
<li>Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+the+central+nervous+system+by+intracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria.</a> Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).</li>
<li>Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+penetration+across+the+blood-brain+barrier+during+the+development+of+neonatal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis.</a> Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).</li>
<li>Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+diagnosis%2C+and+antimicrobial+treatment+of+acute+bacterial+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).</li>
<li>Thigpen, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+meningitis+in+the+United+States%2C+1998-2007%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007.</a> New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).</li>
<li>Durand, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+meningitis+in+adults.+A+review+of+493+episodes%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes.</a> The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).</li>
<li>Disson, O., Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+the+central+nervous+system+by+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes.</a> Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://cshperspectives.cshlp.org/content/7/1/a020412.short">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412(2015).</li>
<li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD%2C+10403S%2C+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).</li>
<li>Kirchner, M., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+ROCK+activity+allows+InlF-mediated+invasion+and+increased+virulence+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes.</a> Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).</li>
<li>Grubaugh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VirAB+ABC+transporter+is+required+for+VirR+regulation+of+Listeria+monocytogenes+virulence+and+resistance+to+nisin%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin.</a> Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).</li>
<li>Vazquez-Boland, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+pathogenesis+and+molecular+virulence+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants.</a> Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).</li>
<li>Ghosh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+the+brain+by+Listeria+monocytogenes+is+mediated+by+InlF+and+host+cell+vimentin%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin.</a> MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).</li>
<li>Henke, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+spreads+within+the+brain+by+actin-based+intra-axonal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration.</a> Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).</li>
<li>Maury, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+Listeria+monocytogenes+hypervirulence+by+harnessing+its+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity.</a> Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

L. Monocytogenes kann lebensbedrohliche Meningoenzephalitis beim Menschen verursachen. Vorherige Studien belegen die Fähigkeit von Bakterien, die Blut-Hirn-Schranke (BBB) zu überqueren und um das Gehirn zu kolonisieren. Drei Strecken der Gehirn-Invasion wurden vorgeschlagen, während der Infektion: direkte Penetration des BBB durch Bakterien, Stealth-Transport durch Bakterien in mononukleären Zellen3und axonalen Migration von L. Monocytogenes Stämme, die dazu führen, dass Rhombenc...

Das grampositive Bakterium Listeria Monocytogenes ist ein fakultativ intrazellulärer Erreger und von der meisten tödlichen lebensmittelbedingten Krankheitserregern weltweit. Einnahme von L. Monocytogenes kontaminierte Lebensmittel führen zu Listeriose beim Menschen eine schwere invasive Erkrankung gezielt vor allem Schwangere, Neugeborene, die älteren und immungeschwächten Menschen1. L. Monocytogenes gehört zu den führenden Todesursachen durch ein Lebensmittel übertragbaren Erreger in den USA und Fall Sterberaten von Listeriose sind so hoch wie 20-30 %, die höchste für alle lebensmittelbedingten Krankheitserregern2. Derzeit existiert kein Impfstoff für L. Monocytogenes und die Fähigkeit der Bakterien, für distale Organe und das Gehirn effektiv zu verbreiten, durch die Kreuzung der Blut - Hirn-Schranke (BBB) führen zu lebensbedrohlichen Hirnhautentzündung und Kolonisierung des Gehirns3 , 4 , 5 , 6. bakterielle Meningitis ist in der Regel schwere; während die meisten Menschen, die Behandlung erholen, können Infektionen schwerwiegende Komplikationen, z.B., Hirnschäden, Hörverlust oder Lernbehinderungen bei Kindern verursachen. L. Monocytogenes wird vorausgesagt, um mindestens 10 % der ganzen Gemeinschaft berücksichtigen Meningitis in der US-7erworben.
Eine wichtige Route für bakterielle Verbreitung des Gehirns und der Hirnhäute wird durch den Blutstrom. Bakterien im Umlauf in den Blutgefäßen im Gehirn sind in der Lage die BBB zum Gehirn zu Infektionen führen zu überqueren. Die BBB ist ein stark vaskularisierte Barriere, die das Gehirn vor Fremdkörper im Blut zirkulierenden schützt. Endothelzellen bilden eine Schicht, die die innere Oberfläche der Blutgefäße8,9Linien. Neben L. Monocytogeneskönnen mehrere bakterielle Krankheitserreger wie Neisseria Meningitidis, Streptococcus Pneumoniae, Escherichia coliund Haemophilus Influenzae Typ B (Hib) besiedeln das Gehirn durch die Kreuzung der BBB3,4,5,6. Bakterielle Belastungen im Gehirn von infizierten Mäusen untersucht, ist es jedoch wichtig zu bestimmen, ob Bakterien die BBB überquert haben, ansonsten die bakterielle Belastung im Gehirn Bakterien darstellen kann, die noch in den Blutgefäßen des Gehirns sind. Daher ist es notwendig, die Mäuse alles Blut vor der Festlegung der koloniebildenden Einheiten (KBE) des Gehirns Homogenates durchspülen.
In dieser Studie beschreiben wir in-Vivo -Methoden um L. Monocytogenes -Infektion des Gehirns zu untersuchen. Für die hier beschriebenen Methoden verwendet wir L. Monocytogenes Stamm 10403S. L. Monocytogenes 10403S ist eines der am weitesten verbreitete laborbelastungen systemische Listeriose im Mausmodell der Infektion10zu studieren. Dieses Protokoll basiert auf standard intravenöse Injektion von L. Monocytogenes gefolgt von Perfusion der Mäuse. Abbildung 1zeigt ein schematischer Überblick über die Infektion Protokoll bei Mäusen. L. Monocytogenes-infizierten Gehirn und andere Organe von nicht durchblutet oder PERFUNDIERTEN Mäuse wurden gesammelt und die bakterielle Orgel Belastung bestimmt. Diese Methoden eignen sich für die Bestimmung nicht nur total bakteriellen Besiedelung des Gehirns bei infizierten Tieren, sondern sind auch vorteilhaft zur Feststellung, ob Bakterien die BBB in Vivo , Invasion des Gehirns zu vermitteln eingedrungen sind. Es ist wichtig hervorzuheben, dass diese Laborprotokoll durchgeführt werden sollte, nach Rücksprache mit dem relevanten institutionellen Biosafety Committee und Tier Facilitymanagement.

<table><tbody><tr><td>Gehirn Herz Infusionsmedium</td><td>Becton Dickinson</td><td>237200</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycinsulfat</td><td>Amresco</td><td>0382-50G</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>VWR</td><td>97062-832</td><td></td></tr><tr><td>IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenisator</td><td>IKA</td><td>3352109</td><td>Modell: T18BS1</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU 800 Serie</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Modell #000651</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritzen</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>26 G Nadeln</td><td>Becton Dickinson</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>21 G Schmetterlingsnadeln</td><td>Becton Dickinson</td><td>367281</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60004</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzgläser mit rundem Boden</td><td>VWR</td><td>60819-546</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-Spatel</td><td>VWR</td><td>82027-520</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-Schere (6,5 Zoll)</td><td>VWR</td><td>82027-592</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-Schere (4,5 Zoll)</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-Abstumpfzange&nbsp; (4,5 Zoll)</td><td>VWR</td><td>82027-440</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-Zange mit feiner Spitze&nbsp; (6 Zoll)</td><td>VWR</td><td>82027-406</td><td></td></tr></tbody></table>

listeria monocytogenes infektion des gehirns

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria Monocytogenes ist eine intrazelluläre bakterielle Erreger, die häufig von lebensmittelbedingten Infektionen zugeordnet ist. Die Fähigkeit von L. Monocytogenes , überqueren Sie die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist über, wie es zu lebensbedrohlichen Meningitis und Enzephalitis führen kann. Die BBB schützt das Gehirn Mikroumgebung von verschiedenen toxischen Metaboliten und mikrobielle Krankheitserreger im Blut nach Infektion gefunden und unterstützt damit Gehirn Homöostase. Die Mechanismen, durch die L. Monocytogenes in den Blutkreislauf vorhanden überqueren die BBB verursachen Gehirn, die Infektionen nicht vollständig verstanden sind und es fehlt auch an ein stabiles Modellsystem Gehirn Infektionen von L. Monocytogeneszu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Mausmodell Infektion zu bestimmen, ob Bakterien die BBB überquert haben und die Belastung durch Bakterien quantitate, die das Gehirn in Vivobesiedelt haben. Bei dieser Methode Tiere wurden intravenös mit L. Monocytogenes infiziert und wurden durch die Einwirkung von CO2 gefolgt von zervikale Dislokation Human eingeschläfert. Kardiale Perfusion der Tiere erfolgte vor der Ernte infizierter Organen. Blut war vor Perfusion gesammelt und die Anzahl der Bakterien pro Organ oder mL Blut wurde bestimmt durch Ausplattieren Verdünnungen von Blut oder Orgel Homogenates auf Agarplatten und zählen die Anzahl der Kolonien gebildet. Diese Methode kann verwendet werden, um neuartige Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu untersuchen, die Infektion des Gehirns von L. Monocytogenes und kann für die Untersuchung von mehreren bakteriellen Krankheitserregern leicht angepasst werden.

Das Gehirn ist stark durchblutet und L. Monocytogenes ist bekanntermaßen Zelltypen im Blut3,13infizieren. Das beschriebene Protokoll wird verwendet, um die Fähigkeit von L. Monocytogenes , überqueren Sie die Blut - Hirn-Schranke (BBB) führt zur Infektion des Gehirns bei Mäusen zeigen. Um festzustellen, ob Bakterien die BBB in Vivoüberquert haben, erfolgt die Perfusion des Blutes in die Maus vor der Festl...

Während der Infektion kann Listeria Monocytogenes überqueren der Blut - Hirn-Schranke um das Gehirn zu besiedeln. In diesem Protokoll veranschaulichen wir die bakterielle Besiedlung der Organe nach Infektion der Mäuse zu beurteilen. Ein Verfahren zur gesamten Organ Perfusion zur spezifischen Bestimmung der bakteriellen Zahlen in der Anwesenheit von durchführen steht zur Verfügung.

Listeria monocytogenes Infektion des Gehirns

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der bakteriellen Pathogenese zu beantworten, ob blutgetragene Bakterien die Blut-Hirn-Schranke überqueren können, um das zentrale Nervensystem und das Gehirn zu infizieren. Mit dieser Technik können Bakterienzahlen im Blut und Hirngewebe infizierter Tiere bestimmt werden, während die Anzahl der Bakterien, die sich in den Blutgefäßen des Gehirns befinden, ausgeschlossen wird. Demonstrieren sie das Verfahren wird Pallab Ghosh, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor.Nach 72 Stunden nach der Infektion, stellen Sie ein automatisiertes Perfusionssystem auf eine Durchflussrate von vier Milliliter PBS ergänzt mit 10 Millimolar EDTA pro Minute. Und legen Sie das eingeschläferte Tier in die Supine-Position in eine Sezierpfanne. Bestätigen Sie die Euthanasie durch mangelnde Reaktion auf Pfoten-Pinch.Und den Bauch mit 75% Ethanol befeuchten. Verwenden Sie eine Schere, um einen Bauchwandschnitt direkt unter dem Rippenkäfig zu machen, um das Zwerchfell und die viszeralen Organe freizulegen. Und schneiden Sie das Zwerchfell, um die Brusthöhle zu öffnen.Schneiden Sie den Reibekäfig bilateral, um den linken Ventrikel freizulegen, und verwenden Sie Zangen, um das Herz sanft zu greifen. Legen Sie eine 21-Spur-Schmetterlingsnadel, die mit dem Perfusionssystem verbunden ist, in den linken Ventrikel ein und schneiden Sie vorsichtig das rechte Atrium, um etwa 200 Mikroliter Blut in eine Zwei-Milliliter-Röhre mit 10 Millimolar EDTA zu sammeln, um eine Gerinnung zu verhindern. Dann durchdringen Sie das Tier für vier Minuten mit 15 bis 20 Milliliter PBS plus EDTA.Nach vollständiger Perfusion erscheinen Gehirn und Leber blanchiert und stellen sicher, dass die verbleibenden Bakterien aus den geernteten Organen stammen und nicht das zirkulierende Blut. Übertragen Sie die interessierten Organe nach der Perfusion sorgfältig in einzelne sterile, 15-Milliliter konische Röhren, die fünf Milliliter sterile vier Grad Celsius PBS pro Röhre enthalten. Um das Gehirn nach der Enthauptung zu ernten, verwenden Sie eine Schere, um die Kopfhaut auf der Mittellinie zwischen den Augen zu schneiden, wobei die Spitzen gegen den Schädel gedrückt werden, um überschüssiges Gewebe nach Bedarf zu trimmen.Legen Sie vorsichtig eine Spitze der Schere in das Foramen magnum und schneiden Sie seitlich in den Schädel auf beiden Seiten. Schneiden Sie vorsichtig den Schädel zwischen den Augen die Mittellinie im Schädel hinunter, wobei Sie darauf achten, seitlichen Druck auszuüben und Eine Störung des Gehirns zu vermeiden. Öffnen Sie mit Zangen den Schädel, um das Gehirn freizulegen, und legen Sie einen Spachtel zwischen der Unterseite des Gehirns und der Schädelbasis, um das Gehirn vorsichtig in eine 15-Milliliter-Röhre mit fünf Millilitern vier Grad Celsius PBS zu übertragen.In einem Biosicherheitsschrank die Spitze einlegen und einen Gewebehomogenisator 10 Sekunden lang in sequenziellen 5%Bleichmittel, sterilem Wasser, 75% Ethanol und sterilen Wasserlösungen in separaten 15-Milliliter-Konikonröhren ausführen. Wenn die Spitze gründlich sterilisiert wurde, homogenisieren Sie das infizierte Gehirn in seiner Röhre. Wenn keine sichtbaren Gewebefragmente übrig bleiben, sterilisieren Sie die Spitze erneut, um eine bakterielle Übertragung auf die nächste Organprobe zu verhindern, und homogenisieren Sie das nächste Organ.Wenn alle Organe homogenisiert sind, bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen jedes Organs in sterilem PBS vor und verfestigen die Verdünnungen auf Gehirn-Herz-Infusionsagarplatten. Dann inkubieren Sie die homogenaten Verdünnungskulturen bei 37 Grad Celsius über Nacht und zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte, um die Gesamtzahl der Bakterien pro Organ oder Milliliter Blut zu bestimmen. Die Berechnung der bakteriellen Belastungen in L.monocytogenes-infizierten Mausorganen, wie sie gerade nachgewiesen wurde, legt nahe, dass die Perfusion nach der Infektion die bakterielle Belastung im Blut oder in den Organen infizierter Mäuse, die in dieser repräsentativen Studie untersucht wurden, nicht signifikant verändert.Im Anschluss an dieses Verfahren können Listeria monocytogenes-infizierte Organe für zusätzliche Analysen wie die histopathologische Verarbeitung weiterverarbeitet werden, um zusätzliche Fragen zur Infiltration von Entzündungszellen in infizierte Mausorgane im Vergleich zu nicht infizierten Kontrolltieren zu beantworten. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, zu denken, um Störungen des Gehirns zu vermeiden und minimalen Kontakt zwischen der Schere und dem Gehirngewebe zu halten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Listeria monocytogenes ist ein Modellorganismus für die Untersuchung Immunreaktionen und die genetische Anfälligkeit für Bakterien bei Mäusen intrazellulär. Diese Methode ermöglicht ein bis bakterielle Belastung zu messen und generieren Single-Cell-Suspensionen der Leber und Milz von Mäusen für FACS-Analyse auf Veränderungen in Immunzellen durch Listeria-Infektion zu bestimmen.

Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes</em

Quelle: McMullen, P. D., Freitag, N. E. Bewertung bakterieller Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisierung bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video demonstriert die Injektion von Listeria monocytogenes in die Schwanzvene einer Maus, um systemische Infektionen zu etablieren. Sie zeigt die bakterielle Zirkulation, Organbesiedlung und die Quantifizierung der bakteriellen Belastung im Herzen durch Homogenisierung von Gewebe, serielle...

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Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

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Listeria monocytogenes Infektion des Gehirns

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