Visualisierung zellulären Gibberellin-Ebenen mit NlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Pflanzenentwicklung in Bezug auf die Verteilung von Wachstums-regulatorischen Phytohormonen zu beantworten. Durch den Einsatz genetisch kodierter FRET-Biosensoren, z.B. nlsGPS1, das Gibberelline detektiert, ist es möglich, die dynamische Verteilung wichtiger Verbindungen in Arabidopsis-Geweben an der zellulären Lösung zu messen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Angelegenheit sind, Schwierigkeiten haben, da die Analyse von FRET-Biosensoren eine ratiometrische Bildgebung beinhaltet, die das Rauschen erhöht hat und zusätzliche analytische Schritte im Vergleich zur absichtlichen metrischen Bildgebung.

Beginnen Sie mit der Aussaat von ca. 20 sterilisierten Arabidopsis Samen auf 1/2 Murashige und Skoog oder MS Agar quadratische Platten. Versiegeln Sie die Platten mit Poren-OP-Band und wickeln Sie sie mit Aluminiumfolie für ein bis drei Tage Inkubation bei vier Grad Celsius für die Schichtung. Für die Wurzelbildgebung übertragen Sie die Platten unter den angegebenen Bedingungen drei Tage lang in eine Wachstumskammer in vertikaler Ausrichtung.

Für dunkel gewachsenes Hypocotyl, übertragen Sie die Platten in die Wachstumskammer für einen ein- bis vierstündigen Lichtimpuls, um die Keimung zu synchronisieren. Dann wickeln Sie die Platten mit Aluminiumfolie, und legen Sie sie in der Wachstumskammer in einer vertikalen Ausrichtung für drei Tage. Für stationäre Messungen 50 Mikroliter Mock-Lösung zu einem sauberen Mikroskopschlitten hinzufügen und drei kernlokalisierte Gibberellin-Wahrnehmungssensor ein oder nlsGPS1, die Sämlinge ausdrücken, vorsichtig auf das Dia legen.

Dann erkennen Sie einen Tropfen ein Vakuumfett an jeder Ecke eines sauberen Abdeckung srutschen und sanft platzieren, um Schlupf über die Sämlinge zu decken. Sorgfältiges Hinzufügen zusätzlicher Mock-Lösung, um alle Luftblasen nach Bedarf zu entfernen. Verwenden Sie vor der Gibberellin-Vier- oder GA4-Behandlung eine mit Vakuumfett gefüllte 20-Milliliter-Spritze, die mit einer modifizierten 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit einer Öffnung von einem Millimeter Durchmesser ausgestattet ist, um ein gleichmäßig geschichtetes dreieinhalb Zentimeter langes und zweieinhalb Zentimeter breites Rechteck auf einem sauberen Glasschlitten zu zeichnen.

Fügen Sie 50 Mikroliter Mock-Lösung in die Mitte des Rechtecks und verwenden Sie saubere Zangen, um nlsGPS1 ausdrücken den Sämlinge durch die Unterseite ihrer Cotyledons für eine sorgfältige Übertragung in die Mock-Lösung zu heben. Legen Sie einen mit Vakuumfett gefleckten Deckelschlupf in die Mitte des Vakuumfettrechtecks und füllen Sie das Reservoir vorsichtig mit einer zusätzlichen Mock-Lösung, ohne die Sämlinge zu stören. Dann erfassen Sie Bilder der Sämlinge auf einem konfokalen Mikroskop, das mit geeigneten Lasern für spannende CFP und YFP ausgestattet ist, um Forster Resonanzenergieübertragung simtieren zu können.

Für GA4 für die Behandlung, entfernen Sie den Dia von der Mikroskop-Bühne und stellen Sie einen Timer für 20 Minuten. Entfernen Sie sofort die Mock-Lösung von der rechten Seite des Deckelschlupfes, während Sie 17 Mikroliter einer ViertelMS-Flüssigkeit hinzufügen, die mit einem Mikromolaren GA4 auf der linken Seite des Deckelschlupfs ergänzt wird, bis die gesamte Mock-Lösung ersetzt wurde. Legen Sie dann den Glasschlitten wieder auf die Mikroskopstufe und warten Sie weitere 10 Minuten, bevor Sie das Nach-GA4-Behandlungsbild erhalten.

Um einen Zeitkurs für ein Gewebe von Interesse einzurichten, fügen Sie 200 Mikroliter Mock-Lösung in die Mitte des Perfusionskanals eines ibidi-Sticky-Slide, und legen Sie nlsGPS1 Sämlinge vorsichtig in die Mock-Lösung, wie gezeigt. Verwenden Sie Zangen, um einen Deckelschlupf vorsichtig über die Sämlinge zu legen, indem Sie die Rückseite der Zange verwenden, um sanft auf die äußeren Ränder des Deckels zu drücken, bis er eine starke Bindung mit dem klebrigen Material an der Peripherie des Klebrigen-Schlittens bildet. Verwenden Sie als Nächstes zwei 0,8 Millimeter Innendurchmesser-Bogen-Luer-Steckverbinder und 0,8 Millimeter Silikonrohre mit Innendurchmesser, um den Klebeschlitten mit einer 20-Millimeter-Spritze zu verbinden, die mit Einer Mocklösung gefüllt ist, und um den Schlitten mit einem Auslassbehälter zum Sammeln der Abflusslösung zu verbinden.

Drücken Sie den Kolben vorsichtig, um genügend Lösung in die Kammer zu geben, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind, und laden Sie die Spritze dann auf eine programmierbare Spritzenpumpe. Starten Sie dann die Pumpe, um den Zeitkurs zu initiieren. Bei GA4-Behandlungen während des Zeitverlaufs die Pumpe anhalten, um die Perfusion zu stoppen und den Mitspaltpuffer mit Spritze durch eine Spritze zu ersetzen, die mit einer mit GA4 ergänzten 1 Viertel MS-Flüssigkeit gefüllt ist.

Importieren Sie die Dateien für die 3D-Bildanalyse in das IMARIS-Bildanalyse-Softwareprogramm, und öffnen Sie den Oberflächen-Assistenten. Legen Sie die Hintergrundsubtraktion auf drei Mikrometer und die Schwellenwerte auf den Standardwert fest. Achten Sie bei der Segmentierung der Kerne darauf, die vielen Kerne mit schwacher Fluoreszenz nicht einzubeziehen, da die Signal-Rausch-Ration des Objekts mit nahehintergrund Hintergrundsignalpegeln zu niedrig für die ratiometrische Bildanalyse sein wird.

Maskieren Sie dann die Emissionskanäle CFP und FRET auf der Grundlage der oberflächenbasierten Oberflächen, die mit der YFP-Emission erstellt wurden. Verwenden Sie die Erweiterung des XT-Mittelintensitätsverhältnisses, um ein Verhältnis der Spendererregungsakziensedivierung zu berechnen, dividiert durch die Emission des Spenderanregungsspenders zwischen den mittleren Intensitätswerten der einzelnen Oberflächen in den beiden Kanälen. Um die einzelnen Oberflächen mit dem Emissionsverhältnis nlsGPS1 zu färben, wählen Sie die Farbcodierung mit Statistiken aus und legen Sie das mittlere Intensitätsverhältnis als Statistiktyp fest.

Exportieren Sie unter dem Statistiksymbol die Verhältnisse der einzelnen Werte aus der Tabelle, und kopieren und fügen Sie die Werte in eine Kalkulationstabelle ein, um die Daten grafisch zu reduken. In der Arabidopsis-Wurzel ist der Gradient des nlsGPS1-Emissionsverhältnisses auf niedrige GA4-Werte in den meristematischen und Divisionszonen und auf hohe GA-Werte in der späten Dehnungszone hindeutet. Im Gegensatz dazu wird ein Emissionsverhältnisgradient in nlsGPS1 nicht reagierenden Wurzeln nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass der endogene GA4-Gradient kein Artefakt ist.

Ein nlsGPS1 Emissionsgradient wird auch in dunkel gewachsenen Hypocotyyen mit niedrigen Konzentrationen in den Kotyledonen und den typischen Haken und hohen Konzentrationen in der schnell länglichen Basalregion des Hypocotyls gebildet. Im Gegensatz dazu wird ein Emissionsverhältnisgradient in den nicht reagierenden Hypocotyys nlsGPS1 nicht beobachtet. Darüber hinaus sammelt sich exogen geliefertes GA4 bevorzugt in der Dehnungszone an, verglichen mit der Teilungszone der Arabidopsis-Wurzel, was darauf hinweist, dass nlsGPS1 zur Untersuchung endogenes und exogener GA-Muster verwendet werden kann.

Darüber hinaus zeigt die Zeitverlaufsanalyse von GA4 behandelten nlsGPS1 Sämlingen eine schnellere Ansammlung von exogenem GA4 in der Wurzeldehnung, so im Vergleich zur Teilungszone. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, gesättigte Pixel während der quantitativen Bildgebung zu vermeiden, um die bildgebenden Parameter konstant zu halten und die Drift- und Fokusänderungen während der Probenperfusion zu minimieren. Nach diesem Verfahren ausgearbeitete Methoden, wie bildgebende Wurzeln wachsen in Root-Chip-Typ-Kontroll-Profusion-Geräte können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen darüber zu beantworten, wie GA Gradienten ändern sich in Arabidopsis Wurzelspitzen wachsen mit unterschiedlichen Raten oder als Reaktion auf Stress Nach seiner Entwicklung, diese Technik ebnete den Weg für die Forschung auf dem Gebiet des Pflanzenwachstums, um die dynamische Verteilung der Gibberelline in zusätzlichen Arabidopsis thaliana Gewebe nund Gewebe naugen zu erforschen.