Name: Mit grünen Fluoreszenz Protein exprimierenden verbessert Escherichia Coli Maus peritonealen Makrophagen Phagozytose bewerten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Bewertung der Phagozytosefähigkeit von Maus-Peritonealmakrophagen unter Verwendung von EGFP-exprimierendem Escherichia coli. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung angeborener Immunfunktionen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die National Natural Science Foundation of China (Nr. 31800046) und der naturwissenschaftlichen Grundlage der Provinz Liaoning (Nr. 20170540262) unterstützt diese Arbeit. Diese Arbeit wurde in den Labors der Scientific Research Center an der zweiten Hospital der Dalian Medical University durchgeführt. Die Autoren möchten danke Xiao Lin Sang für ihre Unterstützung bei der Durchflusszytometrie und Bo Qu und Dong-Chuan Yang für ihre Unterstützung bei der Erstellung des Videos.

Alle Verfahren wurden unter den nationalen Instituten der Gesundheitsrichtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, und die Protokolle vom Animal Care und Nutzung Ausschuss der Dalian Medical University angenommen wurden. 16-Monate-alten (mit einem Körpergewicht von 30-35 g) und acht-Woche-alten (20-25 g) SPF (spezifische-Pathogen-freies) männliche C57BL/6 Mäusen stammen aus der SPF Tiere Mitte der Dalian Medical University. Alle Mäuse wurden in Tierhaltung mit Zugang zu Nahrung und Wasser Ad Libitumgehalten. Die Temperatur blieb bei 20-24 ° C, Luftfeuchtigkeit betrug 40 % - 70 %, und Beleuchtung war 12 h Licht/12 h dunkel. Tiere durften für mindestens 7 Tage vor dem Experiment an die Umgebung gewöhnen.
1. Aufbau der Haustier-SUMO-EGFP Plasmid und Induktion von EGFP Ausdruck
<ol><li>EGFP gen Fragment zu synthetisieren (eine 717 bp-Sequenz synthetisiert durch einen benutzerdefinierten gen Synthese Service, siehe Tabelle der Werkstoffe und ergänzende Datei 1 für die Sequenz) und das Fragment mit dem forward Primer (zu verstärken 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3 ") und reverse Primer (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3"), mit hoher Wiedergabetreue Taq-DNA-Polymerase.</li>
	<li>Um sicherzustellen, dass die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Produkte einzelne 3' Adenin Überhängen zum TA Klonen im nächsten Schritt haben, verwenden Sie eine Erweiterung 30 min bei 72 ° C, nachdem die letzte Zyklus (siehe ergänzende Datei 1 für PCR-Zustände). Überprüfen Sie das PCR-Produkt von Agarose-Gelelektrophorese.</li>
	<li>Das PCR-Produkt in den pET-SUMO-Vektor klonen (siehe Tabelle der Materialien) mit der TA Klonen Methode5 mit T4 DNA-Ligase. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur (20-25 ° C) für 30 min. Der Vektor wird zwischen Nukleotiden 653 und 654 mit einer 1 bp 5′ T-Überhang auf jedem Strang linearisiert.</li>
	<li>Verwandeln die Ligatur Produkt in chemisch kompetente BL21(DE) E. Coli -Stamm wie folgt: 5 µL hinzufügen (100 ng) PCR-Produktes zu 100 µL kompetente Zellen BL21(DE) über Hitzeschock bei 42 ° C für 90 s; halten Sie die Mischung für 3 min auf Eis, und fügen Sie 400 µL Lysogeny Brühe (LB) Medium bei 37 ° C für 1 h bei 37 ° C und 120 u/min schütteln vorgewärmt.</li>
	<li>100 µL der Bakterien auf der Oberfläche eines LB-Kanamycin (100 µg/mL) Platte mit dem Induktor Laktose (0,5 Mmol/L), die EGFP Ausdruck Belastung nachgeben zu impfen. Über Nacht inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C. Hinweis: Wenn die EGFP erfolgreich ausgedrückt wird, können einige Kolonien als leuchtend grünes Licht in der Dunkelheit beobachtet werden.<ol>
<li>Wählen Sie optional, Kolonien, das eingefügte EGFP-Fragment durch DNA-Sequenzierung zu überzeugen. Der Primer für die DNA-Sequenzierung sind: vorwärts, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3 "; Revers, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3 ".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eine positive Kolonie in 5 mL LB-Medium mit 100 µg/mL Kanamycin immun. Brüten in einem 37 ° C Inkubator bei 120 u/min für 2 h, schütteln und dann, eine Endkonzentration von 0,5 Mmol/L der Induktor Laktose hinzu und schütteln für 6 h, induzierende EGFP Ausdruck auch weiterhin. Empirisch, beim Schütteln für 6 h, die Extinktion bei 600 nm (OD600) erreichen 0.7 oder höher.</li>
	<li>10 µL des Mediums bakterielle Kultur auf einer Folie hinzufügen, mit einem Deckglas abgedeckt und die Expression von EGFP unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop zu untersuchen. Die EGFP exprimierenden Bakterien können in das Medium bei 2 bis 8 ° C für mehrere Wochen gespeichert werden.</li>
</ol>(2) Maus peritonealen Makrophagen Isolation und Primärkultur
<ol><li>100 mL destilliertes Wasser und Autoklaven die Mischung zu Sterilität vor Gebrauch 3,5 g Thioglykolat hinzufügen. Pumpen Sie das Thioglykolat Medium in 1 mL sterile Spritze in der Haube für die Maus peritonealen Injektion. Verwenden Sie eine Maus pro Spritze, um Infektion zu vermeiden. Die Verwendung von Thioglykolat kann die Anzahl von Makrophagen erhöhen. Die ansässigen peritonealen Makrophagen können isoliert werden ohne Thioglykolat aber mit niedrigeren Renditen Makrophagen.</li>
	<li>Betäuben Sie die Maus mit einer Methode, die von den lokalen Tierpflege und Verwendung Ausschuss genehmigt. Injizieren Sie mit der 1 mL Spritze mit einer Nadel 23 G 1 mL 3,5 % Thioglykolat Medium in der Maus Bauchhöhle. Hinweis: Durch Induktion der Anästhesie, die peritoneale Injektion kann leicht durchgeführt werden und reduziert das Risiko von Verletzungen zu den inneren Organen verursacht durch Injektion.</li>
	<li>Halten Sie die Maus mit Wasser und Nahrung Ad Libitum für 3 Tage. Jeden Tag den Körper Gewicht und Nahrungsaufnahme des Tieres zu überwachen. Wenn der Körper Gewichtsverlust innerhalb von 3 Tagen mehr als 10 % ist, schließen Sie aus, das Tier aus dem Experiment.</li>
	<li>Nach 3 Tagen einschläfern der Maus durch zervikale Dislokation nach Induktion schnell Anästhesie von Sevofluran in einem geschlossenen Kasten. Alternativ können Sie eine Methode, die von Tier Pflege und Verwendung Lokalkomitees an die Maus einschläfern genehmigt wurde.</li>
	<li>Setzen Sie die Maus in eine Schale (mit einem Durchmesser von 10 cm) mit 75 % Ethanol zu sterilisieren, und übertragen Sie es schnell auf der Motorhaube. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einen Teller und pin die Vorderpfote auf dem Brett, um die Maus Position zu fixieren.</li>
	<li>Mit einer 5 mL Spritze befestigt auf 20 G injizieren Nadel, Platzierung der Nadel Abschrägung oben in einem Winkel von 30° - 40° 5 mL kalt (4-10 ° C) Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) am Unterbauch in der Maus Bauchhöhle, Punktion des Darms zu vermeiden. Wenn der Darm (oder jedes andere Organ) punktiert wird, können die Maus und ihre Zellen nicht mehr werden für Experimente, verwendet wie diese Zellen aktivieren kann, die nicht zur primären Zellkulturen eignen.</li>
	<li>Führen Sie eine sanfte Massage auf beiden Seiten der Maus Abdomen. Dann abzusaugen Sie die Flüssigkeit sanft und langsam. Die peritoneale Flüssigkeit in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen zu verzichten. Wiederholen Sie diese Schritte, 2 X oder 3 X.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die suspendierten Zellen für 10 min bei 400 X g in einer gekühlten Zentrifuge (4-8 ° C). Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in RPMI 1640 Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS). Zählen der Zellen. Die Zelldichte ist empirisch, 5 x 106 Zellen/mL annähernd gleich, wenn die Zellen in 10 mL Medium Nukleinsäuretablette sind.</li>
	<li>5 x 106 Zellen in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte für die Flow Cytometry Assay und 5 x 105 Zellen pro Bohrloch in einer 24-Well-Platte für ein Fluoreszenzmikroskop hinzufügen. Kulturzellen Sie die bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator über Nacht. Das Kulturmedium kann aktualisiert werden, nach 3 h nonadherent Zellen zu entfernen, weil die meisten davon Lymphozyten sind. Adhärenten Zellen sind vor allem die Makrophagen, und sie können gut auf Gewebe-Kultur behandelt Kunststoff halten.</li>
</ol>(3) Makrophagen Phagozytose Assay mit dem Fluoreszenzmikroskop
<ol><li>Beobachten Sie die Zellen unter dem Hellfeld Mikroskop, Zellviabilität und Zelldichte zu bewerten.</li>
	<li>Entfernen Sie das Kulturmedium aus 24-Well-Platte. Fügen Sie 100 µL frisches Nährmedium und 10 µL Bakteriensuspension (ca. 2 x 107 Zellen) in jedem Brunnen wie in Tabelle 1beschrieben. 1 h in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie vorsichtig 3 x-5 x mit kaltem PBS 500 µL pro Bohrloch zum Auswaschen von noninternalized Bakterien.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit 4 % Formaldehyd in PBS bei Raumtemperatur für 30 min.</li>
	<li>Waschen Sie die festen Zellen 3 X mit PBS (500 µL/Well).</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Phalloidin 633 Fluoreszenz färben konjugierten Arbeitslösung (siehe Tabelle der Materialien), die F-Aktin zu beflecken. An einem dunklen, feuchten Ort (60-80 %) bei Raumtemperatur für 60 min. Spülen die Zellen 3 X mit PBS (500 µL/Well), überschüssige Phalloidin zu entfernen. Durch Färbung der F-Aktin, Zytoplasma kann beschrieben werden und dazu beitragen, die internalisierten Bakterien unterscheiden.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Arbeitslösung DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole) (1 µg/mL) zu färben den Zellkern und 5 min in einem dunklen, feuchten Ort bei Raumtemperatur inkubieren. Spülen mit PBS 1 X (500 µL/Well) und 1 X mit dem gleichen Volumen von destilliertem Wasser. Dann werden die Zellen bereit für die Beobachtung unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop.</li>
</ol>(4) Makrophagen Phagozytose Assay mit Durchflusszytometrie
<ol><li>Die experimentellen Fehler zu minimieren und machen eine korrekte Interpretation der Ergebnisse, die Gruppen und Rohre für das Experiment zu steuern, wie in Tabelle 2aufgeführt.<ol>
<li>Für die Kontrollgruppe, die auf dem Eis (Gruppe 4 in Tabelle 2) platziert werden, entfernen Sie das Medium aus der 6-Well-Platte und waschen Sie es 1 X mit PBS. Fügen Sie 1 mL kaltem 70 mM EDTA in den Brunnen zu lösen die Zellen und übertragen Sie sie auf das Durchflussrohr Zytometrie. Fügen Sie 50 µL Bakteriensuspension in das Rohr und legen Sie es auf dem Eis für 1 h.</li>
		<li>Entfernen Sie für die anderen Gruppen das Kulturmedium. Fügen Sie 1 mL frisches Medium in jede Vertiefung. Fügen Sie 50 µL Bakteriensuspension in die Vertiefungen je nach Gruppeneinstellung, wie in Tabelle 2beschrieben. Dann setzen Sie die 6-Well-Platte in das 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator für 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um die Fluoreszenz des noninternalized E. Colizu stillen, fügen Sie 200 µL von 0,8 % Kristallviolett (CV)-Wasser-Lösung in den Brunnen und wiegen kurz, wodurch ein falsch-positives Ergebnis durch die EGFP exprimierenden E. Coli -Bindung an die Oberfläche von der Makrophagen aber nicht verinnerlicht. Waschen Sie die Zellen 3 X mit PBS, passives Lebenslauf zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL kaltem 70 mM EDTA in den Brunnen zu lösen die Zellen und übertragen Sie sie auf das Durchflussrohr Zytometrie.</li>
	<li>Die Rohre bei 400 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 µL PBS, die Zellen erneut hinzu. Fügen Sie 5 µL von F4/80-PE-konjugierten Antikörpern (ein Oberflächenantigen ausgedrückt auf Maus Makrophagen hinzu) in den Rohren oder Verwendung IgG2a-PE Isotype, entsprechend der Gruppeneinstellung. Vortex kurz und die Proben auf Eis für 5-10 Minuten im Dunkeln inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL PBS in jedes Rohr und Zentrifuge bei 400 X g für 5 min. Überstands verwerfen. Die Zelle-Pellets mit 200-300 µL PBS für Flow-Zytometrie Analyse aufzuwirbeln. Führen Sie jedes Rohr und Erfassung von Daten für mindestens 10.000 Veranstaltungen von F4/80+ Zellen.</li>
</ol>

<ol><li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52749(2015).</li>
<li>Iskander, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis%3A+multiple+abnormalities%2C+heterogeneous+responses%2C+and+evolving+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding.</a> Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).</li>
<li>Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+severe+sepsis+in+older+patients%3A+from+epidemiology+to+evidence-based+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).</li>
<li>Bicker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+assay+to+measure+phagocytosis+of+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria.</a> Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).</li>
<li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+TA+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Issues+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2+protects+against+polymicrobial+sepsis+by+enhancing+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).</li>
<li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Macrophage+Early+and+Late+Endosomes+by+Latex+Bead+Internalization+and+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Weingart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labels+influence+phagocytosis+of+Bordetella+pertussis+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).</li>
<li>Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+flow+cytometric+method+to+evaluate+phagocytosis+of+pHrodo+BioParticles%28R%29+by+granulocytes+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).</li>
<li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+fluorometric+technique+for+assessment+of+macrophage+phagocytosis+and+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52195(2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Schritte in diesem Protokoll sind ganz einfach und unkompliziert. Die entscheidenden Schritte gehört, EGFP Ausdruck auf E. Colizu induzieren. In der Regel, wenn ein Gen von Eukaryoten, wie EGFP, in Prokaryoten wie E. Colizum Ausdruck bringen soll, besteht die Gefahr, dass das Protein inaktiv Aggregate (Einschlusskörperchen), bildet die native Struktur und Aktivität des Proteins verändert. Durch die Verwendung des Haustier-SUMO-Vektors und Bau das Haustier-SUMO-EGFP-Plasmid, EGFP-SUMO-Fusionsprotein ...

Makrophagen Phagozytose Assays werden häufig verwendet, um die angeborene immune Funktion zu studieren. Die angeborene Immunantwort kann Anfälligkeit zur Infektion hindeuten. Makrophagen-Zelllinien sind weit verbreitet in Immunologie Studien. Jedoch kann die längere Passage Genverlust und Immunfunktionen in diesen Zelllinien in Frage gestellt. So sind die primären peritonealen Makrophagen das ideale Objekt, um die Zelle Funktion1zu studieren.
Obwohl die angeborene Immunantwort im gealterten Körper intakt zu sein gedacht war, kann die phagocytic Fähigkeit im Vergleich zu verringern, dass in den jüngeren2,3 Körper. Hier zeigen wir eine Methode zur Bestimmung der Phagozytose von peritonealen Makrophagen von jung (acht-Woche-alten) und Alter (16-Monate-alten) Maus mit EGFP exprimierenden E. Coli, die bequem, schnell und wirtschaftlich machbar ist.
Die Verwendung von einem EGFP exprimierenden E. Coli -Stamm ist einer der Vorteile des Assays weil diese Bakterien stabil sind und zeigen eine starke Fluoreszenz-Signal, auch nach der Makrophagen durch 4 % (w/V) Paraformaldehyd fixiert sind. Darüber hinaus durch die Verwendung der EGFP exprimierenden E. Coli, Forscher müssen nicht weiter Färbung nach Phagozytose, was Zeit spart. Darüber hinaus sind Makrophagen Immunoresponsive für E. Coli Oberflächenantigen, so dass E. Coli für die Phagozytose-Assay als mit EGFP exprimierenden Pilze oder Fluorescein-markierten Perlen.
Mit EGFP exprimierenden E. Coliein Phagozytose-Assay problemlos in 2 h erreicht und durch beide Flow Cytometry und Fluoreszenz-Mikroskopie, je nach Zweck des Forschers gemessen. Da diese Methode direkt die phagocytic Fähigkeit misst, sind die Ergebnisse mehr als andere indirekte Methoden reproduzierbar.
Diese Methode wurde auch in einer RAW264.7 Zelllinie validiert und Menschenblut peripheren mononukleären Zellen4. Der folgende Text bietet detaillierte schrittweisen Anleitungen für die Durchführung dieses Assays und unterstreicht die entscheidenden Schritte, die die Forscher ändern können, um die Bedürfnisse ihrer Experimente.

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences-Biotin</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Anti-Maus CD16/32 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>Cat101303</td><td></td></tr><tr><td>Champion pET SUMO Protein Expression System</td><td>Invitrogen</td><td>K300-01</td><td></td></tr><tr><td>Custom Gene Synthesis Service</td><td>Takara Biotech.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE Anti-Maus-Antikörper für FACS</td><td>Biolegend</td><td>Cat123110</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI3000 B&nbsp; Inverses Mikroskop</td><td>Leica Microsystems-PE</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ratte IgG2a, &kappa;-Isotypkontrolle</td><td>Biolegend</td><td>Cat400507</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin 633 Fluoreszenzfarbstoff konjugierte Arbeitslösung</td><td>AAT Bioquest</td><td>Cat23125</td><td></td></tr><tr><td>Thioglycollatmedium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9032</td><td></td></tr></tbody></table>

mit grünen fluoreszenz protein exprimierenden verbessert escherichia coli maus peritonealen makrophagen phagozytose bewerten

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Dieses Manuskript beschreibt eine einfache und reproduzierbare Methode um eine Phagozytose-Test durchzuführen. Der erste Teil dieser Methode beinhaltet den Aufbau eines Haustier-SUMO-EGFP-Vektors (SUMO = kleine Ubiquitin-ähnliche Modifikator ") und mit dem Ausdruck grüne Fluoreszenz Protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE) erweitert. EGFP exprimierenden E. Coli ist mit Makrophagen für 1 h bei 37 ° C coincubated; die negative Kontrollgruppe wird für die gleiche Menge an Zeit auf Eis inkubiert. Dann sind die Makrophagen für die Bewertung bereit. Die Vorteile dieser Technik sind seine einfache und unkomplizierte Schritte und Phagozytose durch beide Flow Cytometer und Fluoreszenz-Mikroskop gemessen werden. EGFP exprimierenden E. Coli sind stabil und eine starke Fluoreszenz-Signal angezeigt, auch nachdem die Makrophagen mit Paraformaldehyd fixiert sind. Diese Methode ist nicht nur geeignet für die Beurteilung der Makrophagen-Zelllinien oder primären Makrophagen in Vitro, aber auch geeignet für die Bewertung von Granulozyten und Monocyte Phagozytose in peripheren mononukleären Blutzellen. Die Ergebnisse zeigen, dass die phagocytic Fähigkeit der peritonealen Makrophagen von jungen Mäusen (acht-Woche-alten) höher als die von Makrophagen aus Alter (16-Monate-alten) Mäuse. Zusammenfassend lässt sich sagen diese Methode misst Makrophagen Phagozytose und eignet sich für die Untersuchung der Funktion des angeborenen Immunsystems.

Der Haustier-SUMO-Vektor nutzt eine kleine Ubiquitin-ähnliche Modifikator "um die Expression von nativen Proteinen in E. Colizu ermöglichen. SUMO-Fusion kann erheblich verbessern die EGFP Löslichkeit, so dass sie leicht erkannt werden. Wenn der Ausdruck EGFP erfolgreich durch Laktose induziert wird, können grüne Kolonien im Dunkeln (Abbildung 1A) beobachtet werden. Grüne Punkte, die EGFP exprimierenden E. Colidarstellen, können unter dem Flu...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Maus peritonealen Makrophagen Phagozytose mit verstärkten grünen Fluoreszenz Protein exprimierenden Escherichia colizu beurteilen.

Mit grünen Fluoreszenz Protein exprimierenden verbessert Escherichia Coli Maus peritonealen Makrophagen Phagozytose bewerten

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Dieses Protokoll zeigte eine einfache und produzierbare Methode zur Beurteilung der Phagozytosefähigkeit von Makrophagen mit EGFP-exekomsochierender Escherichia coli. Hallo, mein Name ist Jun-Yu vom Zweiten Krankenhaus der Dalian Medical University. Heute werden wir Ihnen eine einfache zeigen und visualisieren die Art und Weise, Makrophage Phagozytose zu bewerten, die leicht innerhalb von zwei Stunden getan werden kann.Diese Methode wurde häufig in der Studie der angeborenen Immunfunktion verwendet. Es wird angenommen, dass angeborene Immunfunktion bei älteren Menschen intakt blieb. Heute werden wir also die peritonealen Makrophagen von den alten und jungen Mäusen isolieren und die phagozytische Fähigkeit dieser beiden Gruppen sehen.Nun, lassen Sie uns beginnen. Erstens, synthetisieren Sie das EGFP-Genfragment und klonen Sie das Fragment mit High-Fidelity-Taq-DNA-Polymerase. Dann ligate das PCR-Produkt in den pET SUMO-Vektor.Drittens: Umwandlung der Ligationsprodukte in den E.coli-Stamm und Induzieren EGFP-Exzess mit Laktose. Diese EGFP-exemitzenden E.coli dienten als Marker für den Phagozytose-Assay. Als nächstes wurden eine MausperitoneumMakrophagen isoliert und kultiviert.Dann wurden EGFP-exezierende E.coli mit den Makrophagen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius geprägt. Nach dem Löschschritt waren die Makrophagen sowohl mit dem Fluoreszenzmikroskop als auch mit dem Durchflusszytometer zur Bewertung bereit. Synthetisieren Sie das EGFP-Genfragment und verstärken Sie das Fragment mit einer Vorwärts- und Reverse-Primer mit High-Fidelity-Taq-DNA-Polymerase.Um sicherzustellen, dass die PCR-Produkte im nächsten Schritt über einzelne Drei-End-Adeninüberhänge für das TA-Klonen verfügen, wird eine 30-minütige Verlängerung bei 72 Grad Celsius nach dem letzten Zyklus empfohlen. Überprüfen Sie das PCR-Produkt durch Agarose-Gel-Elektrophorese. Wenn das Fragment richtig verstärkt wurde, kann ein 717 bp Band auf dem Gel beobachtet werden.Klonen Sie das PCR-Produkt in den pET SUMO-Vektor mit der TA-Klonmethode mit T4-DNA-Ligase. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Fügen Sie fünf Mikroliter PCR-Produkt in 100 Mikroliter BL21 kompetente Zellen.Hitze schockieren die Zellen bei 42 Grad Zenigre für 90 Sekunden, dann halten Sie die Mischung auf Eis für drei Minuten. Fügen Sie 400 Mikroliter LB Medium, vorgewärmt bei 37 Grad Celsius. Schütteln eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 120 Rpm.Impfen Sie die Bakterien auf die Oberfläche der LB-Platte mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin, um den vektortransformierten E.coli zu untersuchen. Inkubieren Sie die Platte im 37 Grad Centigrees Ofen über Nacht. Am nächsten Tag impfen Sie eine positive Kolonie in fünf Milliliter LB-Medien mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin.Inkubieren Sie im 37 Grad Zentigraner Schütteltinkubator bei 120 Rpm für zwei Stunden. Dann fügen Sie den Induktor Lactose zu einer endlichen Konzentration von 0,5 Millimole pro Liter und weiterhin sechs Stunden schütteln, was EGFP-Expression induziert. Empirisch kann der OD600 beim Schütteln sechs Stunden 0,7 oder höher erreichen.Schließlich mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops, um das Ausmaß der EGFP-Exzesszugung zu überprüfen. 10 Mikroliter des Bakteriellen Kulturmediums zu einer Folie hinzufügen. Dann mit einem Deckelzettel abdecken.Untersuchen Sie die Expression von EGFP unter dem Fluoreszenzmikroskop. 3,5 Gramm Thioglycolat in 100 Milliliter destilliertes Wasser geben. Sterilisieren Sie im Autoklaven vor der Verwendung.Das Thioglycolatmedium in die ein Milliliter sterile Spritze in der Haube aspirieren. Eine Maus pro Spritze, um die Infektion zu vermeiden. Injizieren Sie einen Milliliter 3,5% Thioglycolatmedium in die Peritonealhöhle der Maus mit einer 23-Spur-Nadel und halten Sie die Maus mit Wasser und Nahrung ad libitum für drei Tage.Nach drei Tagen, euthanisieren Sie die Maus durch Zervixdislokation nach schnell induzieren Anästhesie durch Sevofluran in einem geschlossenen Kasten. Dann legen Sie die Maus in eine Schüssel mit 75% Ethanol steril und schnell in die Haube übertragen. Legen Sie die Maus auf die Platte und heften Sie die Vorderpfote auf das Brett, um die Mausposition zu fixieren.Mit einer Fünf-Milliliter-Spritze mit einer 20-Spur-Nadel, injizieren Fünf Milliliter kalte PBS am unteren Bauch in die Peritonealhöhle der Maus, um zu vermeiden, den Darm zu durchdringen. Führen Sie eine sanfte Massage auf zwei Seiten des Mausbauchs durch. Dann die Bauchflüssigkeit sanft und langsam ansaugen.Geben Sie die Peritonealflüssigkeit in ein 50-Milliliter-Zenrichreöhre. Wiederholen Sie diese Schritte zwei- oder dreimal. Zentrifugieren Sie die suspendierten Zellen für 10 Minuten bei 400 g in vier bis acht Grad Celsius.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in RPMI 1640 medium mit 10% fetalem Rinderserum wieder auf. Fügen Sie fünf Millionen Zellen in jeden Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte für den Durchflusszytometrie-Assay und 500.000 Zellen pro Well in eine 24-Well-Platte für das Fluoreszenzmikroskop ein. Kultur die Zellen bei 37 Grad Zenigrees in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator über Nacht.Das Kulturmedium kann nach drei Stunden erfrischt werden, um nicht haftende Zellen zu entfernen, da die meisten davon Lymphozyten waren. Beobachten Sie die Zellen unter einem Lichtfeldmikroskop, um die Zelllebensfähigkeit und Zelldichte zu bewerten. Das hier gezeigte Bild befand sich im normalen Zustand der Primärzelle.Normalerweise war die Makrophagenzelldichte nicht hoch, da ein Großteil der Peritonealzellen Lymphozyten waren. Entfernen Sie das Kulturmedium von der 24-Well-Platte. Fügen Sie 100 Mikroliter frisches Kulturmedium und 10 Mikroliter bakterielles Medium hinzu.Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Zenigrees in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator für eine Stunde. Mit 500 Mikroliter kaltem PBS pro Brunnen drei- bis fünfmal sanft waschen, um nicht-internalisierte Bakterien auszuwaschen. Inkubieren Sie die Zellen mit 4%Formaldehyd in PBS bei Raumtemperatur für 30 Minuten.Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Phalloidin 633 konjugieren arbeitslösung hinzufügen, um F-Actin zu färben. 60 Minuten an einem dunklen, feuchten Ort bei Raumtemperatur aufbewahren.Fügen Sie die DAPI-Arbeitslösung hinzu, um die Zelle kernnuklear zu färben und fünf Minuten lang an einem dunklen Ort bei Raumtemperatur zu brüten. Einmal mit PBS und einmal mit der gleichen Menge in destilliertem Wasser abspülen. Die EGFP-exemitende E.coli in grün dargestellt diente als Marker der Phagozytose.Um experimentelle Fehler zu minimieren und die Ergebnisse richtig zu interpretieren, legen Sie Gruppen und Steuerrohre für das Experiment fest, wie in Tabelle 2 aufgeführt. Für die Kontrollgruppe, die auf das Eis gelegt wird, entfernen Sie das Medium von der Sechs-Brunnen-Platte und waschen Sie es einmal mit PBS. Dann fügen Sie 70 Millimole pro Liter kalte EDTA einen Milliliter in den Brunnen, um die Zellen zu lösen und in den Durchfluss Zytometrierohr übertragen.50 Mikroliter bakterielle Suspension in die Röhre geben und eine Stunde lang auf das Eis legen. Für die anderen Gruppen, entfernen Sie das Kulturmedium, fügen Sie jeweils einen Milliliter frisches Medium in jeden Brunnen. Fügen Sie 50 Mikroliter Bakteriensuspension in die Brunnen nach der Gruppeneinstellung, wie in Tabelle 2 beschrieben.Dann legen Sie die Sechs-Well-Platte in den 37 Grad Zentiären 5% Kohlendioxid-Inkubator für eine Stunde. Um die Fluoreszenz von nicht-internalisiertem E.coli zu löschen, fügen Sie 200 Mikroliter 0,8% kristallviolette Wasserlösung in den Brunnen und schwanken sie kurz. Dieser Schritt zielte darauf ab, falsch positive Ergebnisse durch die EGFP E.coli Bindung an die Oberfläche der Makrophagen zu vermeiden, aber nicht internalisiert.Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, um Restkristallviolett zu entfernen. Dann fügen Sie 70 Millimole pro Liter kalte EDTA einen Milliliter in den Brunnen, um die Zellen zu lösen und in den Durchfluss Zytometrierohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Rohre 2.000 U/min fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand.Fügen Sie 100 Mikroliter PBS hinzu, um die Zellen wieder auszusetzen. Fügen Sie fünf Mikroliter F4 ATP konjugierten Antikörper in die Rohre oder Isotyp entsprechend der Gruppeneinstellung. Wirbel kurz und inkubieren die Proben auf Eis für fünf bis zehn Minuten im Dunkeln.Fügen Sie eine Milliliter PBS in jedes Rohr und Zentrifuge 2 000 U/min fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellpellets mit 200 bis 300 Mikroliter PBS für die Durchflusszytometrieanalyse wieder aus.Führen Sie jede Röhre aus und erfassen Sie Daten für mindestens 10.000 Ereignisse von F4/80-positiven Zellen. Hier sind die Fluoreszenzbilder von peritonealen Makrophagen aus jungen und älteren Gruppen. Die rote Fluoreszenz steht für F-Actin.Das Grün steht für EGFP-exemittierte E.coli, und das Blau steht für den von DAPI gebeizten Kern. Diese Bilder deuten darauf hin, dass Makrophagen der jungen Maus eine stärkere phagozytische Fähigkeit hatten als die von der gealterten Maus. Die F4/80-positiven und EGFP-positiven Zellen zeigten die phagozytische Fähigkeit der Makrophagen an.Diese Ergebnisse stimmen mit dem Trend der Fluoreszenzmikroskop-Ergebnisse überein. Nun, Sie sehen, obwohl die Anzahl der angeborenen Immunzellen bei alter Maus erhalten bleiben kann, verringerte sich die phagozytische Fähigkeit signifikant im Vergleich zur jungen Maus. Viele Methoden wurden verwendet, um Makrophagenphagozytose zu bewerten.Hier zeigen wir eine verbesserte Methode, die bequem, schnell und wirtschaftlich machbar ist. Mit EGFP-exezierendem E.coli kann ein Phagozytose-Assay leicht mit durchFlusszytometer und Fluoreszenzmikroskop nach den Vorlieben des Forschers durchgeführt und gemessen werden. Auch diese Methode misst direkt die phagozytische Fähigkeit.Die Ergebnisse sind reproduzierbarer als andere indirekte Methoden.

using-enhanced-green-fluorescence-protein-expressing-escherichia-coli

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

M-Zellen in einem spezialisierten Follikel-assoziierte Epithel Peyer-Plaques eine wichtige Rolle spielen für die Schleimhaut Immunüberwachung im Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir die Auswertungsverfahren für die bakterielle Transzytose von...

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

Makrophagen sind seit langem als eine kritische Komponente der angeborenen und erworbenen Immunantworten erkannt. Die jüngste Explosion des Wissens im Zusammenhang mit evolutionären, genetischen und biochemischen Aspekte der Interaktion zwischen Makrophagen und Mikroben hat die wissenschaftliche Aufmerksamkeit auf Makrophagen erneuert. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Makrophagen aus Knochenmark der Maus zu unterscheiden.

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Elektroporation wurde verwendet, um gereinigte bakterielle Virulenzeffektorproteine direkt in lebende eukaryotische Zellen einzubringen. Die Proteinlokalisation wurde durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie überwacht. Diese Methode ermöglicht Studien zum Transport, zur Funktion und zu Protein-Protein-Wechselwirkungen mit aktiven exogenen Proteinen, wodurch die Notwendigkeit einer heterologen Expression in eukaryotischen Zellen vermieden wird.

Elektroporation von Functional bakterielle Effektoren in Säugerzellen

Weg zur Rationalisierung der Screening für die Expression des rekombinanten Membranproteine ​​in Escherichia coli, basierend auf Fusions grün fluoreszierendes Protein dargestellt.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

Ein detailliertes Protokoll von einem Maus-Modell für Enterohemorrhagic E. Coli (EHEC) Besiedlung durch mit Hilfe von Bakterien mit der Bezeichnung der Biolumineszenz wird vorgestellt. Die Erkennung dieser biolumineszenten Bakterien durch eine nicht-invasive in Vivo imaging-System mit lebenden Tieren kann unser gegenwärtige Verständnis der EHEC Besiedlung voraus.

Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

Hier beschreiben wir Methoden mit Spinning Disk konfokalen Mikroskopie zu Bild phagocytic Einzelveranstaltungen durch Maus resident peritonealen Makrophagen. Die Protokolle können auf andere phagocytic Zellen ausgedehnt werden.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Efferocytosis, die phagocytic Entfernung der Apoptotic Zellen ist erforderlich, um die Homöostase und wird erleichtert durch die Rezeptoren und Signalwege, die für die Anerkennung, Engulfment und Internalisierung der Apoptotic Zellen ermöglichen. Hier präsentieren wir ein Fluoreszenz-Mikroskopie-Protokoll für die Quantifizierung des Efferocytosis und die Aktivität der Efferocytic Signalwege.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Hier berichten wir über gemeinsame Methoden für die Analyse der phagocytic Funktion der murinen alveolären Makrophagen und bakterielle Freiraum aus der Lunge. Diese Methoden studieren in-vitro-Phagozytose von Fluorescein Herstellung Perlen und in-vivo Phagozytose von Pseudomonas Aeruginosa Green Fluorescent Protein. Wir beschreiben auch eine Methode für das clearing von p. Aeruginosa bei Mäusen.

Alveolären Makrophagen Phagozytose und Bakterien-Clearance bei Mäusen

Makrophagen, insbesondere primäre Makrophagen, sind eine Herausforderung zu transfetieren, da sie sich auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisieren. Wir beschreiben ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von primären Makrophagen mit mRNA ermöglicht, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden.

Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das den organweiten Nachweis pathogener Bakterien während der Infektion und die Quantifizierung der fluoreszierenden Reporteraktivitäten ermöglicht.

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-enzymatische und unkomplizierte Methode zur Isolierung von 7-9 Tage alten neonatalen Knochenmarkzellen der Maus und zur Erzeugung differenzierter Makrophagen unter Verwendung eines Überstands von L929-Zellen als Quelle für den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF). Die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen wurden weiterhin auf die Oberflächenantigene F4/80, CD206, CD11b und funktionelle Kompetenz analysiert.

Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen

Lernen Sie eine Methode zur Bewertung der Phagozytosefähigkeit von Maus-Peritonealmakrophagen unter Verwendung von EGFP-exprimierendem Escherichia coli. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung angeborener Immunfunktionen.

Mit grünen Fluoreszenz Protein exprimierenden verbessert Escherichia Coli Maus peritonealen Makrophagen Phagozytose bewerten

Weitere Videos entdecken