Name: Vorbereitung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit chemischen Trocknung für die morphologische Analyse in Rasterelektronenmikroskopie (SEM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Lernen Sie die chemische Trocknung mit Hexamethyldisilazan und T-Butylalkohol für die Rasterelektronenmikroskopie von Cyanobakterien, Euglenoiden und Drosophila melanogaster. Diese Methode ermöglicht präzise morphologische Analysen ohne spezialisierte Trocknungsgeräte.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss an MLS und ein Sommer Scholar Award, MAK aus dem Office of Research und Graduate Studies an der Central Michigan University finanziert. Cyanobakterien waren von der Zimba und Plankton Lab, Teil des Zentrums für Coastal Studien, Texas A & M University an Fronleichnam bereitgestellt. Euglenoids wurden von Triemer Lab, Michigan State University geliefert.

1. Vorbereitung und Fixierung
<ol><li>Cyanobakterien vorzubereiten.<ol>
<li>Unialgal Kulturen in f/2 Medien24,25 bei einer Temperatur von 28 ° C auf einem 14:10 h wachsen Licht-dunklen Zyklus. Übertragen Sie ausreichend Kultur zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, so dass nach Abzug der 15 min zu begleichen, die bakterielle Pellet ca. 0,05 mL Größe. Entfernen Sie den Datenträger ersetzen mit 1,5 mL Fixativ (1,25 % Glutaraldehyd, 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,0), sanft mehrmals umkehren und über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
		<li>Die festen Zellen mit einer Glaspipette in ein 10 mL-Filtration-Rig (Abbildung 1) mit einer Polycarbonat-25 mm-Filter mit 0,8 oder 0,2 µm-Poren, abhängig von der Größe der Zellen zu übertragen. Der Seitenarm verschließen und Trichter mit Gummistopfen, die Kultur in den Trichter zu enthalten. Entfernen Sie das Fixiermittel durch sanfte Vakuum auf die Filtration Kolben, nach dem Entfernen der beiden Stopper. Hinweis: Wenn die Zelldichte auf dem Polycarbonat-Filter nicht optimal ist, passen Sie die Menge der verwendeten Kultur ab.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die einzelligen Algen (Euglenoids).<ol>
<li>Wachsen Unialgal Kulturen in AF-6 Medien26 mit 150 mL L-1 von handelsüblichen Bodenwasser Medium hinzugefügt zu den Medien, bei einer Temperatur von 22 ° C auf einem 14:10 h Licht-dunklen Zyklus. Transfer von 2 mL mit niedriger Dichte (OD600 < 0,5) Kultur mit einer Glaspipette in ein 10 mL-Filtration-Rig (Abbildung 1), einen Polycarbonat 25 mm Filter mit 8 µm-Poren enthält. Der Seitenarm verschließen und Trichter mit Gummistopfen, die Kultur in den Trichter zu enthalten. Hinweis: Wenn die Zelldichte auf dem Polycarbonat-Filter nicht optimal ist, passen Sie die Menge der verwendeten Kultur ab.</li>
		<li>Fügen Sie drei Tropfen 4 % Osmium ausgefällt (OsO4) direkt an die Kultur und inkubieren Sie für 30 min. entfernen das Fixiermittel durch sanfte Vakuum auf die Filtration-Flasche nach dem Entfernen der beiden stopfen lassen. Hinweis: OsO4 ist eine akute Toxin (dermal, Oral und Inhalation Routen), ätzend auf die Haut, die schädlich für die Augen und Atemwege sensibilisierend. OsO4 sollten in einem chemischen Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhe, Kittel und Augenschutz behandelt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drosophila Melanogaster (Fruchtfliege)23vorzubereiten.<ol>
<li>Fliegen mit 100 % Kohlendioxid zu betäuben. Platz betäubt Erwachsene (etwa 10 bis 30 fliegen) in einem kleinen Kunststoff-Schraubverschluss Vial oder 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Tauchen Sie narkotisierten fliegen in 1 mL Fixativ (1,25 % Glutaraldehyd, 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,2) für 2 Stunden (oder über Nacht) bei 4 ° C. Wenn die fliegen an der Oberfläche des Fixiermittels schweben, Tropfen Sie ein paar 2,5 % Polyethylenglykol Tert-Octylphenyl Ether, die Oberflächenspannung des das Fixiermittel für totale Überflutung des Gewebes zu schwächen. Entfernen Sie das Fixiermittel mit einem Glas pipettieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Waschen und Austrocknung
<ol><li>Waschen und Cyanobakterien zu entwässern.<ol>
<li>Waschen Sie die feste Probe dreimal mit 5 mL 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,0 bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Halten Sie die Flasche und Trichter verschlossen um die Wäsche zu halten. Entfernen Sie jedem Waschgang durch sanfte Vakuum auf die Filtration-Flasche nach dem Entfernen der beiden Stopper.</li>
		<li>Die Probe unter Beibehaltung der kontinuierlichen eintauchen mit einer abgestuften Ethanol-Reihe, für 10 min in einem Volumen von 5 mL in den Trichter zu entwässern. Die abgestufte Ethanol-Konzentrationen sind: 25 %, 50 %, 75 %, 95 % und 2 Änderungen von 100 % Ethanol. Halten Sie die Flasche und Trichter verschlossen um das Ethanol in den Trichter verhindert Verlust enthalten beide über Verdunstung und passive Durchströmung des Filters.</li>
		<li>Entfernen Sie Ethanol durch sanfte Vakuum auf die Filtration-Flasche nach dem Entfernen der beiden Stopper. Übertragen Sie die Filter/Probe auf eine Einweg-Aluminium mit einem Gewicht von Schale mit gerade genug 100 % Ethanol zur Deckung die Probe vor der Trocknung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie und trocknen Sie einzelligen Algen (Euglenoids).<ol>
<li>Waschen Sie die feste Probe dreimal mit 5 mL entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Halten Sie die Flasche und Trichter verschlossen um die Wäsche in den Trichter enthalten. Entfernen Sie jedem Waschgang durch sanfte Vakuum auf die Filtration-Flasche nach dem Entfernen der beiden Stopper.</li>
		<li>Die Probe unter Beibehaltung der kontinuierlichen eintauchen mit einer abgestuften Ethanol-Reihe für 10 min in einem Volumen von 5 mL in den Trichter zu entwässern. Die abgestufte Ethanol-Konzentrationen sind: 25 %, 50 %, 75 %, 95 % und 2 Änderungen von 100 % Ethanol. Halten Sie die Flasche und Trichter verschlossen um das Ethanol in den Trichter verhindert Verlust enthalten beide über Verdunstung und passive Durchströmung des Filters.</li>
		<li>Entfernen Sie das Ethanol durch sanfte Vakuum auf die Filtration Kolben, nach dem Entfernen der beiden Stopper. Übertragen Sie die Filter/Probe auf eine Einweg-Aluminium mit einem Gewicht von Schale mit gerade genug 100 % Ethanol zur Deckung die Probe vor der Trocknung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen und Drosophila Melanogaster (Fruchtfliege) zu entwässern.<ol>
<li>Waschen Sie die feste Probe dreimal mit 1 mL 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,2 bei Raumtemperatur für 10 min in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Entfernen Sie jedem Waschgang mit einer Glaspipette, wobei Sie darauf achten, nicht um die fliegen zu entfernen.</li>
		<li>Die Probe mit Hilfe einer abgestuften Ethanol-Reihe für 10 min in ein Volumen von 1 mL in einem Microfuge Rohr zu entwässern. Die Ethanol-Konzentrationen sind: 25 %, 50 %, 75 %, 80 %, 95 %, 100 %. Entfernen Sie das Ethanol mit einer Glaspipette, wobei Sie darauf achten, nicht um die fliegen zu entfernen.</li>
		<li>Behalten Sie die Probe in den 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit gerade genug 100 % Ethanol auf die Probe vor der Trocknung zu decken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Trocknung
<ol><li>Führen Sie die chemische Trocknung mit t-Butyl-Alkohol (TBA)-27.<ol>
<li>Ersetzen Sie die 100 %-Ethanol-Lösung mit einer 1:1 Lösung von TBA und 100 % Ethanol für 20 min. ersetzen die 1:1-Lösung mit 100 % TBA für 20 min. zweimal wiederholen. Halten Sie die Lösung bei 37 ° C, so dass TBA nicht einfriert. Hinweis: 100 % TBA hat einen Gefrierpunkt von 25,5 ° C; die 1:1-Lösung wird bei Raumtemperatur nicht einfrieren. TBA ist brennbar, verursacht schwere Augenreizung ist gesundheitsschädlich beim Einatmen und Reizung der Atemwege, Schläfrigkeit und Benommenheit verursachen. TBA sollten in einem chemischen Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhe, Kittel und Augenschutz behandelt werden.</li>
		<li>Übertragen Sie Probe in TBA, wenn in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch in eine Einweg-Aluminium mit einem Gewicht von Gericht. Einmal in der mit einem Gewicht von Aluminium-Schale, TBA entfernen und ersetzen mit gerade genug frische 100 % TBA um die Probe zu decken. Einfrieren der TBA bei 4 ° C für 10 Minuten.</li>
		<li>Übertragen Sie auf ein Vakuum Exsikkator (Bell Jar) mit gefrorenen Gel-Packs, TBA gefroren zu halten. Evakuieren und Vakuum mit einer Kreiselpumpe erlauben die Probe trocken durch Vakuum Sublimierung des gefrorenen TBA für mindestens 3 Stunden oder über Nacht zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die chemische Trocknung mit Hexamethyldisilazane (HMDS)20.<ol>
<li>Ersetzen Sie die 100 %-Ethanol-Lösung mit einer 1:2-Lösung von HMDS und 100 % Ethanol für 20 min. ersetzt die 1:2-Lösung mit einer 2:1 Lösung von HMDS und 100 % Ethanol für 20 min. ersetzen das 2:1-Lösung mit 100 % HMDS für 20 min. einmal wiederholen. Hinweis: HMD ist entzündlich und eine akute Toxin (dermal Route). HMDS sollten in einem chemischen Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhe, Kittel und Augenschutz behandelt werden.</li>
		<li>Übertragen Sie Probe in HMDS, wenn in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch in eine Einweg-Aluminium mit einem Gewicht von Gericht. Sobald das Aluminium mit einem Gewicht von Gericht, ersetzen Sie in 100 % HMDS mit gerade genug frische 100 % HMDS um die Probe zu decken.</li>
		<li>Übertragen Sie die Probe auf ein Kunststoff oder Glas-Vakuum-Exsikkator mit frischen Trockenmittel (ca. 5-6 cm tief) und setzen Sie in einem chemischen Abzug. Alternativ legen Sie die Probe direkt in einem chemischen Abzug mit einem losen Deckel, z. B. ein Feld, um zu verhindern, dass Schmutz fallen auf die Probe zu trocknen. Lassen Sie die Probe für 12 bis 24 h trocknen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Montage
<ol><li>Montieren Sie Cyanobakterien und Euglenoids.<ol>
<li>Beschriften Sie unten entweder eine 12 - 25 mm Aluminium Montage Stub um anzugeben, was an der Spitze platziert wird. Vierteln des Polycarbonat-Filters mit den getrockneten Zellen mit einer sauberen Rasierklinge oder einem Skalpell benutzen einen 12 mm-Stub, oder ganzen Filter einsetzen, wenn einen Stub 25 mm zu verwenden.</li>
		<li>Legen Sie jeden Filter auf Kleber oder ein Carbon Klebstoff Tab sicherte sich an die Spitze der a Stummel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montieren Sie Drosophila Melanogaster (Fruchtfliege).<ol>
<li>Beschriften Sie unten Aluminium Montage Stub um anzugeben, was an der Spitze platziert wird. Legen Sie die getrockneten fliegen in die gewünschte Position auf Klebstoff oder Carbon Klebstoff Tab an die Spitze der einen Stub unter dem sezierenden Mikroskop mit Präzision Pinzette gesichert.</li>
		<li>Gelten Sie Silber Leitkleber, d.h., Silber Farbe, an den äußeren Rändern der die Stubs. Schließen Sie die silberne Farbe an die fliegen mit einem Zahnstocher um die Leitfähigkeit zu gewährleisten. Lassen Sie sich nicht die Farbe der gewünschten imaging-Bereich zu berühren.</li>
		<li>Die Stubs in eine Stub-Halter-Box und der offenen Stub Halter Box in den Exsikkator gestellt. Die silberne Farbe trocknen mindestens 3 Stunden oder über Nacht für beste Ergebnisse zu ermöglichen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. sputter-Beschichtung
<ol><li>Vorbereiten der Sputter-Beschichtung-Apparat durch Ausführen von vier bis fünf Leerungen von Argongas. Wenn die Luftfeuchtigkeit hoch ist (d. h. die Raumluft fühlt sich feucht, in der Regel etwa 50 % Relative Luftfeuchtigkeit), sechs bis sieben Spülungen durchführen. Sputter-Mantel die Stubs, die Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Mantel-Proben anhand der Probe verwendet:<ol>
<li>Stellen Sie für Filter mit Cyanobakterien den Timer zu Mantel für 180 s gerade an zu stottern.</li>
		<li>Stellen Sie für Filter mit eukaryotischen Algen, d. h. Euglenoids den Timer, sputter-Mantel für 120 s geradeaus, dann 20 s auf drei Seiten in einem Winkel von 45°.</li>
		<li>Stellen Sie für große Proben, d.h. fliegen Köpfe den Timer, sputter-Mantel für 60 s geradeaus, dann 30 s auf jeder Seite in einem Winkel von 45°. Hinweis: Nach der Beschichtung abgeschlossen ist, sollte Stubs hellgrau in Farbe sein.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Bildgebung
<ol><li>Bildbeispiele, die mit einem Rasterelektronenmikroskop enthält, einen Sekundär-Elektronen (SE)-Detektor.<ol>
<li>Für Cyanobakterien, gelten die folgenden Einstellungen: 3-5 kV Beschleuniger Spannung (AC), 20-30 Sonde Strom (PC) und 5 mm Arbeitsabstand (WD). Verwenden Sie für Euglenoids, 3 kV AC 30 PC und 5 mm WD. Verwenden Sie für fliegen, 5 kV AC 30 PC und 5 bis 10 mm WD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passen Sie die Vergrößerung abhängig von der Größe des einzelnen oder des Objekts visualisiert werden. Passen Sie die Stigmators, Öffnungen und Fokus, bis ein klares Bild entsteht. Das Bild mit hoher Auflösung Einstellungen entsprechend den Anweisungen des Herstellers des SEM</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier haben wir ein Protokoll mit SEM detaillierte Informationen über externe morphologischen Charakteristika der drei Arten von Organismen, die anderen anwenden können, um Eigenschaften von vielen Arten von Organismen oder Gewebe zu untersuchen. In jedem Schritt des Protokolls gibt es mögliche Punkte der Fehler, der auftreten und werden nachfolgend ausführlich erläutert.
Während die Volumina für Fixiermittel und Waschungen, die hier gegeben sind, sollte im allgemeinen Fixiermittel und Waschung...

Ein Rasterelektronenmikroskop (REM) nutzt einen fokussierten Strahl von hochenergetischen Elektronen erzeugen ein Bild von Sekundärelektronen, die Morphologie und die Topographie von Beispiel1zeigt. SEM kann verwendet werden, um direkt die physische Größe einer Probe, die Oberflächenstruktur und die dreidimensionale Form, und bietet höhere Auflösung und größere Schärfentiefe im Vergleich zu Lichtmikroskopie bestimmen. Eine andere Form der Elektronenmikroskopie (EM), nutzt Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) fokussierte Elektronen, die durch die Probe, erzeugen Bilder mit feinen Details der internen Struktur übergeben. TEM hat höhere Auflösung als Licht oder SEM und kann verwendet werden, um Strukturen so klein wie einzelne Atome zu lösen, hat es drei große Nachteile: umfangreiche Probenvorbereitung, ein kleines Sichtfeld und einer geringen Tiefe von Feld2,3. Obwohl andere visualisiert Protokolle gibt es mit SEM zu bestimmten Zellen, Organellen oder Gewebe4,5,6,7,8,9, 10 , dieses Protokoll ist einzigartig, da wir Methoden beschreiben, die im großen und ganzen auf eine Vielzahl von Organismen zur morphologischen Beurteilung angewendet werden können.
SEM findet breite Anwendungen für die Prüfung von anorganischer Materialien einschließlich Nanopartikel11,12, Polymere13und zahlreiche Anwendungen in geologischen, industriellen und materiellen Wissenschaften14, 15,16. In der Biologie wurde SEM lange als eine Methode zur Untersuchung von biologischer Proben von einzelnen Proteine bis hin zu ganzen Organismen17,18eingesetzt. SEM ist von besonderem Wert, weil morphologische Oberflächendetails verwendet werden, um wissenschaftliche Entdeckung informieren. SEM-Analyse ist eine schnelle, preiswerte und einfache Methode, um detaillierte Informationen über die Struktur, Größe und Oberflächenbeschaffenheit eine Vielzahl von biologischen Proben.
Da ein SEM normalerweise im Hochvakuum (10-6 minimale Torr arbeitet), einen kohärenten Strahl von High-Speed-Elektronen zu unterstützen, dürfen keine Flüssigkeiten (Wasser, Öle, Alkohole) in die Probenkammer, wie Flüssigkeiten ein Vakuum zu verhindern. Somit müssen alle Proben mit SEM untersucht dehydriert werden in der Regel mit einer abgestuften Ethanol-Reihe gefolgt von einem Trocknungsprozess, um das Ethanol zu entfernen. Es gibt mehrere Methoden der Trocknung biologischer Gewebes für den Einsatz in der SEM, einschließlich Lufttrocknung, Gefriertrocknung, Verwendung eines kritischen Punkt Trocknungseinrichtung (CPD) oder chemische Trocknung mit t-Butyl-Alkohol (TBA) oder Hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. in den meisten Fällen Auswahl an einem Trocknungsverfahren ist empirisch, da jede biologische Probe auf jedes Trocknungsverfahren unterschiedlich reagieren kann. Für jede Probe kann all diesen Methoden geeignet also vergleicht die vor- und Nachteile der einzelnen nützlich ist bei der Auswahl der geeigneten Methode.
Während Lufttrocknung eine Probe bei Raumtemperatur oder in einem Trockenschrank (60 ° C) die einfachste Methode ist, die meisten biologische Proben trocknen-induzierten Schäden wie Ausdörrende zeigen und zusammenbrechen, was zu Verzerrungen der Probe. Der Prozess der Lyophilisation entfernt Wasser (oder Eis) aus dem Beispiel, aber erfordert Proben Blitz eingefroren werden und platziert unter Vakuum zu entfernen, das Eis über den Prozess der Sublimation, potenziell schädliche Probe. Darüber hinaus muss der Benutzer über ein Gefriertrockner verfügen. Die am häufigsten verwendete Methode für das Austrocknen von Proben für SEM ist kritischer Punkt trocknen (CPD). In CPD wird das Ethanol in einer Probe mit flüssigem Kohlendioxid (CO2) und unter bestimmten Temperatur- und Druckbedingungen bekannt, da der kritische Punkt (31,1 ° C und 1.073 Psi), CO2 verdampft ohne Oberflächenspannung, wodurch ersetzt effektiv Erhaltung der morphologischen und strukturellen Eigenschaften der Probe. Während der CPD im Allgemeinen die Standardmethode ist, hat es einige Nachteile. Der Prozess erfordert zunächst, Zugang zu einem kritischen Punkt Trockner, die ist nicht nur teuer, sondern erfordert auch die Verwendung von flüssigem Kohlendioxid. Zweitens ist die Größe der Stichprobe, die getrocknet werden kann auf die Kammergröße des kritischen Punktes Trockner beschränkt. Drittens kann der Austausch von Flüssigkeiten während der CPD Turbulenzen verursachen, die die Probe beschädigen können.
Chemische Trocknung bietet viele Vorteile gegenüber CPD und dient als eine geeignete Alternative, die in SEM Probenvorbereitung verbreitet werden. Die Verwendung von chemischen Dehydrants wie TBA und HMD bietet eine schnelle, preiswerte und einfache Alternative zu anderen Methoden, unter Beibehaltung der strukturellen Integritätdes der Probe. Wir haben vor kurzem gezeigt, es keinen Unterschied in die Integrität des Gewebes oder die Qualität des fertigen Bildes erfasst gab bei der Verwendung von CPD oder TBA als Trocknungsverfahren in Erwachsenen Drosophila Netzhautgewebe23. Im Gegensatz zu CPD TBA und HMD erfordern keine Trocknung Instrument oder flüssiges CO2 und es gibt keine Beschränkung der Größe der Stichprobe, die getrocknet werden. Neben die Chemikalien, sind nur ein standard chemische Dampfhaube und geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe und Kittel) erforderlich, um den Trocknungsprozess zu vervollständigen. TBA und HMD brennbar sind, TBA ist weniger giftig und weniger teuer (ca. 1/3 der Kosten des HMDS) als HMD.
In diesem Artikel beschreiben wir, wie zu reparieren, waschen, entwässern, trocknen, montieren, sputter-Mantel und Bild drei Arten von Organismen: Cyanobakterien (Toxifilum Mysidocida, Golenkina SP., und eine unbekannte SP.), zwei Euglenoids aus der Gattung Monomorphina (M. Aenigmatica und M. Pseudopyrum), und der Taufliege (Drosophila Melanogaster). Diese Organismen repräsentieren ein breites Spektrum an Größe (0,5 µm bis 4 mm) und zelluläre Vielfalt (einzellige, mehrzelligen), doch alles sind SEM-Analyse leicht zugänglicher mit nur kleinen Variationen für Probenvorbereitung erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden für die Verwendung von chemischen Dehydrierung und SEM Analyse um morphologische Details der drei Arten von Organismen zu untersuchen und zu prüfen viele organismal breit anwendbar wäre und Gewebetypen.

<table><tbody><tr><td>gold&ndash; Palladium</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>91212</td><td></td></tr><tr><td>Silber leitfähiger Klebstoff 503</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>12686-15</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nukleporenbahn-geätzte Membranen; Ø 25 mm, Porengröße 8 &mu; m, Polycarbonat</td><td>Sigma</td><td>WHA110614</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; Ø 25 mm, Porengröße 0,8 &mu; m, Polycarbonat, schwarz</td><td>Sigma</td><td>WHA110659</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; Ø 25 mm, Porengröße 0,2 &mu; m, Polycarbonat</td><td>Sigma</td><td>WHA110606</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium-Wiegeschale</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-100</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium-Montage-Stutzen (12 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>75210</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium-Montage-Stutzen (25 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>75186</td><td></td></tr><tr><td>Klebe-Stutzen&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>76760</td><td></td></tr><tr><td>leitfähige Kohlenstoff-Klebelaschen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77825</td><td></td></tr><tr><td>F/2 Medien</td><td>Kultursammlung von Algen an der University of Texas in Austin</td><td>https://utex.org/products/f_2-medium</td><td>Keine Katalognummer angegeben - siehe Link&nbsp;</td></tr><tr><td>AF6 media</td><td>Bigelow - Nationales Zentrum für Marin, Algen und Mikrobiota</td><td>https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf</td><td>Keine Katalognummer angegeben - siehe Link&nbsp;</td></tr><tr><td>Boden Wasser Medium</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>153785</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol tert-octylphenylether (Triton X-100)</td><td>VWR</td><td>97062-208</td><td></td></tr><tr><td>Hummer 6.2 Sputter Coater</td><td>Anatech USA</td><td>http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4</td><td>Keine Katalognummer angegeben - siehe Link&nbsp;</td></tr><tr><td>Hitachi 3400N-II SEM&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2& gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE</td><td>Das Unternehmen scheint dieses Modell nicht mehr zu verkaufen&nbsp;</td></tr></tbody></table>

vorbereitung der prokaryotischen und eukaryotischen organismen mit chemischen trocknung für die morphologische analyse in rasterelektronenmikroskopie (sem)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Rasterelektronenmikroskopie (SEM) ist eine verbreitete Technik, die angewendet wurden, um biologische Proben von einzelne Proteine, Zellen, Gewebe, Organellen und sogar ganze Organismen bis hin zu untersuchen. Dieses Protokoll konzentriert sich auf zwei chemischen Trocknungsmethoden, Hexamethyldisilazane (HMDS) und t-Butyl-Alkohol (TBA) und deren Anwendung auf Bildgebung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit SEM In diesem Artikel beschreiben wir, wie zu reparieren, waschen, entwässern, trocknen, montieren, sputter-Mantel und Bild drei Arten von Organismen: Cyanobakterien (Toxifilum Mysidocida, Golenkina SP., und eine unbekannte SP.), zwei Euglenoids aus der Gattung Monomorphina (M. Aenigmatica und M. Pseudopyrum), und der Taufliege (Drosophila Melanogaster). Dieses Protokoll soll beschreiben, eine schnelle, preiswerte und einfache Methode, um erhalten detaillierte Informationen über die Struktur, Größe und Oberflächenbeschaffenheit der Exemplare, die im großen und ganzen auf eine große Auswahl an Organismen für angewendet werden können morphologische Bewertung. Erfolgreichen Abschluss dieses Protokolls können andere SEM verwenden Proben durch Anwendung dieser Techniken, um ihr System zu visualisieren.

Cyanobakterien sind eine prokaryotische Gruppe von Organismen, die für die globale Kohlenstoff, Sauerstoff und Stickstoff Zyklen28,29von entscheidender Bedeutung sind. Von den geschätzten 6000 Arten von Cyanobakterien30die meisten haben eine schleimigen Hülle, die Decken und die Zellen miteinander verbinden und zu anderen Strukturen gelöst31, die zusammen mit der Form kann mikroskopi...

SEM-Analyse ist eine effektive Methode um Speziesidentifizierung oder phänotypischen Diskriminierung zu unterstützen. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Untersuchung der morphologischer Besonderheiten der drei repräsentative Arten von Organismen und zur Untersuchung der Eigenschaften von vielen organismal breit anwendbar wäre und Gewebetypen.

Vorbereitung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit chemischen Trocknung für die morphologische Analyse in Rasterelektronenmikroskopie (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Dieses Protokoll konzentriert sich auf zwei chemische Trocknungsmethoden, Hexamethyldisilazan und T-Butylalkohol und deren Anwendung, die sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Organismen mit SEM abbilden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nicht den Einsatz spezieller Trocknungsanlagen wie eines kritischen Punkttrockners zur Vorbereitung von Proben für die Analyse erfordert. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Verwendung chemischer Dehydrierung und SEM-Analyse von drei Arten von Organismen, wäre aber im Großen und Ganzen auf die Untersuchung vieler Organismen- und Gewebetypen anwendbar.Demonstriert wird das Verfahren von Madison Koon, einer Studentin aus meinem Labor. Zu Beginn, bereiten Cyanobakterien durch nächtliche Fixierung. Übertragen Sie sie dann in ein 10 ml Filtersystem, das einen 25 ml-Filter aus Polycarbonat enthält.Versiegeln Sie den Seitenarm und Trichter des Filtergeräts mit Gummistopfen, um die Kultur im Trichter einzudämmen. Nach dem Entfernen beider Stopfen entfernen Sie das Fixativ durch sanftes Staubsaugen am Filterkolben. Um einzellige Algen-Euglenoide herzustellen, fixieren Sie sie, indem Sie 3 Tropfen 4%Osmium-Tetroxid direkt in die Kultur einfügen, die zuvor in ein 10 ml-Filtrationsgerät übertragen wurde.Nach einer 30-minütigen Inkubation entfernen Sie beide Stopfen und entfernen Sie das Fixativ durch sanftes Staubsaugen am Filterkolben. Waschen Sie die festen Euglenoide dreimal mit 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 bei Raumtemperatur für jeweils zehn Minuten, während sie den Kolben und trichter mit den Stopfen geschlossen halten, um die Wäsche zu halten. Nach dem Entfernen beider Stopfen entfernen Sie jede Wäsche durch sanftes Vakuum am Filterkolben.Um die Probe zu dehydrieren und dabei das kontinuierliche Eintauchen aufrechtzuerhalten, verwenden Sie eine abgestufte Ethanolserie für zehn Minuten in einem Volumen von 5 ml im Trichter, während Sie den Kolben und trichter mit den Stopfen geschlossen halten, um das Ethanol im Trichter zu enthalten. Nach dem Entfernen beider Stopfen staubt man sanft auf den Filtrationskolben, um Ethanol zu entfernen. Übertragen Sie die Probe auf eine Einweg-Aluminium-Wägeschale, die gerade genug 100% Ethanol enthält, um die Probe zu bedecken.Um die chemische Trocknung der Euglenoide mit TBA durchzuführen, ersetzen Sie zunächst die 100%ethanol Lösung in der Aluminiumschale durch eine 1-zu 1-Lösung von TBA und 100%ethanol für zwanzig Minuten. Ersetzen Sie dann die 1-zu-1-Lösung für zwanzig Minuten durch 100%TBA, und wiederholen Sie den Vorgang zweimal. Entfernen Sie TBA und ersetzen Sie es mit gerade genug frischem 100%TBA, um die Probe abzudecken.Legen Sie das Gericht bei vier Grad Celsius für zehn Minuten, um die TBA einfrieren. Übertragen Sie die Probe in einen Vakuum-Austrocknungsor mit gefrorenen Gelpackungen, um TBA gefroren zu halten. Verwenden Sie eine Drehpumpe, um Vakuum zu evakuieren und zu erhalten, damit die Probe durch Vakuumsublimation des gefrorenen TBA für mindestens drei Stunden trocknen kann.Um Cyanobakterien in Euglenoiden zu montieren, beschriften Sie den Boden eines 25 mm Aluminium-Montagestummels, um anzuzeigen, was oben platziert wird. Legen Sie dann jeden Filter auf eine Carbon-Klebstoff-Lasche, die an der Oberseite des Stummels befestigt ist. Um Drosophila melanogaster vorzubereiten, tauchen Anästhesisierte Fliegen in 1 ml Fixativ für zwei Stunden bei vier Grad Celsius, um sicherzustellen, dass sie vollständig untergetaucht sind.Verwenden Sie eine Glaspipette, um das Fixativ zu entfernen. Waschen Sie die feste Drosophila-Probe dreimal in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2 bei Raumtemperatur für zehn Minuten. Verwenden Sie eine Glaspipette, um jede Wäsche zu entfernen, wobei Sie darauf achten, die Probe nicht zu entfernen.Anschließend dehydrieren Sie die Probe in einem Mikrofugenrohr in einem Volumen von 1 ml mit einer abgestuften Ethanolserie für jeweils zehn Minuten. Verwenden Sie eine Glaspipette, um jede Wäsche zu entfernen, wobei Sie darauf achten, die Probe nicht zu entfernen. Bewahren Sie die Probe in der 1,5 ml Mikrozentrifugenröhre mit gerade genug 100% Ethanol auf, um sie zu bedecken.Um die chemische Trocknung der Fliegen mit HMDS durchzuführen, ersetzen Sie zunächst die 100%-Ethanol-Lösung für zwanzig Minuten durch eine 1-bis 2-Lösung von HMDS und 100%Ethanol. Dann ersetzen Sie die Lösung durch eine 2-1-Lösung von HMDS und 100%Ethanol für zwanzig Minuten. Schließlich ersetzen Sie diese Lösung durch 100%HMDS für zwanzig Minuten und wiederholen Sie dann den Vorgang einmal.Übertragen Sie die Probe, die sich in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und HMDS befindet, in eine Einweg-Aluminium-Wägeschale. Ersetzen Sie das 100%HMDS durch gerade genug frische 100%HMDS, um die Probe abzudecken. Legen Sie die Probe in der Aluminiumschale direkt in eine chemische Rauchhaube, um sie mit einem losen Deckel wie einer Box zu trocknen, um zu verhindern, dass Schmutz auf die Probe fällt und sie 12 bis 24 Stunden trocknen kann.Um Drosophila zu montieren, beschriften Sie den Boden eines Aluminium-Montagestummels. Verwenden Sie eine Präzisionspinzette, um die getrockneten Fliegen an der gewünschten Position auf einer Anklebenkundungslasche zu platzieren, die an der Oberseite eines Stubs unter einem Sezierendes Mikroskop befestigt ist. Tragen Sie silbernen leitfähigen Klebstoff um die äußeren Ränder der Stubs auf.Verwenden Sie einen Zahnstocher, um die silberne Farbe mit den Fliegen zu verbinden, um die Leitfähigkeit zu gewährleisten und sicherzustellen, dass die Farbe nicht den gewünschten Bildbereich berührt. Legen Sie die Stuben in einen Stubhalterkasten, und legen Sie dann den offenen Stubhalterinin in einen Trockenbauund und lassen Sie die silberne Farbe mindestens drei Stunden trocknen. Um die Sputterbeschichtung stolvorzubereiten, führen Sie 4 bis 5 Spülungen argonengas.Je nach zu beschichtenden Proben stellen Sie den Timer auf verschiedene Einstellungen ein, wie im Manuskript beschrieben. Sputter beschichten Sie die Stubs nach den Anweisungen des Herstellers. Schließlich Bildproben mit einem Rasterelektronenmikroskop, das einen sekundären Elektronendetektor mit Einstellungen enthält, die von der verwendeten Probe abhängen.Die erfolgreiche Herstellung von Cyanobakterien für SEM mit diesem Protokoll ergab Bilder, bei denen Details der Zelle, einschließlich Form und Textur der Oberfläche, sowie eine Hülle aus Schleimhaut und Projektionen aus den Zellen sichtbar sind. Das SEM-Bild einer fadenförmigen Süßwasserart aus Colorado zeigt eine sichtbare Schleimscheide. Das SEM-Bild eines Süßwasserbakteriens aus Ohio zeigt einzelne Zellen, die manchmal Kolonien bilden, die durch eine dünne Schicht Von Schleim zusammengehalten werden.Filamentartige Vorsprünge erstrecken sich von den einzelnen Zellen. Bilder unbekannter fadenförmiger Arten aus einer Hochsalzmündung in texanischen Küstengewässern zeigen einzelne und sich teilende Zellen. SEM wurde verwendet, um die Pellikelstreifen von zwei verschiedenen Euglenoid-Arten zu visualisieren.Beim Vergleich von Monomorphina und Aenigmatica mit Monomorphina Pseudopyrum, der sichtbaren spiralförmigen Anordnung der Pelicle-Streifen, die am hinteren Ende entstehen, um einen Schwanz zu bilden, hilft die Phylogenie zur Beendigung. SEM-Bilder von normalen Drosophila-Augen zeigen eine geordnete Reihe von Borsten und Linsen, aber die Expression von Proteinen, die mit der Alzheimer-Krankheit assoziiert sind, erzeugen den groben Augenphänotyp. Gene, die den Grobaugen-Phänotyp unterdrücken oder verbessern, können eine physiologische Rolle bei der Fortschreiten der Krankheit spielen.Hier sind Beispiele für mögliche Grubenstürze zu vermeiden, einschließlich eines Beispiels für die zusammengebrochene Struktur des Auges durch unsachgemäße Trocknungstechnik und Elektronenladung durch unzureichende Sputtercodierung, die während der Bildaufnahme erscheint. Die hier beschriebenen Protokolle nutzten Organismen, die sehr stark mit respektierter Komplizenschaft, aber alle sind für SEM-Analysen zugänglich, um nützliche, morphologische Informationen zu sammeln, die für wissenschaftliche Entdeckungen in vielen Teildisziplinen der Biologie entscheidend sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit T-Butylalkohol, Hexamethyldisilazan und Osmiumtetroxid gefährlich sein kann und die geeigneten Sicherheitsmaßnahmen sollten immer eingehalten werden, um Benutzer zu schützen, insbesondere Studenten, die mit diesen Chemikalien umgehen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Quelle: Bucher, T., et al., Methodologien zur Untersuchung von B. subtilis-Biofilmen als Modell zur Charakterisierung kleiner Molekül-Biofilminhibitoren. J. Vis. Exp.(2016)Dieses Video demonstriert die Vorbereitung ausgewachsener bakterieller Biofilmkolonien für hochauflösende Bildgebung. Es behandelt Fixierung, Dehydration, Montage und Metallbeschichtungsschritte, um die Biofilmmorphologie zu erhalten und zu visualisieren.

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Vorbereitung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit chemischen Trocknung für die morphologische Analyse in Rasterelektronenmikroskopie (SEM) (Video) | JoVE Journal

Vorbereitung der prokaryotischen und eukaryotischen Organismen mit chemischen Trocknung für die morphologische Analyse in Rasterelektronenmikroskopie (SEM)

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