Name: Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas Infektion in einem Caenorhabditis Elegans -Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Virulenz und Pathogenese von Aeromonas-Infektionen im Caenorhabditis elegans-Modell bewerten. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Toxizitätsunterschieden zwischen verschiedenen Bakterienstämmen.

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Wir sind dankbar für die Unterstützung von C. Elegans zentrale Einrichtung in Taiwan und der diagnostischen Mikrobiologie und antimikrobielle Resistenz Labor der National Cheng Kung University Hospital für die Bereitstellung der Aeromonas isoliert. Wir anerkennen auch die Caenorhabditis Genetik Center (CGC) und die WormBase. Wir danken auch Savana Moore für das Manuskript zu bearbeiten.
Diese Studie wurde teilweise unterstützt durch Zuschüsse aus dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie von Taiwan (meist 105-2628-B-006-017-MY3) und der National Cheng Kung University Hospital (NCKUH-10705001), p.l. Chen.

1. Vorbereitung des Kulturmediums
Hinweis: Siehe Tabelle 1 für die Vorbereitung der Lösung.
<ol><li>Um M9 Medium12vorzubereiten, lösen Sie 1,5 g KH2PO4, 5,66 g Na2HPO4und 2,5 g NaCl in 500 mL entionisiertem Wasser auf. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. warten, bis auf Raumtemperatur abgekühlt und dann hinzufügen 0,5 mL 1 M MgSO4 vor dem ersten Gebrauch.</li>
	<li>Lösen sich um Nematoden Wachstum Medium (NGM)12vorzubereiten, 3 g NaCl, bakterielle Pepton 2,5 g und 20 g Agar in 1 L deionisiertes Wasser. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. warten, bis zu 55 ° C im Wasserbad abgekühlt und dann fügen Sie 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 5 % Cholesterin in Ethanol und 25 mL Phosphatpuffer. Wirbel um gut zu mischen.</li>
	<li>Gießen Sie etwa 5 mL NGM in je 6 cm Petrischale. Blase-Produktion auf der Oberfläche der Platte zu vermeiden. Lassen Sie Platten bei Raumtemperatur für 1 Nacht und Paket, sparen bei 4 ° C. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen.</li>
	<li>Um angereichertes NGM (ENGM) vorzubereiten, lösen Sie bakterielle Pepton 5 g, 3 g NaCl, 1 g Hefeextrakt und 30 g Agar in 1 L deionisiertes Wasser. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. warten, bis zu 55 ° C im Wasserbad abgekühlt, und fügen Sie 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 5 % Cholesterin in Ethanol und 25 mL Phosphatpuffer. Wirbel um gut zu mischen.</li>
	<li>Gießen Sie etwa 10 mL ENGM in je 9 cm Petrischale. Blase-Produktion auf der Oberfläche der Platte zu vermeiden. Lassen Sie Platten bei Raumtemperatur für 1 Nacht und Paket, sparen bei 4 ° C. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen.</li>
	<li>S mittlerer12vorbereiten, mischen Sie 40 mL S Basal, 0,4 mL 1 M Kalium Citrat, Metalle 0,4 mL Trace Lösung, 0,12 mL 1 M CaCl2, 0,12 mL 1 M MgSO4, 40 µL 5 % Cholesterin in Ethanol und 1 mL 8 mM FudR vor Gebrauch.</li>
</ol>(2) Synchronisierung von C. Elegans6,9,12
<ol><li>Waschen Sie etwa 2.000 Würmer in der trächtigen Erwachsenen-Bühne mit 10 mL sterile deionisiertes Wasser in einer 15 mL Tube. Waschen Sie die Bakterien 3 x, die Würmer an der Unterseite des Rohres zu halten.</li>
	<li>Zentrifugieren der Probe 1 min. bei 500 X g nach unten die Würmer ziehen. Entfernen Sie den Überstand zu, und halten Sie die Würmer in 3,5 mL entionisiertem Wasser.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL NaOCl (10 – 15 %) und 0,5 mL 5 M KOH in die Röhre. Mischung gleichmäßig durch Schütteln für < 6 min um die Wurm-Körper zu lösen.</li>
	<li>Nachdem die Eier von den Würmern freigesetzt werden, fügen Sie 10 mL entionisiertem Wasser um die Zerstörung zu stoppen. Zentrifuge für 1 min bei 1.200 X g herunterziehen der Eier und den überstand so weit wie möglich zu entfernen. Waschen Sie mit mittlerer mindestens 3 X 15 mL M9. Hinweis: Siehe Schritt 1.1 für die Zusammensetzung der M9 Medium.</li>
	<li>Halten Sie die Eier in 1 mL M9 Medium. Eier in eine 3,5 cm Schale für die Inkubation bei 20 ° C für eine Nacht (ca. 12 – 18 h) zu transportieren. Hinweis: Nach der Inkubation schlüpfen die Eier um Larven Wurm, die als erste Stufe der Larve (L1) genannt wird.</li>
	<li>Pipette, 10 µL L1 Würmer in M9 Medium. Die Wurm-Anzahl und berechnen Sie die Konzentration der L1 in M9 Medium Würmer.</li>
	<li>Samen höchstens 10.000 inkubiert L1 Stadium Würmer mit einem Pipettieren auf einem 9 cm ENGM Teller mit Escherichia coli OP50 zu verbreiten.<ol>
<li>In diesem Schritt kultiviert Ausbreitung 0,5 mL über Nacht E. Coli OP50 mit Luria-Bertani (LB) Brühe auf dem Teller 9 cm ENGM. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 16 – 18 h Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, sollte die Verbreitung Schritt in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.</li>
		<li>Vor der Aussaat L1 Würmer auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Samen höchstens 10.000 inkubiert L1 Stadium Würmer auf dem ENGM Teller mit E. Coli OP50.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Würmer bei 20 ° C für 44 h oder bis sie auf die 4th (L4) Larvenstadium wachsen. Hinweis: Siehe Punkt 1.3 für die Zusammensetzung des Mediums ENGM. Ein Wurm ist einen weißen Punkt in Halbmond-Form in der Mitte der Körperseite in der L4-Stadium.</li>
	<li>Verwenden Sie die synchronisierten L4 Stadium in den folgenden Tests Würmer. Verwendung Wildtyp N2 Würmer in C. Elegans überleben Assay mit Aeromonas Dhakensis und C. Elegans flüssige Toxizität Assay mit Aeromonas Dhakensis. Verwenden Sie RW1596 Würmer (myo-3(st386); stEx30 [Myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) in C. Elegans Muskel Nekrose Assays mit Aeromonas Dhakensis.</li>
</ol>3. C. Elegans überleben Assay mit Aeromonas6,9
<ol><li>Am Tag der Aussaat L1 Würmer auf die Ausbringung mit E. Coli OP50 ENGM wählen Sie eine einzelne Kolonie von jeder der vier Stämme von Aeromonas oder E. Coli OP50 und Kultur mit 2 mL LB Brühe bzw. bei 37 ° C 16 h. Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, sollte dieser Schritt in einem Laminar-Flow-Abzug durchgeführt werden. Hier die folgenden Bakterienstämme wurden verwendet: E. Coli OP50, die normalen Nahrungsquelle von C. Elegans. A. Dhakensis AAK1, der ersten vollständig sequenziert pathogenen klinische A. Dhakensis isolieren. A. Hydrophila A2-066, A. Veronii A2-007 und A. Caviae A2-9307121 sind repräsentativ klinischen Isolaten von National Cheng Kung University Hospital.</li>
	<li>Messen die OD600 Extinktion der bakteriellen Brühe und passen Sie die bakterielle Brühe auf OD600 = 2,0 mit LB Brühe.</li>
	<li>Vor Ort und 30 µL bakterielle Brühe jeder 6 cm NGM Platte zu verbreiten. Die Platten bei Raumtemperatur über Nacht Kultur. Hinweis: Siehe Schritt 1.2 für die Zusammensetzung der NGM Medium.</li>
	<li>Am Tag wachsen die L1-Würmer auf die L4-Bühne, nach dem Zufallsprinzip wählen und auf eine NGM-Platte mit jedem der vier Stämme von Aeromonas oder E. Coli OP50 50 Würmer übertragen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die NGM-Platten bei 20 ° C, bis der Test abgeschlossen ist.</li>
	<li>Übertragen Sie die lebenden Würmer auf einen neu vorzubereitenden NGM Teller mit Sensor Würmer, Bakterien und Count die Anzahl der Leben, tot, jeden Tag, bis der letzte Wurm tot ist. Hinweis: Übertragen Würmer auf einen frisch zubereiteten NGM Teller jeden Tag für die Aufrechterhaltung der Infektion, auch wenn sterile Würmer verwenden (z.B.Glp-4, oder mit FudR).</li>
	<li>Basierend auf den täglichen Datenberechnung Überleben-Kurven Plotten.</li>
</ol>4. C. Elegans flüssige Toxizität Assay mit Aeromonas7
Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, sollten Schritte in einem Laminar-Flow-Abzug durchgeführt werden.
<ol><li>Am Tag nach der Aussaat die L1-Würmer auf dem ENGM Teller verteilen mit E. Coli OP50, wählen Sie eine einzelne Kolonie von jeder der vier Stämme von Aeromonas und E. Coli OP50 und Kultur mit 5 mL LB Brühe bei 37 ° C 16 h. Hinweis: In das Protokoll die folgenden Bakterienstämme wurden verwendet: E. Coli OP50, die normalen Nahrungsquelle von C. Elegans. A. Dhakensis AAK1, der ersten vollständig sequenziert pathogenen klinische A. Dhakensis isolieren. A. Hydrophila A2-066, A. Veronii A2-007 und A. Caviae A2-9307121 sind repräsentativ klinischen Isolaten von National Cheng Kung University Hospital.</li>
	<li>Messen Sie die OD600 Extinktion der Bakterien-Brühe.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die bakterielle Brühe bei 3.500 X g für 15 min, die LB-Brühe zu entfernen. Die Bakterien aufzuwirbeln und passen Sie die bakterielle Brühe auf OD600 = 3,0 S Medium. Mindestens 8 Brunnen einer 96-Well-Platte 195 µL bakterielle Brühe in S Medium hinzufügen. Hinweis: Siehe Schritt 1.6 für die Zusammensetzung des S Medium.</li>
	<li>Die L4-Würmer auf dem ENGM Teller mit E. Coli OP5 mit M9 Medium abwaschen. Passen Sie die Wurm-Lösung zu einer Konzentration von 5 Würmer pro Mikroliter und geben Sie 5 µL der Wurm Lösung in jede der 96-Well-Platte. Sicherstellen Sie, dass es etwa 25 Würmer pro Bohrloch gibt.</li>
	<li>Inkubieren Sie die 96-Well-Platte auf einen Shaker bei 200 u/min bei 25 ° c</li>
	<li>Die Anzahl der Leben Würmer und toten Würmer nach 24, 48 und 72 h die Überlebensraten von jedem Bohrloch mit folgender Formel berechnen: (Live Würmer/Total Würmer) × 100 %.</li>
	<li>Zeichnen Sie ein Scatter Plot Diagramm mit der täglichen Datenberechnung.</li>
</ol>5. C. Elegans Muskel Nekrose Assay mit Aeromonas6
Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, sollten diese Schritte in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
<ol><li>Am Tag sind die L1-Würmer auf den ENGM verbreiten mit E. Coli OP50 ausgesät, wählen Sie eine einzelne Kolonie von jeder der vier Stämme von Aeromonas und E. Coli OP50 und Kultur mit 2 mL LB Brühe bei 37 ° C 16 h. Hinweis: Hier die folgenden Bakterienstämme wurden verwendet: E. Coli OP50, die normalen Nahrungsquelle von C. Elegans. A. Dhakensis AAK1, der ersten vollständig sequenziert pathogenen klinische A. Dhakensis isolieren. A. Hydrophila A2-066, A. Veronii A2-007 und A. Caviae A2-9307121 sind repräsentativ klinischen Isolaten von National Cheng Kung University Hospital.</li>
	<li>Messen die OD600 Extinktion der Bakterien Brühe und passen Sie die Bakterien Brühe auf OD600 = 2,0 mit LB Brühe. Vor Ort und 30 µL bakterielle Brühe auf 6 cm NGM Platten zu verbreiten. Die Platten bei Raumtemperatur über Nacht Kultur.</li>
	<li>Am Tag wachsen die L1-Würmer auf die L4-Bühne, Transfer 50 Würmer auf jede NGM-Platte mit jedem der vier Stämme von Aeromonas oder E. Coli OP50. Die NGM-Platten bei 20 ° c inkubieren Übertragen Sie Würmer alle 24 h neu vorzubereitenden NGM-Platten mit Bakterien.</li>
	<li>Muskel-Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop zu nehmen.<ol>
<li>Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie 10 Würmer auf eine 2 % Agarose-Gel in M9 Medium auf einer Folie aus. Die Würmer mit 2 µL 1 % Natriumazid in M9 Medium auf Agarose für weniger als 5 min vor der Einnahme von Bildern zu lähmen.</li>
		<li>Legen Sie ein Deckglas und Aufnahmen mit einem grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Filtern auf dem Fluoreszenz-Mikroskop mit – Coupled Ladegerät Kamera Muskel. Die Muskel-Aufnahmen bei 24, 48 und 72 h nach der L4-Bühne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie Bild-Analyse und Abbildung Vorbereitung mit Bildverarbeitungs-Software. Hinweis: Die Definitionen der Partituren und die Muskel-Schadenshöhe sind in Abbildung 3, für die aufgeführten Kriterien wie folgt dargestellt: 3 Punkte für fehlende Muskelfasern; 2 Punkte für gerissene oder gebrochene Muskelfasern; 1 Punkt für gebogene Muskelfasern; 0 Punkte für gesunden Muskelfasern.</li>
</ol>6. statistische Analysen
<ol><li>Durchführen Sie selbstständig alle Experimente mindestens drei Mal.</li>
	<li>Verwenden Sie die Kaplan-Meier-Methode, um die C. Elegans überleben Assays zu beurteilen, und verwenden Sie die Log-Rank-Test überleben Unterschiede zu analysieren. Statistischen Signifikanz auf 0,05 festgelegt.</li>
	<li>Verwenden Sie Studenten t-Test, um die statistischen Ergebnisse von C. Elegans flüssige Toxizität Assays für die beiden unterschiedlichen Gruppen zu analysieren. One-Way ANOVA-Test bei der Analyse der Unterschiede zwischen den drei oder mehrere Werte für eine unabhängige Variable zu verwenden. Statistischen Signifikanz auf 0,05 festgelegt.</li>
</ol>

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<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

C. Elegans ist das natürlich eine Bacterivorous Nematode Zufuhr Bakterien als Nahrung und hat eine komplizierte angeborene Immunität gegen Bakterien während seiner evolutionären Prozess entwickelt. Zwei der wichtigsten Organe Erhaltung und Unterstützung der Immunität sind die Epidermis und Darm9,13. Die Epidermis und Bands des Muskels von C. Elegans ähneln die Weichgewebe Strukturen in Säugetieren und beim Menschen6. Aufg...

Der menschliche Krankheitserreger Aeromonas, nachweislich klinisch Gastroenteritis, Wundinfektionen, Sepsis und Harnwege Infektionen1,2verursachen. Die meisten menschlichen Erkrankungen gemeldet wurden, vier bakteriellen Spezies zugeordnet werden: Aeromonas Dhakensis, Aeromonas Hydrophila, Aeromonas Veroniiund Aeromonas Caviae 2,3 , 4 , 5. unter den Infektionskrankheiten Aeromonas , Weichgewebe Infektionen können schwerer Morbidität und Mortalität beim Menschen auslösen. Muskel Nekrose ist hervorzuheben die schwerste Form von Weichgewebe-Infektion-6. Beobachtung des Überlebens und Muskel Nekrose von Caenorhabditis Elegans nach der Infektion ist eine bequeme Methode, um die Toxizität von Aeromonasspekulieren.
Wissenschaftler haben bereits zahlreiche Modellorganismen um bakterielle Infektionen zu studieren entwickelt. In früheren Studien wurden Mäuse, Zebrafishes und Nematoden Tiermodelle zur Untersuchung der Pathogenese und Virulenz von Aeromonas6,7,8. Jedes Tier-Modell hat seine "Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten. Der Modellorganismus Caenorhabditis Elegansist eine Bacterivorous-Nematode welche Aufnahme-Bakterien als Foodnaturally. C. Eleganshat eine komplizierte angeborene Immunsystem gegen bakterielle Infektion im Laufe seiner Evolution entwickelt. Unter dem Druck der bakteriellen Infektion hat C. Elegans erwiesen eine ausgezeichnete Infektionsmodell, die bakterielle Pathogenese von Aeromonas6,7,9 und anderen Krankheitserregern zu studieren wie Pilz10 und enterohämorrhagische Escherichia coli O157: H711. Allerdings gibt es noch keine Publikation, die auf die Methodik im Umgang mit C. Elegans als Modell für das Studium der Virulenz der Aeromonaskonzentriert.
Hier stellen wir drei verschiedene Experimente zur Untersuchung der Aeromonas Infektion mit C. Elegans als Tiermodell: Assays für überleben, flüssige Toxizität und Muskel Nekrose. Diese Methoden sind eine bequeme Möglichkeit, die Toxizität unter und innerhalb der Arten Aeromonas bewerten und verbessern das Verständnis der Pathogenese der Aeromonas.

<table><tbody><tr><td>Schüttel-Inkubator</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>Bakterien-Inkubation</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td>MP021519455</td><td>Vorbereitung des Nährmediums&nbsp;</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-05</td><td>Vorbereitung des Nährmediums&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td>MP021914405</td><td>Herstellung von Nährmedien&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>31434</td><td>Vorbereitung des Nährmediums</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>SIGMA</td><td>M7506</td><td>Vorbereitung des Nährmediums</td></tr><tr><td>agar</td><td>Difco</td><td>214530</td><td>Zubereitung des Nährmediums</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>Vorbereitung des Nährmediums</td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>SIGMA</td><td>C8503</td><td>Zubereitung des Kulturmediums</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>SIGMA</td><td>32205</td><td>Zubereitung des Nährmediums</td></tr><tr><td>KOH</td><td>SIGMA</td><td>P5958</td><td>Vorbereitung des Nährmediums</td></tr><tr><td>6 cm Petriplatte</td><td>ALPHA PLUS</td><td>46</td><td>Agarplatte Vorbereitung</td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>FALCON</td><td>353072</td><td>Liquid Assay</td></tr><tr><td>bakterielles Pepton</td><td>Affymetrix/USB</td><td>AAJ20048P2</td><td>Vorbereitung des Kulturmediums</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>SIGMA</td><td>92144</td><td>Zubereitung des Nährmediums</td></tr><tr><td>Zitronensäure & Bulle; H2O</td><td>SIGMA</td><td>C1909</td><td>Vorbereitung des Nährmediums</td></tr><tr><td>Tri-Kaliumcitrat & Bull; H2O</td><td>SIGMA</td><td>104956</td><td>Herstellung von Nährmedium</td></tr><tr><td>FudR&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>1271008</td><td>Vorbereitung des Nährmediums</td></tr><tr><td>Dinatrium-EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E1644</td><td>Zubereitung des Kulturmediums</td></tr><tr><td>FeSO4&bull; 7 H2O</td><td>SIGMA</td><td>215422</td><td>Vorbereitung des Nährmediums</td></tr><tr><td>MnCl2&bull; 4 H2O</td><td>SIGMA</td><td>221279</td><td>Vorbereitung des Nährmediums</td></tr><tr><td>ZnSO4&bull; 7 H2O</td><td>SIGMA</td><td>204986</td><td>Vorbereitung des Nährmediums&nbsp;</td></tr><tr><td>CuSO4&bull; 5 H2O</td><td>SIGMA</td><td>C8027</td><td>Vorbereitung des Nährmediums</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>SIGMA</td><td>16922</td><td>Zubereitung des Nährmediums</td></tr><tr><td>Mikroskopsystem</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipase Ti invert&nbsp;</td><td>Mikroskopische Bildgebung</td></tr><tr><td>Wissenschaftliche CCD-Kamera</td><td>QImbsp;</td><td>Retiga-2000R Fast 1394&nbsp;</td><td>Mikroskopische Bildgebung</td></tr></tbody></table>

bewertung von virulenz und pathogenese der aeromonas infektion in einem caenorhabditis elegans -modell

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Der menschliche Krankheitserreger Aeromonas nachweislich klinisch Gastroenteritis, Wundinfektionen, Sepsis und Infektionen der Harnwege verursachen. Die meisten menschliche Krankheiten gemeldet wurden, vier Arten von Bakterien zugeordnet werden: Aeromonas Dhakensis, Aeromonas Hydrophila, Aeromonas Veroniiund Aeromonas Caviae. Der Modellorganismus Caenorhabditis Elegans ist eine Bacterivore, die eine ausgezeichnete Infektionsmodell durch, um die bakterielle Pathogenese der Aeromonaslernen bietet. Hier stellen wir drei verschiedene Experimente zur Aeromonas Infektion mit C. Elegans -Modell, einschließlich überleben, flüssige Toxizität und Muskel Nekrose Assays zu studieren. Die Ergebnisse der drei Methoden, die Bestimmung der Virulenz der Aeromonas entsprachen. A. Dhakensis zeigte sich der giftigsten unter den 4 wichtigsten Aeromonas Arten klinische Infektionen verursachen werden. Diese Methoden erweisen sich als eine bequeme Möglichkeit zum Bewerten der Toxizität unter und innerhalb der Arten Aeromonas und dazu beitragen, unser Verständnis der Pathogenese der Aeromonas Infektion.

Folgen Sie den oben beschriebenen Protokolle, ist es leicht zu unterscheiden, die Toxizitäten von den vier Aeromonas Strapazen. Die überleben-Assay von C. Elegans ist in Abbildung 1dargestellt. Die Überlebensraten von C. Elegans mit Aeromonas Arten, im Auftrag von hoch zu niedrig angezeigt infiziert waren: A. Caviae, A. Veronii, A. Hydrophila und A. Dhakensis. Zwar gibt es Vielfalt in Bezug auf Toxizität u...

Hier stellen wir drei verschiedene Experimente zur Aeromonas Infektion in C. Eleganszu studieren. Mit diesen praktischen Methoden, ist es leicht, die Toxizität unter und innerhalb der Aeromonas Arten zu bewerten.

Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas Infektion in einem Caenorhabditis Elegans -Modell

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Wirts-Pathogen-Interaktionsfeld wie die Pathogenität und Virulenz einer bakteriellen Infektion zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir die Toxizität zwischen und innerhalb von Aeromonas Arten bewerten und zu unserem Verständnis der Pathogenese der Aeromonas-Infektion beitragen können. Um zu beginnen, etwa 2.000 gravid erwachsene Würmer mit sterilem entionisiertem Wasser zu waschen.Wiederholen Sie die Wäsche dreimal, um die Würmer an der Unterseite des Rohres zu halten. Nach dem Zentrieren entfernen die Würmer den Überstand und halten die Würmer in 3,5 Milliliter entionisiertem Wasser. Fügen Sie einen Milliliter Natriumhypochlorit und 0,5 Milliliter Kaliumhydroxid in die Röhre.Dann schütteln Sie das Rohr für sechs Minuten, um die Wurmkörper zu lysieren. Nachdem die Eier freigegeben wurden, fügen Sie 10 Milliliter entionisiertes Wasser hinzu, um die Lyse zu stoppen. Dann zentrifugieren Sie das Rohr, um die Eier nach unten zu ziehen und so viel vom Überstand wie möglich zu entfernen.Waschen Sie die Eier mit 15 Milliliter M9 Medium mindestens dreimal. Die Eier auf ein 3,5-Zentimeter-Gericht übertragen und bei 20 Grad Celsius für eine Nacht bebrüten. Danach entfernen Sie 10 Mikroliter L1-Würmer und M9-Medium von der Platte.Zählen Sie die Würmer und erhalten Sie die Konzentration von L1-Würmern im M9-Medium. Mit einer Pipette nehmen Sie 0,5 Milliliter E.coli OP50 LB Brühe und verteilen Sie sie auf einer ENGM-Platte. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 16 bis 18 Stunden.Kühlen Sie die ENGM auf Raumtemperatur. Dann Samen inkubierte L1-Würmer auf einer ENGM-Platte mit E.coli OP50. Die Würmer bei 20 Grad Celsius bebrüten, bis sie die L4-Stufe erreichen.Wählen Sie zunächst eine einzelne Kolonie jeder der vier Aeromonas-Stämme aus und bemalen sie entsprechend dem Textprotokoll. Messen Sie dann die OD 600 Absorption der bakteriellen Brühe und passen Sie sie an, bis die Absorption gleich 2,0 ist. Nächster Punkt und 30 Mikroliter bakterielle Brühe von jedem Stamm in NGM-Platten verteilen.Wählen Sie zufällig die zuvor vorbereiteten L4-Würmer aus und übertragen Sie sie mit den Aeromonas-Stämmen auf die NGM-Platten. Dann inkubieren Sie die Platten bei 20 Grad Celsius, bis der Test abgeschlossen ist. Übertragen Sie jeden Tag alle lebenden Würmer auf eine neue NGM-Platte mit Bakterien.Zähle die Anzahl der lebenden, toten und Sensorwürmer jeden Tag, bis der letzte Wurm tot ist. Nach der Kultivierung der Aeromonas-Stämme und der Messung ihrer Absorptionsfähigkeit, wie zuvor beschrieben, zentrieren Sie die bakterielle Brühe bei 3, 500 g für 15 Minuten. Stellen Sie die bakterielle Brühe mit S Medium ein.Und fügen Sie 195 Mikroliter bakterielle Brühe in die S-Mittel bis acht Brunnen einer 96-Well-Platte. Die Würmer von der ENGM-Platte mit m9 medium abwaschen. Passen Sie dann die Konzentration der Wurmlösung auf fünf Würmer pro Mikroliter an.Fügen Sie fünf Mikroliter der Wurmlösung zu jedem der Brunnen der 96-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie die Platte auf einem Shaker, und zählen Sie die Anzahl der lebenden Würmer bei 24, 48 und 72 Stunden. Nach der Kultivierung von Aeromonas-Stämmen und der Anpassung der Absorption gemäß dem Textprotokollspot und der Ausbreitung der Bakterienbrühe auf NGM-Platten.Danach 50 L4-Würmer auf jede NGM-Platte übertragen. Alle 24 Stunden die Würmer auf frische NGM-Platten übertragen. Wählen Sie zufällig 10 Würmer aus und übertragen Sie sie auf ein 2%Agarose-Gel in M9-Medium auf einer Folie.Positionieren Sie schließlich einen Coverslip auf dem Gel und erfassen Sie Muskelbilder mit einem grünen fluoreszierenden Proteinfilter auf einem fluoreszierenden Mikroskop, das mit einer Kamera ausgestattet ist. In diesem Protokoll wurden die Toxizitäten von vier Aeromonas-Stämmen bewertet. Die Überlebensrate von C.elegans, die mit Aeromonas-Arten infiziert waren, war am höchsten in Assays mit A.caviae und am niedrigsten bei Assays mit A.dhakensis.In einem flüssigen Toxizitätstest verringerte sich das Überleben von C.elegans signifikant, wenn es mit A.dhakensis oder A.hydrophilia infiziert wurde. In der Muskelnekrose Assay Grade der Muskelschäden variierten zwischen den Aeromonas Arten. A.caviae verursachte die wenigsten Muskelschäden, während A.dhakensis die meisten Muskelschäden produzierte.Die in diesem Video beschriebenen Methoden bieten eine bequeme Möglichkeit, die Virulenzvielfalt zwischen und innerhalb der Aeromonas-Arten zu unterscheiden. Darüber hinaus ist es auch ein zuverlässiges Modell, um die Wechselwirkung zwischen einem Erreger und wirt zu studieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Anderson, Q. L., et al. Ein Pathosystem von C. elegans mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt auf Flüssigkeitsbasis. J. Vis. Exp. (2018)Das Video zeigt einen flüssigkeitsbasierten Assay, bei dem genetisch veränderte C . elegans-Larven in einer Mikroplatte pathogenen Bakterien ausgesetzt werden. Bakterielle Toxine, die in das Medium ausgeschieden werden, führen zu Stress und Tod des Wirts. Ein Fluoreszenzfarbstoff färbt tote Würmer und ermöglicht so eine bildgebende Quantifizierung der...

Bewertung der durch pathogene Bakterien induzierten Mortalität bei Larven von C. elegans

Quelle: Chen, Y., et al. Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas-Infektion in einem Caenorhabditis elegans-Modell . J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert einen Überlebenstest mit C. elegans , um die Pathogenese von Aeromonas zu modellieren, bei der die orale Aufnahme der Bakterien zu Darminfektionen und Sterblichkeit führt und so eine quantitative Bewertung der bakteriellen Virulenz in einem lebenden Wirtssystem ermöglicht.

Modellierung der Aeromonas-Pathogenese bei C. elegans mit einem Überlebenstest

Quelle: Chen, Y., et al. Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas-Infektion in einem Caenorhabditis elegans-Modell. J. Vis. Exp. (2018).Dieses Video demonstriert den C. elegans Liquid Toxicity Assay mit Aeromonas, eine Methode zur Bewertung bakterieller Virulenz durch Messung des Überlebens von Würmern in einer nährstoffarmen flüssigen Umgebung. Der Test zeigt stammspezifische Pathogenität anhand des Ausmaßes der durch Toxinen verursachten Schäden und Sterblichkeit bei C. elegans.

Bewertung der bakteriellen Virulenz mit dem C. elegans Liquid Toxicity Assay

Quelle: Chen, Y. et al., Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas-Infektion in einem Caenorhabditis elegans-Modell . J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt einen Muskelnekrose-Test bei C. elegans (Caenorhabditis elegans) unter Verwendung pathogener Aeromonas-Stämme . Durch die Fütterung von grünen fluoreszierenden Proteinen (GFP)-exprimierenden Würmern auf Aeromonas-Samenplatten modelliert der Test bakterielle Infektionen und zeigt Gewebeschäden durch fluoreszenzbildende Bildgebung.

Muskelnekrose-Test bei C. elegans, induziert durch einen pathogenen Aeromonas-Stamm

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Messung der Auswirkungen von Bakterien auf<em&gt; C. Elegans</em&gt; Verhalten Mit einem Ei Retention Assay

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Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas Infektion in einem Caenorhabditis Elegans -Modell

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