Multiplexen fokussiert Ultraschall-Stimulation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Mechanobiologie zu beantworten, wie z. B. wie biologische Proben auf mechanische Kräfte reagieren, die durch Ultraschallstimulation mit geringer Intensität erzeugt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es einem Experimentalisten ermöglicht, keine invasiven mechanischen Kräfte auf eine Probe anzuwenden und verschiedene biologische Perimeter in Echtzeit zu messen. Zunächst bohren Sie langsam ein 12-Millimeter-Loch an der Unterseite einer 35-Millimeter-Standard-Kulturschale mit einem vertikalen Pressbohrer.

Nach dem Bohren entfernen Sie Kunststoffstücke, die mit einer Klinge an der Unterseite der Schale befestigt sind, um eine glatte Oberfläche auf der Außenseite zu schaffen. Als nächstes, wenden Sie eine dünne Schicht von marinen Qualität Epoxid oder Kleber an der äußeren unteren Oberfläche der Schale. Legen Sie auf den Klebstoff einen zwei Punkt-fünf-Mikron dicken Polyesterfilm, der fest presst, um sicherzustellen, dass sich der Klebstoff gleichmäßig zwischen der Folie und der dicken Kunststoffoberfläche ausbreitet.

Ziehen Sie den Film vorsichtig zentrifugal mit den Fingern, um eine flache Oberfläche zu schaffen. Sobald der Klebstoff getrocknet ist, spülen Sie die Polyester-Bodenschale kurz mit 95% Ethanol ab. Anschließend sterilisiert UV die Schale, indem sie sie unter eine starke UV-Anregungsquelle von 254 Nanometern stellt.

Passen Sie Dauer und Intensität an, um eine UV-Dosis von etwa 330 Millijoule pro Quadratzentimeter zu liefern. Als nächstes verdünnen Sie eine handelsübliche extrazelluläre Matrixproteinmischung mit dem gewünschten Kulturmedium im Verhältnis eins zu 100. Arbeiten Sie auf Eis, um eine Matrixpolymerisation zu verhindern, und tragen Sie schnell 100 Mikroliter der Mediummischung auf die Polyesterfolie auf.

Legen Sie den Deckel wieder auf die Schale, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Einmal abgedeckt, inkubieren Sie die matrixbeschichteten, Polyester-Bodenschalen in einer Zellkultur, einem mit Kohlendioxid gepufferten Inkubator bei 37 Grad Celsius für sechs bis zwölf Stunden. Nach der Inkubation das überschüssige Medium ansaugen und die Oberfläche direkt mit Zellen bei der gewünschten Dichte säen.

Legen Sie einen Wassertank unter das Ziel eines aufrechten Mikroskops. Positionieren Sie dann mit handelsüblichen optomechanischen Komponenten den Probenhalter zwischen Dem Objektiv und dem Messumformer. Stellen Sie sicher, dass sich die beweglichen Teile und die Aktuatoren der Übersetzungsstufen entweder außerhalb des Tanks oder oberhalb der Wasserleitung befinden, um Wasserschäden zu vermeiden.

Dann füllen Sie den Tank mit entionisiertem und entgastem Wasser bis zur horizontalen Ebene des Probenhalters, bevor Sie den Tauchaufnehmer verwenden. Mit nicht korrosiven, kommerziell erhältlichen optomechanischen Komponenten stellen Sie sicher, dass der Messumformer in einer schrägen Position in Bezug auf den optischen Pfad ist. Dadurch wird sichergestellt, dass alle reflektierten Wellen von der Probe weggelenkt werden.

Stellen Sie die Frequenz des Funktionsgenerators an die nenne Spitzenfrequenz des Messumformers ein. Erstellen Sie dann einen sinusförmigen Spannungsimpuls der gewünschten Dauer und Wiederholungsfrequenz, indem Sie den Burst-Modus des Funktionsgenerators verwenden. Passen Sie als Nächstes die Spitzenspannung auf einen gewünschten Wert an.

Stellen Sie sicher, dass die Pulsdauer kürzer ist als die verstrichene Zeit zwischen zwei aufeinanderfolgenden Impulsen. Schließen Sie den Ausgang des Funktionsgenerators an den Eingang eines Oszilloskops an. Verwenden Sie das Oszilloskop, um zu bestätigen, dass die Wellenform dem gewünschten Signal entspricht.

Schließen Sie dann den Ausgang des Funktionsgenerators an den Eingang einer Leistung eines hf-Verstärkers in richtiger Größe an. Mit einer Hydrophonsonde, die mit einem Frequenzbereich und einer mit der des Ultraschallwandlers kompatiblen Akustischen Intensität arbeitet, bringen Sie die Spitze der Sonde vorsichtig in den Fokus innerhalb des Sichtfeldes des Objektivs an der Position der Probe. Stellen Sie sicher, dass sowohl Sonde als auch Messumformer in das Wasserbad eingetaucht sind und führen Sie eine grobe Vorausrichtung des Messumformers durch, indem Sie seine akustische Achse visuell zur Hydrophonsonde positionieren.

Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen den beiden der Brennweite des Messumformers entspricht. Stoßen Sie die Spitze des Hydrophons nicht mit einem anderen physikalischen Objekt als Wasser, da dies seine Beschichtung verändern und die Messung beeinflussen wird. Schließen Sie als Nächstes den Hydrophone-Ausgang an einen der Signaleingänge des Oszilloskops an.

Verbinden Sie dann den Synchronisationstrigger des Funktionsgenerators mit einem anderen Oszilloskop-Eingang. Visualisieren Sie beide Signale gleichzeitig auf dem Oszilloskop. Als nächstes fahren Sie den Messumformer mit wenigen Ultraschallzyklen bei einem niedrigen Zyklus und geringer Amplitude, um eine Beschädigung der Sonde zu vermeiden.

Erkundigieren Sie sich bei den sicheren Betriebsbedingungen des Herstellers des Hydrophons, um eine Beschädigung der Hydrophonspitze zu vermeiden. Passen Sie den S-Division-Regler entsprechend der Fahrzeit des Ultraschalls von der Oberfläche des Messumformers auf das Hydrophon an. Suchen Sie nach einem Hydrophone-Signal auf dem Oszilloskop nach dem Synchronisationsauslöser.

Als nächstes betätigen Sie den Messumformer langsam mit einer motorisierten oder manuellen XYZ-Stufe. Positionieren Sie den Messumformer in der Position, die mit dem maximalen Hydrophonsignal korreliert. Wenn der Strahl nun ausgerichtet ist, messen Sie die Peak-to-Peak-Amplitude des Hydrophonausgangs am Oszilloskop für verschiedene Spannungen, die den Messumformer antreiben.

Achten Sie darauf, die Druckgrenze des Hydrophons nicht zu überschreiten. Ersetzen Sie das Kulturmedium der Zelle durch den gewünschten Bildgebungspuffer, der fünf Mikromolar eines zellpermeant, kalziumempfindlichen Farbstoffs wie Fluo-4 AM enthält. Dann die Kulturschale in einem kohlendioxidgepufferten Inkubator bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubieren. Nach der Inkubation zellen mit demselben Farbpuffer sorgfältig waschen.

Dann legen Sie die Schale in den Probenhalter. Erregen Sie die Zellen mit Blaulichtbeleuchtung bei 490 Nanometern. Passen Sie die Anregungsintensität und die Kamerabelichtung an, um übermäßiges Bleichen oder Pixelsättigung zu vermeiden.

Führen Sie Zeitraffer-Bildgebung mit einem Tauchobjektiv mit einem langen Arbeitsabstand für eine bessere Bildqualität und zur Reduzierung unerwünschter Reflexionen durch. Hier werden Glioblastomzellen auf extrazellulärer Matrix-beschichteter Polyesterfolie im Standardkulturmedium gezeigt. Diese Zellen wurden mit einem kalziumempfindlichen Fluoreszenzreporter inkubiert.

In diesem Bild stellen die roten Punkte einzelne fluoreszierende Zellen dar, die mit einer Bildverarbeitungssoftware identifiziert werden. Bei der Stimulation für 10 Sekunden mit Ultraschall wurden robuste Kalziumhöhen in vielen Bereichen von Interesse visualisiert. Die Anzahl der aktivierten Regionen von Interesse wird hier im Laufe der Zeit angezeigt.

Nach der 10-Sekunden-Aktivierung mit Ultraschall lagen etwa 70 % der Regionen über den benutzerdefinierten Schwellenwerten. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, den Ultraschallstrahl auszurichten, bevor Sie Fluoreszenzmessungen durchführen.