Name: Ein Sphäroid Tötung Assay von Auto-T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Lernen Sie ein Sphäroid-Tötungs-Assay mit CAR-T-Zellen zur Bewertung der Zytotoxizität gegen 3D-Tumorzellen in Echtzeit. Diese Methode kombiniert fortschrittliche Bildgebung mit immunologischen Assays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von der Norwegischen Forschungsrat unter Stipendien #244388, #254817 und #284983 unterstützt; der norwegische Krebsgesellschaft (#6829007); Der norwegische Gesundheitsregion Süd-Ost unter Grant #17/00264-6 und #2016006.

1. Generation der Sphäroide von Colorectal Krebs-Zell-Linie
<ol><li>Waschen HCT-116 (stabil auszudrücken, Differenzierung-19-Cluster (CD19) und grüne Fluoreszenz Protein (GFP) ausgestrahlt) Zelle Monolagen mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 5 mL für ein 25 cm2 oder 10 mL für ein 75 cm2 Fläschchen). Hinzufügen von Trypsin (0,5 mL für ein 25 cm2 oder 1 mL für ein 75 cm2 Fläschchen) und Zellen bei 37 ° C für 5 min inkubieren.</li>
	<li>Überprüfen Sie Ablösung der Zelle unter dem Mikroskop und Zelle Dissoziation Enzym mit kompletten Roswell Park Memorial Institute 160 Medium (RPMI 1640) zu neutralisieren (RPMI 1640 + 10 % FCS + Gentamycin; 10 mL für ein 25 cm2 oder 20 mL für ein 75 cm2 Fläschchen).</li>
	<li>Zentrifuge Zellsuspension bei 500 X g für 5 min. überstand mit einer Pipette entfernen und erneut von oben und unten mehrmals mit 5 mL des kompletten DZ1 1640 Medium pipettieren.</li>
	<li>Anzahl Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung auf einem kompatiblen Handy-Zähler.</li>
	<li>Zentrifuge Zellsuspension bei 500 X g für 5 min. überstand mit einer Pipette entfernen und erneut in RPMI Medium, 5 x 103 Zellen/mL zu erhalten.</li>
	<li>Die Zellsuspension auf einem sterilen Behälter übertragen und 200 µL/Well in eine 96-Well Runde Bodenplatten mit einer Mehrkanal-Pipette zu verzichten.</li>
	<li>Übertragen Sie die Platte auf das automatisierte bildgebenden Gerät in einen Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2).</li>
	<li>Melden Sie sich bei der Software zur Datenerfassung, wählen Sie Zeitplan zu erwerben | Start hinzufügen Schiff | Scannen nach Zeitplan | Schiff zu schaffen: neue.</li>
	<li>
Wählen Sie Scan-Typ: Sphäroid. Wählen Sie die Kanäle von Interesse: Phase + Hellfeld (, Sphäroide Wachstum zu folgen), grün (Tumor Signal folgen, Erwerb Zeit 300 ms) und rot (Apoptose zu folgen, Erwerb Zeit 400 ms).
	<ol>
<li>Wählen Sie die gewünschte Vergrößerung: 10 X.</li>
		<li>Wählen Sie Das Schalenmodell und seine Position in der Schublade. Wählen Sie die Position der Brunnen zum Bild. Geben Sie die Beschreibung des Experiments: Name, Art der Zellen, Anzahl der Zellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie für die Analyse-Setup Verschieben Analyse bis später. Rechtsklick auf die Zeitleiste und Option Festlegen ausgewählt Scan-Intervall und setzen Scans hinzufügen jedes bis 4 h und für eine Gesamtmenge von 24 h. Legen Sie die gewünschte Startzeit (mindestens 1 h nach der Inkubation in der automatisierten bildgebende Apparatur).</li>
	<li>
Überprüfen Sie alle 2 Tage für das Wachstum der Sphäroide, indem Sie sich in der imaging-Software.
	<ol>
<li>Wählen Sie die Option Ansicht den letzten scannt , und doppelklicken Sie auf das gewünschte Experiment. Wählen Sie Hellfeld im Kanälebedienfeld Bild aus und verwenden Sie dann das Tool messen Bild Funktionen zur Messung des Durchmessers der Sphäroide. Es dauert 6 Tage für ein Sphäroid, die gewünschte Größe zu erreichen: 0,5 mm Durchmesser. Fügen Sie 50 µL kompletten RPMI Medium pro Bohrloch am Tag 4, mittlere Verdunstung Effekt zu begrenzen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Generation von CD19 Auto T-Zellen
<ol><li>
Ausbau des CD19 Auto T-Zellen Hinweis: Stabile Expression von CD19 Auto T-Zellen wurde von Schüttgut retrovirale Transduktion des gesunden Spenders PBMCs als zuvor beschriebenen16übernommen. Für CD19 Auto kodierenden retroviralen Konstrukt ist ein der zweiten Generation Auto und besteht aus fmc63-ScFv-Kette, CD8 Scharnier und transmembrane Domäne, eine 4-1BB co-stimulatory Domain und schließlich ein CD3ζ-Domäne.<ol>
<li>Um zu erweitern, Zellen Kultur transduced T in Anwesenheit von Anti-CD3/28 magnetische Beads mit einer Zelle Wulst-Verhältnis von 1:1 für 10 – 11 Tage. Während der Expansion Zellen sind im kompletten Medium (X-VIVO 15, 5 % Serum Ersatz, und 100 U/mL rekombinanten menschlichen Il-2). Hinweis: Die optimale Dichte für einen effizienten Ausbau ist 1 bis 2 x 106 Zellen/mL. Abhängig von der ursprünglichen Anzahl können Zellen in Flaschen (25 cm2 Fläschchen 20 ml, 75 cm2 Flaschen bis 40 mL Gesamtvolumen) in eine Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2) erweitert werden.</li>
		<li>Als Negativkontrolle Gruppe für die folgenden Tests gehören nicht ausgestrahlt PBMCs (wird als Mock bezeichnet werden) zum Ausbau Protokoll parallel zur CD19 Auto T-Zellen.</li>
		<li>Am 3. Tag ab, fügen Sie frisches Medium jeden Tag und teilen Sie die Zellen in mehr Kulturflaschen, falls erforderlich.</li>
		<li>Am Tag 10 – 11, Zentrifuge Zellen bei 500 X g für 5 min. Überstands entfernen und kombinieren Sie alle Zellen in einem 50 mL-Tube und Aufschwemmen der Zellen in ~ 30 mL frische komplette Medien.</li>
		<li>Legen Sie die 50 mL-Tube mit der resuspendierte Zellen auf einem Magnetstativ, magnetische Beads aus dem Kulturmedium zu trennen.</li>
		<li>Warten Sie 2 – 3 min. für die Perlen auf der Seite der Röhre zu sammeln.</li>
		<li>Entfernen Sie das Kulturmedium mit einer Pipette und Übertragung auf einen neuen Schlauch ohne magnetische Bead Kollektion Zonen zu berühren.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte zur Perle Entfernung (2.1.5–2.1.7) einmal mehr um die Anzahl der Perlen in der endgültigen Kulturmedium.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie und zählen Sie die Zellen, passen Sie die Dichte auf 1 bis 2 x 106 Zellen/mL in kompletten Medium.</li>
		<li>Ruhen Sie die Zellen für mindestens 4 h bis über Nacht. Dann direkt frieren sie unten bei-80 ° C und übertragen Sie die Fläschchen mit einem flüssigen Stickstoff-Tank am folgenden Tag für die Langzeitlagerung. Alternativ kann man den Rest bis zu über Nacht für den sofortigen Einsatz verlängern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CD19 Ausdruck Fahrzeugbeherrschung auf primäre T-Zellen
	<ol>
<li>Die Anzahl der erweiterten T-Zellen, wie die Zahlen nach Übernachtung Kultur oder mäßig nach Frost/Tau-Wechseln leicht variieren können.</li>
		<li>Übertragen Sie 5 x 105 Zellen aus beiden CD19-Auto und Mock primäre T-Zellen, Flow Cytometry Rohre zu trennen.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit 200 μl Puffer fließen (2 % FBS mit PBS-Puffer) und Zentrifuge die Rohre bei 500 X g für 5 min. wiederholen Waschschritte get rid of verursacht durch das Kulturmedium Artefakte.</li>
		<li>Bereiten Sie den primären Antikörper (Biotin Goat Anti-Maus IgG, F(ab') ₂ Fragment spezifischen) mit Verdünnung 1: 200 in Puffer fließen.</li>
		<li>Zellen in 100 μl Antikörper-Mix pro Röhre Aufschwemmen und Inkubation auf Eis für 15 min. Wiederholen Sie die vorherigen Waschschritt zweimal, um überschüssige Antikörper zu entfernen.</li>
		<li>Bereiten Sie den sekundären Antikörper (Streptavidin-PE) als 1: 400 Verdünnung im Puffer fließen.</li>
		<li>Zellen in 100 μl Antikörper-Mix pro Röhre Aufschwemmen und Inkubation auf Eis für 15 min. Wiederholen Sie die vorherigen Waschschritt zweimal, um loszuwerden überschüssige Antikörper.</li>
		<li>Zellen in 200 μL der Flow Puffer pro Röhre Aufschwemmen und auf einem Durchflusszytometer analysiert.</li>
		<li>Verwendung Mock T-Zellen die negativen und positiven Tor einrichten und analysieren CD19 Auto ausgestrahlt T-Zellen entsprechend.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 3D Tumor Sphäroid Tötung Assay
<ol><li>
Nach 6 Tagen oder einmal Sphäroide erreichen Sie die gewünschte Größe, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator. Entfernen Sie mit einem Mehrkanal-Pipette, vorsichtig 100 µL/Well des kompletten RMPI 1640 Medium von den Sphäroid Platten.
	<ol>
<li>Für diesen Schritt Winkel die Spitzen nach innen Wand der 96-Brunnen Platte, Vermeidung von Kontakt mit dem Boden des Brunnens um Störungen der Sphäroide zu minimieren. Volumen der verbleibenden muss rund 100 µL betragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine 1: 200-Lösung von Annexin V rot durch das Mischen von 50 µL Annexin V rot mit 9,95 mL komplette RPMI 1640 Medium.</li>
	<li>100 µL/Well 1: 200 Annexin V rot Lösung hinzufügen.</li>
	<li>Die Platte auf ein Brutkasten für 15 min (37° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2) übertragen.</li>
	<li>Ernten Sie die transduced Auto CD19 T-Zellen in einem 15 mL-Tube und Zentrifuge bei 500 X g für 5 min. entfernen den Überstand mit einer Pipette und Aufschwemmen von oben und unten mehrmals mit 2 mL des kompletten DZ1 1640 Medium pipettieren.</li>
	<li>Anzahl Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung auf einem kompatiblen Handy-Zähler.</li>
	<li>Zentrifuge Zellsuspension bei 500 X g für 5 min. überstand mit einer Pipette entfernen und erneut in RPMI Medium, 2 x 105 Zellen/mL zu erhalten.</li>
	<li>Die Zellsuspension auf einem sterilen Behälter übertragen und 100 µL/Well in eine 96-Well Runde Sphäroid Bodenplatte mit einer Mehrkanal-Pipette zu verzichten.</li>
	<li>Übertragen Sie die Platte wieder auf das automatisierte bildgebenden Gerät in einen Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2).</li>
	<li>
Melden Sie sich bei der Software zur Datenerfassung, wählen Sie Zeitplan zu erwerben.
	<ol>
<li>In der Scan-Zeitleiste mit der rechten Maustaste und wählen Sie Bearbeiten Zeitleiste. Mit der rechten Maustaste auf die Scan-Gruppe, und löschen Sie ihn. Auf der Zeitleiste mit der rechten Maustaste und wählen Sie Set ausgewählt Scan-Intervall und fügen Sie Scans alle 1,5 h und für eine Gesamtmenge von 24 h.</li>
		<li>Legen Sie die gewünschte Startzeit (mindestens 1 h nach der Inkubation in der automatisierten bildgebende Apparatur). Wählen Sie Speichern Scans Zeitplan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. automatische Bildanalyse
<ol><li>Melden Sie sich bei Erwerb, wählen Sie die Option " Ansicht den letzten Scans " und wählen Sie Starten Analyseoption. Wählen Sie erstellen neue Analysedefinition | Berechnungsart: Sphäroid. Kreuzen Sie die Bild-Kanäle (Phase + Hellfeld, grün und rot) zu analysieren.</li>
	<li>Wählen Sie mindestens 10 repräsentative Bilder: in der Regel 1 pro Zustand und mindestens 3 Zeitpunkten (Anfang, Mitte und Ende des Erwerbs).</li>
	<li>Vorschau der Standardwert analysieren Verfahren auf dem ganzen Bildstapel.</li>
	<li>Ändern Sie die Parameter für Hellfeld-Maske. Typische Kennwerte sind: Empfindlichkeit 10, Bohrung Füllung 1.000 µm2, min. Bereich 1.000 µm2. Vorschau auf das ganze Bildstapel und überprüfen Sie, ob die ausgewählten Parameter der Sphäroide genau zu erfassen.</li>
	<li>Ändern Sie die Parameter für grüne Maske (GFP). Typische Kennwerte sind: Segmentierung der Zylinder mit Radius 200 µm und Schwelle 3 AVV, Rand abgespalten, Loch zu stopfen, 5.000 µm2, Adjust-2 Pixel, Bereich min. 3.000 µm2. Vorschau auf das ganze Bildstapel und überprüfen Sie, ob die ausgewählten Parameter der Sphäroide genau zu erfassen.</li>
	<li>Ändern Sie die Parameter für die rote Maske (Annexin V). Typische Kennwerte sind: Segmentierung der Zylinder mit Radius 150 µm und Schwelle 2 AVV, Rand abgespalten, Loch zu stopfen, 5.000 µm2, passen Sie Größe 0 Pixel, Bereich min. 1.000 µm2. Vorschau auf das ganze Bildstapel und überprüfen Sie, ob die ausgewählten Parameter der Sphäroide genau zu erfassen.</li>
	<li>
Starten Sie den Analyzer.
	<ol>
<li>Sobald die Analyse abgeschlossen ist, extrahieren Sie die Messung von Interesse. Wählen Sie die analysierten Datei und dann die Option Grafik Metriken . Wählen Sie die Metrik der Zinsen, der Scan und Brunnen. In der Regel rot und grün Gesamtintensität im Hellfeld Grenzen geben die genauesten Messungen durch die Beschränkung des Signals der Fluoreszenz der Sphäroide Grenzen bestimmt durch die Hellfeld-Maske (Abbildung 3). Ausgewählte Kennzahlen in mehreren Datei-Format durch Klicken auf "Daten exportieren" zu extrahieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fahren Sie mit der Extraktion von Bildern und Filmen durch die Auswahl der analysierten Datei und wählen Sie dann die Option exportieren Sie Bilder und Filme . Zwei Optionen stehen zur Verfügung, entweder "als"abrufen Bilder und Filme als angezeigt auf der imaging-Software (in der Regel zusammengesetzte Bilder), entweder "gespeichert" zum Abrufen von raw-Daten für externe Analysen durch dritte Teil Software gesehen.</li>
</ol>

<ol><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+B-lineage+cells+and+regression+of+lymphoma+in+a+patient+treated+with+autologous+T+cells+genetically+engineered+to+recognize+CD19%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19.</a> Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cells%3A+the+long+and+winding+road+to+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors.</a> Cell Death & Disease. 9 (3), 282(2018).</li>
<li>Amann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+innovative+3D+cell+culture+system+to+study+tumour--stroma+interactions+in+non-small+cell+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells.</a> PLoS One. 9 (3), e92511(2014).</li>
<li>Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+of+fibroblasts+induces+proinflammatory+chemokine+secretion+promoting+leukocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).</li>
<li>Birgersdotter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culturing+of+the+Hodgkin+lymphoma+cell-line+L1236+induces+a+HL+tissue-like+gene+expression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern.</a> Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Galateanu, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.spandidos-publications.com/10.3892/ijo.2016.3467?text=abstract">Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response.</a> International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).</li>
<li>Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-Formation+%28Colonosphere%29+Assay+for+in+Vitro+Assessment+and+Expansion+of+Stem+Cells+in+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).</li>
<li>Izraely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Metastatic+Microenvironment%3A+Melanoma-Microglia+Cross-Talk+Promotes+the+Malignant+Phenotype+of+Melanoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells.</a> International Journal of Cancer. , (2018).</li>
<li>Khawar, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Dimensional+Mixed-Cell+Spheroids+Mimic+Stroma-Mediated+Chemoresistance+and+Invasive+Migration+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma.</a> Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).</li>
<li>Merker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+ErbB2-CAR-engineered+cytokine-induced+killer+cells+for+the+treatment+of+high-risk+soft+tissue+sarcoma+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children.</a> Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).</li>
<li>Mittler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Monitoring+of+Drug+Effects+in+a+3D+Spheroid+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncolology%22%5BJournal%5D)">High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model.</a> Frontiers in Oncolology. 7, 293(2017).</li>
<li>X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpredicted+phenotypes+of+two+mutants+of+the+TcR+DMF5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Verwendung von Sphäroide als ein innovatives Tool, um zukünftige Krebsbehandlung zu überprüfen ist ein Feld des wachsenden Interesses in den letzten Jahren geworden. Sphäroide stellen eine Zwischenstufe zwischen klassischen 2D in-vitro-Analyse und in-vivo Bewertung dar. Die Methode weiter hält eine Menge Versprechen bezüglich ihrer Wirksamkeit in Bezug auf Tumor imitiert Mikro-Umgebung sowie Profilierung7gen. Das Protokoll in dieser Publikation vorgestellt wurde von Saheen Et Al.<sup ...

Adoptiveltern Zelltransfer (ACT) repräsentiert die nächste Generation-Krebs-Behandlung. Es stützt sich auf die Injektion von Effektorzellen (T - und NK-Zellen) in einem Patienten. Diese Zellen können genetisch mit einem Rezeptor geändert werden, die zu ihrem Ziel, den Tumor zu führen und zu zerstören. Vor kurzem wurde dieser Ansatz gezeigt, möglich sein, wenn ein gegen den B-Zell-Marker CD19 Chimeric Antigen Rezeptor (Auto) in die Patienten T-Zellen zu töten, seine/ihre Krebs-1eingeführt wurde. Bei Auto, welches eine künstliche Rezeptor, das Design besteht aus spezifischen Antikörperfragmente der Antigen-bindende Domäne auf eine Entität benannten einzelne Kette Variable Fragment (ScFv), reduziert auf die T-Zelle Signalisierung Domänen verknüpft. Zwar gibt es mehrere Entwürfe, die am häufigsten verwendeten Versionen bezeichnet als zweite Generation Auto-Designs, der CD3z für die TCR Signalisierung und einer co-stimulatory Domäne bestehen (CD28, 4-1BB, OX40, etc..) 1 , 2. Feld Immuntherapie geleitet die meisten ihre Aufmerksamkeit auf diese neue Form des Gesetzes, wenn CD19 CAR-T-Zellen wirksam zahlreiche Patienten mit B-Zell-Tumoren3,4 behandelt. Nach diesem Erfolg versuchten Forscher ähnliche Entwürfe zu nutzen, indem Sie auf andere Epitope bei soliden Tumoren mit begrenztem Erfolg. Der Mangel an spezifischen Tumorantigenen und den härteren Tumor Mikroumgebungen gerendert CAR T Zellen leider weniger effektiv gegen solide Tumore5.
Setzen derzeit, die am häufigsten verwendeten in Vitro Validierungsstrategien auf zweidimensionale (2D) Systeme, die nur ein Fragment der bereits genannten soliden Tumoren Herausforderungen anzugehen. Klassisch, beinhalten 2D in-vitro- Systeme eine Mischung aus Auto-T-Zellen und Ziel Krebszelllinien als Monolagen zur Beurteilung der Funktionalität und Spezifität dieser Effektor-Zellen. Obwohl diese Strategien wichtige und entscheidende Teile des Studiums sind, sie nicht die komplexe Morphologie und dreidimensionale (3D) Struktur der Krebs Zellen6berücksichtigen. Krebszellen in 3D Systeme, genannt Sphäroide, kultiviert erwerben neue phänotypische Merkmale durch Veränderungen im gen Ausdruck Profil7, in dem die Anerkennung durch die umgeleiteten Effektorzellen beeinflussen könnten. Birgersdotter und Kollegen gezeigt, dass eine Hodgkin Lymphom (HL) Zell-Linie, wenn nur in einem 3D Culture Modell gewachsen ein Genexpressionsprofil erwirbt, die primären Tumor Proben8ähnlich ist. Daher culture Sphäroide oder ähnliche 3D Methoden Angebot relevanter in Vitro Modellen im Gegensatz zu standard-2D-Systeme. Solche Systeme sind auch ähnlich wie in vivo-Studien, die als der letzte Schritt im Prozess Validierung eines bestimmten Autos gesehen werden. Wenn man bedenkt, dass 2D Systeme versagen, die Morphologie des Krebs-Cluster zu imitieren, Sphäroide bieten ähnliche Formationen zur Beurteilung der Funktionalität des CAR-T-Zellen vor dem in-vivo-Modelle. In einer Studie, Pickl Et Al. festgestellt, dass ein Sphäroid Modell des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (HER2) Krebszellen überexprimiert ähnliche Signalisierung Profile zur in-vivo Modelle9demonstriert. Dies unterstützt weiter die Sphäroide relevant und Nähe zu in Vivo Beurteilung der Auto-T-Zellen bieten. Darüber hinaus Auto T-Zell-Validierung gegen Sphäroide könnte helfen, ihre Wirksamkeit mehr kritisch zu beurteilen und verhindern, dass einige der Designs bewegt, in vivo Studien vorzeitig10; so, zur ethisch betreffenden Forschung durch weniger Tiere zu opfern. Darüber hinaus sind Protokolle mit Sphäroide nicht teurer als klassische 2D Systeme und viel schneller im Vergleich zu klassischen in Vivo Studien. Zusammen genommen, kann man voraussagen, dass die Einbeziehung der Sphäroid Studien gängige Praxis bald, in vitro und in vivo Studien zu verknüpfen.
Hier präsentieren wir Ihnen die Vorbereitung der Sphäroide aus der Dickdarm-Krebs-Zell-Linie HCT-116. Diese Zelllinie wurde geändert, um das menschliche CD19-Molekül empfindlich gegen CD19 Auto T-Zellen zu rendern und eine klare Einschätzung der Tötung mit einer klinisch validierte Auto-Konstrukt zum Ausdruck bringen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D8537-500ML</td><<td>strong>Chargennummer: RNBG7037</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; Wachstumsbereicherkolben</td><td>VWR</td><td>430639</td><td>Chargennummer: 2218002</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; Wachstumsbereichskolben</td><td>VWR</td><td>734-2705</td><td>Chargennummer: 3718006</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>SIGM-ALDRICH</td><td>T3924-100ml</td><td>Chargennummer: SLBTO777</td></tr><tr><td>RPMI 1640 med L-Glutamin, 10 x 500 mL</td><td>Life Technology (Gibco)</td><td>21875-091</td><td>Chargennummer: 1926384</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td>Chargennummer: 08Q3066K</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fischer</td><td>15750060</td><td>Chargennummer: 1904924A</td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4</td>%<td>Thermo Fischer</td><td>15250061</td><td>Losnummer: 1886513</td></tr><tr><td>96-Well-Platte, runder Boden, VWR</td><td></td><td>734-1797</td><td>Losnummer: 33117036</td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Thermo Fischer</td><td>11132D-X-VIVO</td><td></td></tr> <tr><td>15 mit Gentamicin L-Gln, Phenolrot, 1 L</td><td>BioNordika</td><td>BE02-060Q</td><td>Chargennummer: 8MB036</td></tr><tr><td>CTS Immunzellserumersatz</td><td>Thermo Fischer</td><td>A2596102</td><td>Chargennummer: 1939319</td></tr><tr><td>IL-2 Proleukin</td><td>Novartis</td><td></td><td>Chargennummer: 505938M</td></tr><tr><td>IncuCyte Annexin V Rotes Reagenz</td><td>Essen Bioscience</td><td>4641</td><td>Chargennummer: 17A1025-122117</td></tr><tr><td>Reagenzreservoir</td><td>VWR</td><td>89094-672</td><td>Losnummer: 89094-672</td></tr><tr><td>15-ml-Röhrchen</td><td>VWR</td><td>734-1867</td><td>Losnummer: 19317044</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD19-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555413</td><td>Losnummer: 4016990 RRID: AB_395813</td></tr><tr><td>Biotin-SP (langer Spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Ziege Anti-Maus IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-066-072</td><td>Chargennummer: 129474: RRID: AB_2338583</td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>Chargennummer: 5191579: RRID: </stark> AB_10053328</td></tr><tr><td>HCT 116 Kolorektale Karzinomlinie</td><td>ATCC</td><td>CCL-247-Incucyte</td><td></td></tr> <tr><td>S3</td><td>Essen Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein sphäroid tötung assay von auto-t-zellen

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immuntherapie hat ein wachsendes Interesse an den Kampf gegen den Krebs sonst unbehandelbaren entwickelt. Unter allen immuntherapeutischen Methoden umgeleitet chimeric Antigen-Rezeptor (Auto) T-Zellen die spektakulärsten Ergebnisse, insbesondere mit pädiatrischen B-akute lymphoblastische Leukämie (B-ALL). Klassische Validierungsmethoden Auto T-Zellen verlassen sich auf die Verwendung von Spezifität und Funktionalität Assays der Auto-T-Zellen gegen die Ziel-Zellen in Suspension und Xenograft-Modelle. Leider, in-vitro-Beobachtungen sind oft Ergebnisse in Vivo entkoppelt und einiges an Aufwand und Tiere könnte erspart werden, indem man einen weiteren Schritt: die Verwendung von 3D Culture. Die Produktion der Sphäroide aus potenziellen Zielzellen, die 3D-Struktur der Tumorzellen zu imitieren, wenn sie in das Tiermodell aufgeprägt sind stellt eine ideale Alternative dar. Hier berichten wir über eine erschwingliche, zuverlässige und einfache Methode, um Sphäroide aus einem ausgestrahlt kolorektalen Zelllinie als ein Validierungstool für Adoptiv-Therapie (hier am Beispiel CD19 Auto T-Zellen) produzieren. Diese Methode ist gekoppelt mit eine erweiterte live-imaging-System, das Sphäroid Wachstum verfolgen kann, Effektor Zellen Zytotoxizität und Tumor Zellapoptose.

Wie in Abbildung 1ersichtlich ist, ist es durch Durchflusszytometrie Ausdruck von CD19 Auto auf T-Zellen (Abbildung 1A) und das Niveau der CD19 auf Tumorzelllinien HCT116 (Abbildung 1 b) zu überprüfen, das entscheidend. Abbildung 2 veranschaulicht das Ergebnis einer typischen Sphäroid-Experiments. Das automatisierte bildgebenden Gerät nimmt Bilder in vier verschiedene Ka...

Dieses Protokoll dient zur Immuntherapie umgeleiteten T-Zellen (Auto T-Zelle) Zytotoxizität gegen 3D strukturierte Krebszellen (Sphäroide) in Echtzeit zu bewerten.

Ein Sphäroid Tötung Assay von Auto-T-Zellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Immuntherapie über die Beurteilung der Immunzellzytotoxizität gegen 3D-Strukturtumorzellen zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Methode sind, dass sie einfach ist und fortschrittliche Bildgebungstechnologie und einen empfindlichen immunologischen Test kombiniert. Beginnen Sie mit dem Waschen der darmen Krebszelllinie von Interesse mit fünf Milliliter PBS und entfernen Sie die Zellen aus dem Kolbenboden mit 0,5 Milliliter Trypsin für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.Nach der Bestätigung der Ablösung unter dem Mikroskop neutralisieren Sie das Zelldissoziationsenzym mit 10 Millilitern des kompletten Mediums und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter frisches komplettes Medium für das Zählen aus und setzen Sie die Zellen bei einer 1,5-mal 10-bis-dritten Zelle pro Milliliter-Konzentration wieder aus. Dann säen Sie 200 Mikroliter Zellen in jeden Brunnen der 96-well runden Bodenplatte und legen Sie die Platte in einem automatisierten Bildgebungsgerät in einem 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit.Melden Sie sich bei der Erfassungssoftware des Geräts an und wählen Sie Schedule to Acquire, Launch Add Vessel, Scan on Schedule und Create Vessel New aus. Wählen Sie als Nächstes den Scantyp Spheroid aus und wählen Sie die entsprechenden Hellenfeld- und Fluoreszenzkanäle aus. Stellen Sie die Vergrößerung auf das 10-fache ein und wählen Sie das Plattenmodell und seine Position in der Schublade des Bildgeräts aus.Wählen Sie die Position der zu bebildernden Bohrungen aus, und geben Sie die Beschreibung des Experiments ein, einschließlich name, Zelltyp und Anzahl der Zellen. Wählen Sie für die Analyseeinrichtung die Option Analyse bis später verzögern aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zeitachse, und wählen Sie Ausgewähltes Scangruppenintervall festlegen aus, und legen Sie Scans alle bis vier Stunden und insgesamt bis 24 Stunden hinzu. Stellen Sie dann die Startzeit mindestens eine Stunde nach der Inkubation im automatisierten Bildgebungsgerät ein.Um den Sphäroid-Wachstumsfortschritt zu überprüfen, melden Sie sich alle zwei Tage bei der Bildverarbeitungssoftware an und wählen Sie Aktuelle Scans anzeigen aus. Doppelklicken Sie auf das Experiment von Interesse und wählen Sie Brightfield im Bildkanal-Bedienfeld aus. Verwenden Sie dann das Werkzeug Bild-Features messen, um den Durchmesser der Sphäroide zu messen, und fügen Sie 50 Mikroliter des gesamten Mediums pro Brunnen an Tag vier hinzu, um alle mittleren Verdunstungseffekte zu begrenzen.Wenn die Sphäroide die entsprechende experimentelle Größe erreichen, winkeln Sie die Platte sorgfältig an und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 150 Mikroliter komplettes Medium aus jedem Brunnen sanft zu entfernen, ohne die Sphäroide zu stören. Als nächstes ersetzen Sie das ausrangierte Medium durch 50 Mikroliter einer einbis 200 Lösung von Annexin V Red und legen Sie die Platte für 15 Minuten in einen Zellkultur-Inkubator. Zentrifuge transduzierte CAR CD19 T-Zellen in einem 15 Milliliter konischen Rohr und setzen das Pellet in zwei Millilitern des kompletten Mediums wieder auf.Nach dem Zählen die Zellen auf zwei mal 10 bis fünf Liter pro Milliliter vollständiger mittlerer Konzentration verdünnen. Dann fügen Sie 100 Mikroliter CAR CD19 T-Zellen zu jedem sphäroidhaltigen Brunnen hinzu und geben Sie die Platte an das automatisierte Bildgebungsgerät zurück. Wählen Sie in der Erfassungssoftware "Zu erwerben planen" aus, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Scan-Timeline.Wählen Sie Zeitleiste bearbeiten aus, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Scangruppe, um sie zu löschen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste erneut auf die Zeitleiste und wählen Sie Ausgewähltes Scangruppenintervall festlegen aus und legen Sie Scans alle auf 1 1/2 Stunden und für insgesamt bis zu 24 Stunden fest. Stellen Sie dann die Bildstartzeit auf mindestens eine Stunde nach Beginn der Inkubation im automatisierten Bildverarbeitungsgerät ein und wählen Sie Schedule Scans speichern aus.Für die automatisierte Bildanalyse wählen Sie in der Scansoftware Aktuelle Scans anzeigen und Analyse starten aus. Wählen Sie Neue Analysedefinition und Analysetyp Spheroid erstellen aus, und legen Sie die zu analysierenden Bildkanäle fest. Wählen Sie mindestens 10 repräsentative Bilder aus, und zeigen Sie eine Vorschau des standardmäßigen Analyseverfahrens für den gesamten Bildstapel an.Ändern Sie die Parameter für die Hellfeldmaske, und zeigen Sie eine Vorschau des Bildstapels an, um zu bestätigen, dass die ausgewählten Parameter die Sphäroide genau erkennen. Ändern Sie die Parameter für die grüne Maske, und zeigen Sie eine Vorschau des Bildstapels an, um zu bestätigen, dass die ausgewählten Parameter die Sphäroide genau erkennen. Ändern Sie die Parameter für die rote Maske, und zeigen Sie eine Vorschau des Bildstapels an, um zu bestätigen, dass die ausgewählten Parameter die Sphäroide genau erkennen.Achten Sie darauf, das beste Signal über Rauschen und Empfindlichkeit über Spezifitätsverhältnisse zu erreichen, wobei Sie bedenken, dass Sie nicht in der Lage sein werden, eine Reihe von Parametern zu finden, die es ermöglichen, jedes Ereignis zu jedem Zeitpunkt zu erfassen. Starten Sie dann den Analyzer. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, extrahieren Sie die Messung des Interesses, und wählen Sie die analysierte Datei und die Option Diagrammmetriken aus.Wählen Sie die gewünschten Metriken, den Scan und den Brunnen aus. Klicken Sie auf Daten exportieren, um die ausgewählten Metriken in verschiedenen Dateiformaten zu extrahieren. Um die Bilder zu extrahieren, wählen Sie dann die analysierte Datei aus und wählen Sie Bilder und Filme exportieren aus.CD19 CAR-Expression auf transduzierten T-Zellen und CD19-Expression auf transduzierten Darmkrebszellen können durch Durchflusszytometrie bestätigt werden. Hier kann das Ergebnis eines typischen Sphäroidexperiments beobachtet werden. Im Gegensatz zu Mock-T-Zellen sind CD19 CAR T-Zellen in der Lage, die von Darmkrebszellabgeleiteten Sphäroide gezielt abzutöten, was die Anzahl der lebenden Tumorzellen stark verringert.Die Verfolgung der Entwicklung der gesamten grünen und roten Signale innerhalb der Sphäroidgrenzen im Laufe der Zeit zeigt, dass kurz nach cd19 CAR T Zellinjektion, die Größe der Sphäroide schrumpft schnell, wie die Apoptose-Signal schnell erhöht. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Toxizitätstests, Zellmigrationstests oder Sphäroidstrukturmessungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum Arzneimittelscreening, zur T-Zell-Motilität bzw. zur Sphäroidbildung zu beantworten.

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Sphäroide sind eine Art von 3D-Zellkulturmodell, das verwendet wird, um die Umgebung einer Zelle im Vergleich zu 2D-Zellkultur-Monolayer-Modellen genauer darzustellen. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie Wissenschaftler Sphäroide aus einer Darmkrebszelllinie erzeugen und Lebendzell-Imaging anwenden, um das Wachstum der Sphäroide zu verfolgen.

Sphäroiderzeugung aus Zelllinien: Eine dreidimensionale (3D) Zellkulturmethode

In diesem Video demonstrieren wir den repetitiven Tumor-Challenge-Assay, um das repetitive Tumorabtötungspotenzial der CAR-T-Zellen bei hohen Tumorzelllasten zu bewerten. Darüber hinaus können die CAR-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert werden, um die verschiedenen Subpopulationen von CAR-T-Zellen in der Probe zu bestimmen.

Repetitiver Tumor-Challenge-Assay: Ein In-vitro-Kultur-Assay zur Bewertung von chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen auf das Potenzial zur wiederholten Tumorabtötung

Dieses Video zeigt eine Methode zur Überwachung der Aktivität von CAR-T-Zellen gegen Krebszellen durch elektrische Impedanzmessungen in Echtzeit. Die Verfolgung von Impedanzänderungen bewertet die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen bei der Induktion der Zytolyse von Krebszellen und gibt Einblicke in ihre zytotoxischen Fähigkeiten.

Ein Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von CAR-T-Zellen

Dieses Video zeigt einen in vitro Assay, der die zytotoxischen Wirkungen von CAR-T-Zellen auf 3D-Tumorsphäroide untersucht, die fluoreszierende Proteine exprimieren. Bei dieser Bewertung wird die rote Fluoreszenzsonde Annexin V verwendet, die nach Wechselwirkungen mit CAR-T-Zellen an exponierte Phosphatidylserinreste auf der äußeren Falte apoptotischer Krebszellen bindet. Die von der Sonde emittierte rote Fluoreszenz hilft dabei, diese Zellen von gesunden Zellen zu unterscheiden, die grüne...

Ein In-vitro-Assay zur Beurteilung der Zytotoxizität von CAR-T-Zellen gegen Tumorsphäroide

Dieses Video zeigt einen in vitro Assay zur Validierung der T-Zellaktivität von chimären Antigenrezeptoren (CAR). B-Zell-Lymphomzellen, die das CD19-Antigen und die zytoplasmatische Luciferase exprimieren, werden mit CD19-spezifischen CAR-T-Zellen kokultiviert. Die Bindung von CAR an CD19 auf einem Tumor veranlasst die CAR-T-Zellen, Zytokine und Toxine freizusetzen, die eine Zytotoxizität der Tumorzellen verursachen. Die Aktivität der CAR-T-Zellen wird durch Quantifizierung des freigesetzten...

Ein in vitro Assay zur Bewertung der Anti-Tumor-Aktivität von tumorspezifischen CAR-T-Zellen

Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Wir beschreiben die Evolution ein Sphäroid-basierte, dreidimensionales in Vitro -Modell, das uns ermöglicht, den aktuellen Stand der experimentellen Therapie-Schemata für Kopf und Nacken Squamous Zelle Krebsgeschwür auf Zelllinien, testen, zur Bewertung der Therapie Empfänglichkeit und Resistenz auf primäre Zellen aus menschlichen Proben in der Zukunft.

Therapie, die Tests in einem Sphäroid-basierten 3D Kultur Zellmodell für Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür

Wir beschreiben ein quantitatives Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay-System zur Bewertung der Wirksamkeit von chimeric antigenen Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf flüssige und solide Tumorzellen abzielen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um andere Immuneffektorzellen sowie Kombinationsbehandlungen zu bewerten.

Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Identifizierung von Verbindungen vor, die den ADCC-Mechanismus, einen wichtigen Krebszell-Abtötungsmechanismus von Antitumor-Antikörpern, modulieren. Die zytotoxische Wirkung von NK-Zellen wird in Brustkrebszell-Sphäroiden in Gegenwart von Trastuzumab gemessen. Die Bildanalyse identifiziert lebende und tote Killer- und Zielzellen in Sphäroide.

Quantifizierung der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität in einem Tumor-Sphäroid-Modell: Anwendung für die Wirkstoffforschung

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Doppelemulsionströpfchen, die eine T-Zelle und eine Krebszielzelle verkapseln, um die Zellabtötung auf Einzelzellebene zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die duale Quantifizierung sowohl zytotoxischer Moleküle als auch der Apoptose der Zielzellen innerhalb einer großen Population von T-Zellen.

Tröpfchenbasierter Zytotoxizitätsassay zur Beurteilung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf Einzelzellebene

Lernen Sie ein Sphäroid-Tötungs-Assay mit CAR-T-Zellen zur Bewertung der Zytotoxizität gegen 3D-Tumorzellen in Echtzeit. Diese Methode kombiniert fortschrittliche Bildgebung mit immunologischen Assays.

Ein Sphäroid Tötung Assay von Auto-T-Zellen

Weitere Videos entdecken