Name: Prüfung für anorganisches Polyphosphat in Bakterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Methode zur Quantifizierung von anorganischem Polyphosphat in Bakterien. Diese kostengünstige Technik ermöglicht Forschern die Untersuchung von Stressantworten in verschiedenen Bakterienarten.

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Dieses Projekt wurde von der University of Alabama bei Birmingham Institut für Mikrobiologie Start Fonds und NIH Grant R35GM124590 (MJG) und NIH Grant R01AI121364 (FW) unterstützt.

1. reinigen Hefe Exopolyphosphatase (ScPPX)
<ol><li>Die E. Coli Protein Überexpression Belastung BL21(DE3)31 mit Plasmid pScPPX26 durch Elektroporation32 oder chemische Umwandlung33zu verwandeln.</li>
	<li>1 L Lysogeny Brühe (LB), enthält 100 µg mL-1 Ampicillin in einem 2 L unbaffled Kolben mit einer einzigen Kolonie von BL21(DE3) mit pScPPX2 zu impfen und Inkubation über Nacht bei 37 ° C ohne schütteln, bis eine Extinktion bei 600 nm (ein600) von ca. 0,3, wie in einem Spektralphotometer gemessen.</li>
	<li>Starten Sie die Kultur schütteln (180 u/min) und inkubieren Sie für 30 min bei 37 ° C, während welcher Zeit die Zellen, ein A-600 von 0,4 wachsen - 0,5.</li>
	<li>Eine Endkonzentration von 1 mM und eine zusätzliche 100 µg mL-1 Ampicillin Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) hinzufügen, und klicken Sie dann 4 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 180 u/min inkubieren. Hinweis: Dieses Protokoll Überexpression erzeugt eine große Menge an löslichen ScPPX. Jedoch ScPPX Überexpression ist sehr nachsichtig und eine Vielzahl von anderen gängigen Protein Überexpression Protokolle wurden verwendet, um ScPPX erfolgreich zu reinigen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen auf eine Zentrifuge Flasche 1 L und Ernte sie durch Zentrifugieren für 20 min bei 5000 X g bei 4 ° C. Entfernen des Überstands und die Zelle Pellet auf eine 50 mL konische Rohr übertragen. Hinweis: Zelle Pellets können auf unbestimmte Zeit bei-80 ° c gelagert werden</li>
	<li>Das Pellet auf Eis auftauen, dann in 9 mL 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl und 5 mM Imidazol (pH 8) für ein Gesamtvolumen von ca. 10 mL aufzuwirbeln.</li>
	<li>(Endkonzentrationen) 1 mg mL-1 Lysozym, 2 mM MgCl2und 50 Einheiten mL-1 eine RNA und DNA erniedrigender Endonuklease hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie für 30 min auf Eis. Hinweis: ScPPX bindet Nukleinsäuren (Daten nicht gezeigt), so Nuklease Behandlung während der Reinigung unerlässlich ist.</li>
	<li>Mit einem Sonikator mit einem Microtip (siehe Tabelle der Materialien), lösen Sie die Zellen von 2 Zyklen der Beschallung auf Eis bei 50 % Leistung, pulsieren 5 s ein und 5 s, mit einer 2 min Pause zwischen den Zyklen. Hinweis: Verwenden Sie geeigneten Gehörschutz während der Beschallung. In ähnlicher Weise auf den Fall mit Überexpression, eine Vielzahl von Zelle Lysis Methoden sind für ScPPX Reinigung zulässig.</li>
	<li>Entfernen Sie die unlöslichen Ablagerungen durch Zentrifugieren lysate für 20 min bei 20.000 x g bei 4 ° c Filtern Sie den daraus resultierende Überstand (ca. 10 mL) durch einen 0,8 µm Pore Größe Celluloseacetat Spritze Filter.</li>
	<li>Laden der lysate auf eine Nickel-geladene 5 mL chelatisierenden Spalte (siehe Tabelle der Materialien) mit einer peristaltischen Pumpe oder eine große Spritze.</li>
	<li>Spülen Sie die Spalte mit 50 mL 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl 5 mM Imidazol (pH 8).</li>
	<li>Spülen Sie die Spalte mit 50 mL 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 20 mM Imidazol (pH 8).</li>
	<li>Eluieren Sie ScPPX mit 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl und 0,5 M Imidazol (pH 8), sammeln von 15 1-mL-Fraktionen. Testen Sie diese Elution Fraktionen für Eiweißgehalt mit Bradford Protein Assay34 (siehe Tabelle der Materialien), und führen Sie eine SDS-PAGE Gel35 um zu bestätigen, welche Fraktionen gereinigten ScPPX enthalten (Molekulargewicht = 45 kDa).</li>
	<li>Bündeln Sie die Fraktionen mit reinen ScPPX zu und passen Sie die Konzentration der gepoolten Protein zu ca. 2 mg mL-1 mit 50 mM HEPES und 0,5 M NaCl. Im nächsten Schritt können höhere Proteinkonzentrationen auszufällen.</li>
	<li>Tauschen Sie die gereinigten ScPPX in Speicher-Puffer (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM KCl, 10 % [V/V] Glycerin) durch Dialyse. Zusammengefasste ScPPX Brüche in einer versiegelten Länge von 12.000-14.000 Da Molekulargewicht cutoff Dialyse Membran Schlauch (siehe Tabelle der Materialien) und aussetzen in 1 L Puffer speichern unter ständigen Rühren bei 4 ° C für mindestens 4 Std. Wiederholen Sie diesen Schritt mit frischen Puffer für eine Gesamtmenge von 3 Puffer Änderungen speichern.</li>
	<li>Übertragen Sie das gereinigte, dialysierten Protein ein Zentrifugenröhrchen oder Röhren und Zentrifuge für 20 min bei 20.000 x g bei 4 ° C, unlösliche Aggregate zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand sorgfältig auf eine saubere 15 mL konische Rohr.</li>
	<li>Passen Sie die Konzentration des gereinigten ScPPX auf 1 mg mL-1 mit Puffer speichern, fügen Sie 0,1 % (w/V) Protease-freie Rinderserumalbumin (BSA; Endkonzentration) und Speicher für bis zu 6 Monate bei 4 ° C. Hinweis: ScPPX verliert mehr als 90 % seiner Tätigkeit, wenn es gefroren13ist.</li>
</ol>(2) Ernte Proben für Polyphosphat Extraktion
<ol><li>Wachsen Sie Bakterien unter den Bedingungen von Interesse für die Bestimmung der PolyP Inhalt. Wachsen Sie für dieses Protokoll Lactobacillus Reuteri36 über Nacht bei 37 ° C ohne schütteln Apfelsäure Enzym Induktion (MEI) mittlere37 ohne Cystein (MEI-C).</li>
	<li>Sammle genügend Zellen durch Zentrifugation in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auf 50 – 100 µg des zellulären Proteins (siehe Schritt 3 unten). Dies ist für E. Coli, 1 mL einer Log-Phase-Kultur auf eine A-600 von 0,2 - 0,4. Das ist für L. Reuteri1 mL einer Übernacht-Kultur. Passen Sie ggf. für andere Arten von Interesse.</li>
	<li>Vollständig zu entfernen den Überstand von der Zelle Pellets.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie der Zelle Pellets in 250 µL GITC Lyse Puffer (4 M Guanidin erfolgt, 50 mM Tris-HCl, pH 7) und lösen Sie durch Inkubation bei 95 ° C für 10 min. Store Lysates bei-80 ° C. Hinweis: Seien Sie konsequent mit der Lyse Zeit, da längere Inkubation bei hoher Temperatur zur Verschlechterung der PolyP durch Hydrolyse38führen kann. Lysates können auf unbestimmte Zeit bei-80 ° c gelagert werden Achtung: Guanidin-Herstellung ist ein chaotropen Salz sollte mit Handschuhen behandelt und als Sondermüll entsorgt.</li>
</ol>3. Messung des Eiweißgehalts der Zelle Lysates
<ol><li>Bereiten Sie BSA-Normen mit 0, 0,1, 0,2 und 0,4 mg mL-1 der BSA in GITC Lyse Puffer vor. Hinweis: Es ist wichtig die BSA Standards GITC, da GITC die Farbentwicklung der Bradford-Test beeinflusst machen. BSA Standards können auf unbestimmte Zeit bei-20 ° c gelagert werden</li>
	<li>Aliquoten 5 µL der aufgetauten, gut gemischte Zelle Lysates und BSA Standards, Brunnen in einer klaren 96-Well-Platte zu trennen.</li>
	<li>Fügen Sie 195 µL Bradford-Reagenz-34 in jede Vertiefung und Messung der Extinktion bei 595 nm (eine595) in einem Teller-Reader (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Berechnen Sie die Menge an Protein in jede Vertiefung im Vergleich zur BSA standard Kurve, mit der Formel y = Mx + b, wo y ist eine595, X µg von BSA, m ist die Steigung der Standardkurve, und b ist der y-Achsenabschnitt der Standardkurve. Multiplizieren Sie den resultierenden Wert mit 0,05 bis die Gesamt mg Protein in jeder Probe zu bestimmen.</li>
</ol>4. extrahieren Polyphosphat
<ol><li>Fügen Sie 250 µL von 95 % Ethanol zu jeder Probe GITC lysiert und Vortex mischen.</li>
	<li>Gelten diese Mischung für eine Kieselsäure Membran Spin Spalte und Zentrifuge für 30 s bei 16.100 x g.</li>
	<li>Die Flow-through zu verwerfen, dann fügen Sie 750 µL 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 % Ethanol und Zentrifuge für 30 s bei 16.100 x g.</li>
	<li>Entsorgen Sie durchströmten und Zentrifuge für 2 min bei 16.100 x g.</li>
	<li>Die Spalte in einem sauberen 1,5 mL Microfuge Rohr geben Sie und 150 µL 50 mM Tris-HCl (pH 8).</li>
	<li>In 5 min bei Raumtemperatur inkubieren Sie, dann eluieren Sie PolyP durch für 2 min bei 8.000 x g zentrifugieren. Hinweis: Falls gewünscht, können die Eluate bei-20 ° C für mindestens 1 Woche gespeichert werden.</li>
</ol>(5) verdauen Polyphosphat
<ol><li>Bereiten Sie Normen mit 0, 5, 50 oder 200 µM Kalium Phosphat in 50 mM Tris-HCl (pH 8 vor). Hinweis: Kalium-Phosphat-Standards können auf unbestimmte Zeit bei Raumtemperatur gelagert werden.</li>
	<li>Aliquoten 100 µL der einzelnen Phosphat standard und extrahiert PolyP Proben in separaten Vertiefungen einer klaren 96-Well-Platte.</li>
	<li>Bereiten Sie eine master-Mix mit (pro Probe): 30 µL 5 X ScPPX Reaktion Puffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 250 mM Ammoniumacetat, pH 7,5)13, 19 µL H2O und 1 µL des gereinigten ScPPX (1 mg mL-1).</li>
	<li>Geben Sie 50 µL der master-Mix in jedes der 96-Well-Platte. 15 min bei 37 ° c inkubieren Hinweis: Falls gewünscht, können die verdaute PolyP Proben bei-20 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.</li>
</ol>6. Nachweis von freien Phosphat24
<ol><li>Bereiten Sie Erkennung Lösung Basis durch Auflösen von 0,185 g Antimon-Kalium-Tartrat in 200 mL Wasser, 150 mL 4 N H2SO4, dann Zugabe von 1,49 g Ammonium Heptamolybdate. Rühren Sie auflösen und dann zu einem Endvolumen von 456 mL bringen. Filtern Sie die Lösung, um Partikel zu entfernen und zu speichern, lichtgeschützt bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Stammlösung 1 M Ascorbinsäure. Speicher für bis zu 1 Monat lichtgeschützt bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie einen frischen arbeiten bestand von Angriffsermittlungslösung jeden Tag durch das Mischen von 9,12 mL Angriffsermittlungslösung Basis mit 0,88 mL 1 M Ascorbinsäure. Lassen Sie die Erkennung Lösung vor Gebrauch auf Raumtemperatur kommen.</li>
	<li>Jede Probe und Standard in der 96-Well-Platte 50 µL Detection-Lösung hinzu und Inkubation bei Raumtemperatur für ca. 2 min zur Farbentwicklung zu ermöglichen.</li>
	<li>Messung der Extinktion bei 882 nm mit einem Teller-Lesegerät und berechnen die Phosphat-Konzentration von jeder Probe im Vergleich zu der Kalium-Phosphat-Standardkurve. Achtung: Die Erkennung-Lösung enthält giftige Salze und starken Säuren. Tragen Sie Handschuhe und behandeln Sie überschüssige Lösung als Sondermüll zu.</li>
</ol>7. Berechnung der zellulären Polyphosphat Inhalt
<ol><li>Konvertieren Sie die Phosphat-Konzentrationen in Schritt 6.5 Nanomoles PolyP abgeleitet Phosphat in jeder ganze Zelle lysate nach folgender Formel ermittelt: Nmol Polypen = 1,5 X (µM Phosphat / 10) Hinweis: Die standard-Kurve-basierte Methode in Schritt 6 bestimmt die Konzentration von Phosphat (in µM) in jeder 100 µL PolyP Probe regelmÄÑig im Schritt 5.2. Um diese Konzentration auf eine Reihe von Nmol konvertieren, 100 µL ist geteilt durch 106 um ein Volumen in L, multipliziert mit der Konzentration (µmol L-1), dann multipliziert mit 1.000 (die Anzahl der Nmol in einem µmol). Dies reduziert die Konzentration durch 10 dividiert. Das Gesamt-Extrakt Volumen vorbereitet in Schritt 4 ist 150 µL so 1,5 Nmol von Phosphat in den gesamten Extrakt vorhanden berechnen den resultierenden Wert multipliziert werden muß.</li>
	<li>Normalisieren Sie zellulären PolyP Inhalt zu zellulären Gesamtprotein geteilt Nmol PolyP durch mg Gesamt-Protein in jeder Probe in Schritt 3.4 bestimmt. PolyP Ebenen sind durch die Konzentration der einzelnen Polypen abgeleitet freie Phosphat ausgedrückt. Hinweis: In einigen Fällen kann die Menge der PolyP abgeleitet Phosphat in einer Probe vorhanden außerhalb des linearen Bereichs der Standardkurve Phosphat (Schritt 6.5) fallen. Wenn die Polypen sehr hoch sind, kann das überschüssige PolyP-haltigen Eluat aus Schritt 4.6 verdünnter 01:10 oder 1: 100, bei Bedarf und dann wieder wie in den Schritten 5 bis 7 beschrieben gemessen.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das hier beschriebene Protokoll vereinfacht und beschleunigt die Quantifizierung der PolyP Ebenen in unterschiedlichen Bakterien mit einem typischen Satz von 24 Proben nehmen ca. 1,5 h vollständig verarbeiten. Dies ermöglicht eine schnelle Screening von Proben und Analyse der mutierten Bibliotheken und vereinfacht kinetische Experimente, die die Ansammlung von Polypen im Laufe der Zeit zu messen. Wir haben bewiesen, dass das Protokoll effektiv auf Vertreter der drei verschiedene Stämme funktioniert: Proteobakterien, Firm...

Anorganisches Polyphosphat (Polypen) ist eine lineare Biopolymer Phosphoanhydride verknüpft Phosphat-Einheiten, die in allen Bereichen des Lebens1,2,3gefunden wird. In verschiedenen Bakterien ist PolyP essentiell für Stress-Reaktion, Beweglichkeit, Biofilmbildung, Zellzyklus-Kontrolle, Antibiotika-Resistenz und Virulenz4,5,6,7,8 ,9,10,11. Studien der PolyP Stoffwechsel in Bakterien haben daher das Potenzial, grundlegende Einblicke in die Fähigkeit der Bakterien verursachen Krankheiten und gedeihen in unterschiedlichen Umgebungen. In vielen Fällen sind jedoch die verfügbaren Methoden zur Quantifizierung PolyP in Bakterienzellen ein limitierender Faktor in diesen Studien.
Es gibt mehrere Methoden, die derzeit zur Messung der PolyP Ebenen in biologischem Material. Diese Methoden beinhalten in der Regel zwei verschiedene Schritte: Extrahieren von Polypen und Quantifizierung der PolyP präsentieren in diesen Extrakten. Die aktuelle Gold-Standard-Methode, entwickelt für die Hefe Saccharomyces Cerevisiae von Bru und Kollegen12, Extrakte Polypen zusammen mit DNA und RNA mit Phenol und Chloroform, gefolgt von Ethanol Niederschlag, Behandlung mit Deoxyribonuclease (DNase) und Ribonuklease (RNase) und Verdauung der daraus resultierenden gereinigten Polypen mit S. Cerevisiae PolyP-abbauenden Enzyms Exopolyphosphatase (ScPPX)13 bis freie Phosphat, nachgeben, die dann quantifiziert wird mit einem Malachit Grün-basierte kolorimetrischen Probe. Dieses Verfahren ist sehr quantitative aber arbeitsintensiv, Begrenzung der Anzahl der Proben, die in einem einzigen Experiment verarbeitet werden können, und ist nicht optimiert für bakterielle Proben. Andere haben berichtet, Extrahieren von PolyP aus einer Vielzahl von Zellen und Geweben mit Kieselsäure Perlen ("Glassmilk") oder Kieselsäure Membran Spalten6,14,15,16,17, 18. Diese Methoden extrahieren nicht effizient kurzkettigen PolyP (weniger als 60 Phosphat Einheiten)12,14,15, zwar von weniger Belang für Bakterien, die in der Regel gedacht werden, um in erster Linie zu synthetisieren ist langkettige PolyP3. Ältere Methoden der PolyP Extraktion mit starken Säuren19,20 sind nicht mehr weit verbreitet, da Polypen unter sauren Bedingungen12instabil ist.
Es gibt auch eine Vielzahl von gemeldeten Methoden zur Quantifizierung PolyP. Zu den häufigsten ist 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), ein Fluoreszenzfarbstoff mehr normalerweise verwendet, um DNA zu beflecken. DAPI-PolyP komplexe haben unterschiedliche Fluoreszenz Emission und Erregung Maxima als DAPI-DNA-komplexen21,22, aber es gibt erheblichen Störungen von anderen zellulären Komponenten, einschließlich RNA, Nukleotide und Inosit Phosphate12,15,16,23, Verringerung der Spezifität und Sensitivität der PolyP Messungen mit dieser Methode. Alternativ können Polypen und Adenosin-diphosphat (ADP) in Adenosintriphosphat (ATP) mit gereinigtem Escherichia coli umgewandelt werden Polypen Kinase (PPK) und die daraus resultierende ATP quantifiziert mit Luciferase14,17 ,18. Dies erlaubt den Nachweis sehr kleiner Mengen von Polypen, aber erfordert zwei enzymatische Reaktionsschritte und sowohl Luciferin und sehr reine ADP, die teure Reagenzien sind. ScPPX, die speziell Übersichten PolyP in freie Phosphat6,12,13,24, die mit einfacheren Methoden, aber ScPPX erkannt werden kann durch DNA und RNA12gehemmt wird, Meißel-DNase und RNase-Behandlung von Polypen-haltigen Extrakten. Weder die PPK als auch die ScPPX sind im Handel erhältlich, und PPK Reinigung ist relativ komplex25,26.
PolyP in Zelle Lysates oder Extrakte kann auch visualisiert werden auf Polyacrylamid-Gele von DAPI negative Färbung27,28,29,30, eine Methode, die erlaubt die Beurteilung der Kettenlänge, sondern ist niedrig-Durchsatz und schlecht quantitative.
Wir berichten nun einen schnell, preiswert, Medium-Durchsatz PolyP-Assay, der schnelle Quantifizierung der PolyP Ebenen in unterschiedlichen Bakterienarten ermöglicht. Diese Methode beginnt mit der Lyse der Bakterienzellen bei 95 ° C in 4 M Guanidin erfolgt (GITC)14 um zelluläre Phosphatasen, gefolgt von einer Kieselsäure Membran Spalte Extraktion optimiert für schnelle Bearbeitung mehrerer Proben zu inaktivieren. Der daraus resultierende PolyP-haltiger Extrakt wird dann mit einem großen Überschuss von ScPPX, wodurch die Notwendigkeit für DNase und RNase-Behandlung verdaut. Wir sind ein Protokoll für einfache Nickel Affinitätsreinigung mg-Mengen von ScPPX. PolyP abgeleitet frei Phosphat ist schließlich mit einem einfach, sensible, Ascorbinsäure-basierte kolorimetrischen Probe24 quantifiziert und normiert auf zelluläre Gesamtprotein. Diese Methode vereinfacht die Messung der PolyP in Bakterienzellen, und wir zeigen seine Verwendung mit repräsentativer Arten von Gram-negativen Bakterien, grampositive Bakterien und Mykobakterien.

<table><tbody><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Millipore Sigma</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid pScPPX2</td><td>Addgene</td><td>112877</td><td>verfügbar für akademische und andere gemeinnützige Einrichtungen</td></tr><tr><td>LB Bouillon Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP1427-2</td><td>E. coli Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176025</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>I2481C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Puffer</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>H-400-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid (KOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250500</td><td>zur Einstellung des pH-Werts von HEPES-gepufferten Lösungen</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S27110</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196500</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6070106</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Universal Nuclease</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI88700</td><td>Benzonase (Sigma-Aldrich Kat. # E1014) ist ein akzeptabler Ersatz</td></tr> Modell <tr><td>120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-120</td>, <td>andere Zelllysemethoden (z. B. French Press) können ebenfalls wirksam sein</td></tr>: <tr><td>5 mL HiTrap Chelat-HP-Säule</td>, <td>GE Life Sciences</td><td>17040901</td><td>jede Nickel-Affinitätschromatographie-Säule oder jedes Harz könnte substituiert werden</td></tr><tr><td>Nickel(II)-sulfat-Hexahydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC415611000</td><td>zum Aufladen HiTrap-Säule</td></tr><tr><td>0,8 &; Mikro; m Porengröße Celluloseacetat Spritzenvorsatzfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-302-168</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagenz</td><td>Bio-Rad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Tris Puffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1525</td><td></td></tr><tr><td>Spektrum&nbsp; Spectra/Por 4 RC Dialysemembranschlauch 12.000 bis 14.000 Dalton MWCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-667B</td><td>andere Dialysemembranen mit MWCO < 30.000 Da sollten auch</td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl) funktionierenFisher</td> <td>Scientific</td><td>A144-212</td><td>zur Einstellung des pH-Werts von Tris-gepufferten Lösungen</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2294</td><td></td></tr><tr><td>10x MOPS Medium Gemisch</td><td>Teknova</td><td>M2101</td><td>E. coli Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D161</td><td></td></tr><tr><td>monobasisches Kaliumphosphat (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>zweibasisches Kaliumphosphat (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>dehydrierter Hefeextrakt</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-50</td><td></td></tr><tr><td>Mangansulfat-Monohydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M113-500</td><td></td></tr><tr><td>Guanidin Isothiocyanat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP221-250</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (proteasefrei)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten mit klarem Boden</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0812-100EA</td><td>jede klare 96-Well-Platte funktioniert</td></tr><tr><td>Tecan M1000 Infinite Plate Reader</td><td>Tecan, Inc.</td><td>nicht anwendbar</td><td>Jedes Plattenlesegerät, das in der Lage ist, die Absorption bei 595 und 882 nm zu messen, funktioniert</td></tr><tr><td>mit Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Siliziumdioxid-Membran-Spin-Säulen</td><td>Epoch Life Science</td><td>1910-050/250</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120500</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrofuge-Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9580154</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>Antimon-Kaliumtartrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1088922</td><td></td></tr><tr><td>4 N Schwefelsäure (H2SO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA818-500</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumheptamolybdat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1376630</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Fisher Wissenschaftliche</td><td>AC401471000</td><td></td></tr></tbody></table>

prüfung für anorganisches polyphosphat in bakterien

Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

Anorganisches Polyphosphat (Polypen) ist eine biologische Polymer in den Zellen aus allen Bereichen des Lebens gefunden und ist erforderlich für die Virulenz und die Stress-Reaktion in vielen Bakterien. Es gibt eine Vielzahl von Methoden zur Quantifizierung PolyP in biologischen Materialien, von die viele arbeitsintensive oder unsensibel, ihre Nützlichkeit zu begrenzen sind. Wir stellen Ihnen hier eine optimierte Methode zur Quantifizierung der PolyP in Bakterien, über eine Kieselsäure Membran Spalte Extraktion optimiert für schnelle Verarbeitung von mehreren Proben, Verdauung der PolyP mit dem PolyP-spezifische Exopolyphosphatase ScPPX und Erkennung von der daraus resultierende freie Phosphat mit einem sensiblen Ascorbinsäure-basierte farbmetrischen Assay. Dieses Verfahren ist einfach, kostengünstig und ermöglicht zuverlässige PolyP Quantifizierung in unterschiedlichen Bakterienarten. Wir präsentieren Ihnen repräsentative PolyP Quantifizierung von Gram-negativen Bakteriums (Escherichia coli), grampositive Milchsäure-Bakterien (Lactobacillus Reuteri) und der mykobakteriellen Spezies (Mycobacterium Smegmatis). Wir sind auch ein einfaches Protokoll für Nickel Affinitätsreinigung mg-Mengen von ScPPX, die derzeit nicht im Handel erhältlich.

In vereinfachter Form in Abbildung 1sind die wichtigsten Schritte des Protokolls diagrammed.
Veranschaulichen die Verwendung dieses Protokolls mit Gram-negativen Bakterien, Wildtyp E. Coli war MG165539 gewachsen, Mid Log-Phase im Reich LB-Medium bei 37 ° C mit schütteln (200 u/min), dann gespült und für weitere 2 h in inkubiert Morpholinopropanesulfonate-gepuffert (M...

Wir beschreiben eine einfache Methode für schnelle Quantifizierung von anorganischen Polyphosphat in verschiedenen Bakterien, einschließlich gramnegative und grampositive mykobakteriellen Arten.

Prüfung für anorganisches Polyphosphat in Bakterien

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

Anorganisches Polyphosphat ist ein Schlüsselelement bei der bakteriellen Stressreaktion. Aber ältere Methoden zur Extraktion und Messung von Polyp in Bakterien sind komplex und arbeitsintensiv. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine schnelle, empfindliche und kostengünstige Quantifizierung von Polyp-Spiegeln in einer Vielzahl von verschiedenen Bakterienarten ermöglicht.Das Verfahren wird von Arya Pokhrel, einer Studentin aus meinem Labor, demonstriert. Zu Beginn, wachsen Lactobacillus Reuteri Bakterien in malischen Enzym Induktionmedium ohne Cystin bei 37 Grad Celsius über Nacht ohne schütteln. Zentrifugieren Sie einen Milliliter dieser Nachtkultur in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr, um genügend Zellen zu ernten, um insgesamt 50 bis 100 Mikrogramm zelluläres Protein zu erhalten.Entfernen Sie den Überstand vollständig aus dem Zellpellet, und fügen Sie dann 250 Mikroliter GITC Lyse Puffer und resuspendieren durch Wirbel. Bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren, um die Zellen zu lysieren. Bewahren Sie das Lysat bei 80 Grad Celsius auf.Erstellen Sie zunächst BSA-Standards mit Null, 1, 2 und 4 Milligramm pro Milliliter BSA im GITC-Lysepuffer. Aliquot fünf Mikroliter aufgetaut, gut gemischte Zelllysate und fünf Mikroliter BSA-Standards, um Brunnen in einer klaren 96-Well-Platte zu trennen. Fügen Sie 195 Mikroliter Bradford-Reagenz zu jedem Brunnen hinzu und messen Sie die Absorption bei 595 Nanometern in einem Plattenleser.Berechnen Sie die Proteinmenge in jedem Brunnen im Vergleich zur BSA-Standardkurve, wie im Manuskript beschrieben. Um die Gesamtmenge des Proteins in jeder Probe zu bestimmen, multiplizieren Sie den resultierenden Wert mit 05. Um die Polyphosphatextraktion zu starten, fügen Sie 250 Mikroliter 95% Ethanol in jede GITC-Lysed-Probe und Wirbel zum Mischen hinzu.Pipette dieses Gemisch zu einer Kieselsäure-Membran-Spin-Säule in einem 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr platziert. Zentrifuge bei 16, 100 g für 30 Sekunden. Entsorgen Sie den Durchfluss und fügen Sie 750 Mikroliter trishydrochlorid, Natriumchlorid, EDTA und Ethanol-Gemisch hinzu.Zentrifuge bei 16, 100 g für 30 Sekunden. Entsorgen Sie den Durchfluss und zentrieren Sie die Spinsäule zwei Minuten lang bei 16, 100 g. Legen Sie die Säule in ein sauberes 1,5 Milliliter Mikrofugerohr.150 Mikroliter 50 Millimolar pH-Gehalt acht Tris-Hydrochlorid hinzufügen und bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren. Elute PolyP durch Zentrifugieren bei 8 000 g für zwei Minuten. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Standards, die Null, fünf, 50 oder 200 mikromolares Kaliumphosphat in 50 Millimolar pH-PH-Gehalt von acht Tris-Hydrochlorid enthalten.Aliquot 100 Mikroliter jedes Phosphatstandards und 100 Mikroliter extrahierter PolyP-Proben in separaten Brunnen einer klaren 96-Well-Platte. Bereiten Sie eine Master-Mischung vor, die pro Probe 30 Mikroliter 5X ScPPX-Reaktionspuffer, 19 Mikroliter Wasser und einen Mikroliter gereinigten ScPPX enthält. Fügen Sie 50 Mikroliter der Master-Mischung zu jedem Brunnen der 96-Well-Platte hinzu.Und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius brüten. Am Tag der Detektion einen frischen Arbeitsbestand an Detektionslösung vorbereiten, indem Sie bei 9,12 Milliliter Detektionslösung Basis mit 88 Milliliter einer Molascorbinsäure mischen, und lassen Sie es auf Raumtemperatur vor Gebrauch kommen. Fügen Sie 50 Mikroliter Detektionslösung zu jeder Probe und Standards in der 96 Well Platte.Um die Farbentwicklung zu ermöglichen, inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für etwa zwei Minuten. Verwenden Sie einen Plattenleser, um die Absorption bei 882 Nanometern zu messen und die Phosphatkonzentration jeder Probe im Vergleich zur Kaliumphosphat-Standardkurve zu berechnen. Konvertieren Sie dann die Phosphatkonzentrationen in Nanomole aus Polyp-abgeleitetem Phosphat in jeder Zelle lysiert und normalisieren den zellulären Polypgehalt in das gesamte zelluläre Protein, wie im Manuskript beschrieben.Wildtyp E.coli, ein gramnegatives Bakterium, das in LB angebaut wird, produzierte kein PolyP. Aber wenn in MOPS angebaut, produziert etwa 192 Nanomole PolyP pro Milligramm des gesamten Proteins. Ein E.coli Delta ppk Mutant, dem PolyP-Kinase fehlt, produzierte kein PolyP in beiden Medien.Ein Delta-Ppx-Mutant, dem es an Exopolyphosphatase fehlt, produzierte ungefähr die gleiche Menge an PolyP wie der Wildtyp. Und der Delta-PhoB-Mutant, der im Phosphattransport defekt ist, produzierte deutlich weniger Polyp als der Wildtyp. Wildtyp L.reuteri, ein grampositives Bakterium, das über Nacht im MEIC-Medium angebaut wird, akkumulierte etwa 51 NanomolpolyP pro Milligramm Gesamtprotein.Ein L.reuteri ppk1 null Mutant ohne PolyP-Kinase enthielt weniger als die Hälfte dieser Menge. Dieses Vorhandensein von PolyP in der ppk1 null Mutant ist wahrscheinlich auf L.reuteri mit einer zweiten PolyP-Kinase zurückzuführen. Mycobacterium smegmatis Stamm SMR 5, in Hartmans-de Bont Medium in Abwesenheit von Ethanol angesammelt etwa 141 Nanomole PolyP pro Milligramm des Gesamten Proteins.Während die Ethanolbehandlung zu einer Verdreifachung führte. Nach diesem Verfahren kann Acrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt werden, um Unterschiede in der Polyp-Kettenlänge zu bewerten. Vermeiden Sie beim Versuch dieses Verfahrens häufige Fehler.Denken Sie daran, Blasen in Mikrotiter-Plattenbrunnen zu vermeiden, und achten Sie darauf, Ihre Proben auf das entsprechende Rohr zu übertragen, wenn Sie von der Säule zum Mikrofugerohr wechseln. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit GITC und starken Säuren gefährlich sein kann, und die richtige Schutzausrüstung sollte immer während der Durchführung dieses Verfahrens getragen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Protokoll beschreibt eine High-Throughput-Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse, dass ein Mikroplatten-Reader nutzt, um zu messen und zu klassifizieren Boden Phosphor als P Mono-, Di-P und anorganischen P. Bis zu 96 Proben auf einmal in einem Standard-Labor gemessen werden.

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Umweltproben

Inositol Pyrophosphate spielen eine wichtige Rolle in der menschlichen Krankheiten wie Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit, jedoch ist der genaue Wirkungsmechanismus umstritten. Das Fehlen von kommerziell erhältlichen Inosit Pyrophosphate macht detaillierte Studien problematisch. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll, zu produzieren und zu isolieren Milligramm Inosit Pyrophosphate.

Erstellung von Qualitäts-Inositol Pyrophosphate

Ein Assay zur Quantifizierung von anorganischem Polyphosphat in Bakterien

Quelle: Vidilaseris, K., et al. Screening auf thermotoga maritima membrangebundene Pyrophosphatase-Inhibitoren. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt einen kolorimetrischen Assay zum Screening von Inhibitoren der bakteriellen membrangebundenen Pyrophosphatase (mPPase) durch Quantifizierung der Orthophosphatfreisetzung. Die Methode ermöglicht die Identifizierung von Verbindungen, die die mPPase aus Thermotoga maritima, einem potenziellen antimikrobiellen Wirkstoffziel, hemmen.

Screening von Inhibitoren der bakteriellen membrangebundenen Pyrophosphatase mit einem kolorimetrischen Assay 

Dieses Papier stellt ein Verfahren zur Untersuchung der Adsorption von Phosphonaten auf Eisen-haltige Filtermaterialien, besonders granular ferric Hydroxid, mit wenig Aufwand und hohe Zuverlässigkeit. In einer gepufferten Lösung ist das Phosphonat in Kontakt das Adsorbens mit ein Rotator gebracht und dann über eine miniaturisierte Phosphor-Bestimmung-Methode analysiert.

Optimierte Verfahren zur Bestimmung der Adsorption von Phosphonaten auf Granular Ferric Hydroxid mit einer miniaturisierten Phosphor Entschlossenheit Methode

Hier beschreiben wir eine Methode zur Reinigung von Histidin-markierten Pyrophosphokinase Enzyme und Dünnschichtchromatographie radioaktiv Substrate und Produkte, für die enzymatische Aktivität in Vitroassay nutzen. Die Enzym-Aktivität-Assay ist breit anwendbar auf Kinase, Nukleotid-Cyclase oder Phosphor-Transfer-Reaktion, deren Mechanismus Nukleotid Triphosphat Hydrolyse umfasst.

Eine Reinigung und In vitro- Aktivität Assay für ein (p) PpGpp Synthestase von Clostridium difficile

In diesem Manuskript gründeten wir eine Hochdurchsatz Methode zur Quantifizierung der alkalischen Phosphatase-Aktivität in S. Aureus Biofilm Kultur aus Gewebekultur...

Kolorimetrischen Analyse der alkalischen Phosphatase Aktivität in S. Aureus Biofilm

Das Wachstum von radioaktiv markierten Bakterienkulturen in Mikrotiter-Gerichten ermöglicht eine Probenahme mit hohem Durchsatz, die mehrere technische und biologische Replizierungen von Nukleotid-Pool-Überfluss ermöglicht, einschließlich der von (p)ppGpp. Die Auswirkungen von Wachstumsübergängen, die durch Quellen physiologischen Stresses sowie Erholung von Stress hervorgerufen werden, können überwacht werden.

Verwenden von Microtiter Dish Radiolabeling für mehrere In-Vivo-Messungen von Escherichia coli (p)ppGpp gefolgt von dünnschichtiger Chromatographie

Hier stellen wir ein Screening-Verfahren für membrangebundene Pyrophosphatase (aus Thermotoga maritima) Inhibitoren auf Basis der Molybdän-Blaureaktion in einem 96-Well-Plattenformat vor.

Screening auf Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitoren

Dieses Protokoll beschreibt einen nicht radioaktiven Test zur Messung der Kinaseaktivität von Polynukleotid-Kinasen (PNKs) auf kleinen DNA- und RNA-Substraten.

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Ein Verfahren zur Kapillarelektrophorese Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie zur absoluten Quantifizierung von Inositolpyrophosphaten aus Säugetierzellextrakten wird beschrieben.

Absolute Quantifizierung von Inositolpyrophosphaten durch Kapillarelektrophorese Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie

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