Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Proteasen sind eine der am häufigsten untersuchten Gruppen biomolekularer Unterstützungen in der akademischen und industriellen Forschung. Ihre starke Rolle in mehreren physiologischen und pathologischen Prozessen macht sie zu einem prominenten Ziel auch auf dem Gebiet der Drogenentdeckung. In Bezug auf ihre intensive Forschung besteht ein großer und kontinuierlicher Bedarf an zeit- und kostensparenden Hochdurchsatz-Screening-kompatiblen Fluoreszenz-Protease-Assay-Plattformen.

Hier möchten wir ein Protokoll für die Anwendung einer separationsbasierten, hochdurchsatzfähigen Screening-kompatiblen Fluoreszenz-Assay-Plattform einführen, die sowohl mTurquoise2- als auch mApple-fused rekombinante Fusionsproteasesubstrate verwendet. Zusätzlich möchten wir ein Verfahren zur In-Gel-Renaturierung der Substrate und der Spaltungsfragmente der Assayproben nach der Denaturierung von SDS-PAGE demonstrieren. Alle Experimente werden am Beispiel der HIV-1-Virusprotease durchgeführt.

Der Ausdruck Plasmid trägt die Kodierungssequenz eines Hexa Histin-Affinitäts-Tags und eines Maltose-bindenden Fusionsproteins, gefolgt von einer Kontrollspaltungsstelle der Tabak-Etch-Virus-Protease, einer Klonkassette und einem C-terminalen fluoreszierenden Protein. Linearisieren Sie den Ausdruck Plasmid durch PacI- und NheI-Restriktionsendonukleasen. Führen Sie das Glühen des Escherichia coli codon optimiert vorwärts und umgekehrt Oligonukleotid-Primer, die Code für die Substratsequenz von Interesse und Flanke von PacI und NheI kohäsive Enden.

Führen Sie das Einfügen der geglühten Primer in das linearisierte Expressionsplasmid durch Ligation durch. Zur Proteinexpression BL21(DE3)kompetente Zellen durch das Ligationsgemisch transformieren. Die fluoreszierenden Proteine befinden sich erst nach erfolgreicher Ligation im selben offenen Leserahmen mit den N-Terminal-Fusions-Tags.

Wenige Tage nach der Transformation zeigen die Kolonien, die den Ausdruck Plasmid enthalten, der die eingefügte Spaltstelle von Interesse kodiert, sichtbare Fluoreszenz mit oder sogar ohne Verwendung eines blauen Transilluminators des Dunklen Readers. Fügen Sie 10 Mikroliter Glycerinbestand der BL21(DE3)Zellen, die die Expression Plasmid-Codierung für die Spaltung Website Sequenz von Interesse zu fünf Milliliter LB Medium enthält 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr. Inkubieren Sie die Suspension bei 37 Grad für 15 Stunden, während ständig schütteln.

Übertragen Sie fünf Milliliter Bakterienkultur auf 50 Milliliter frisches LB-Medium mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin. Wachsen Sie die Zellen bei 37 Grad auf eine Absorption von 0,6 bis 0,8 bei 600 Nanometer Wellenlängen. An diesem Punkt, induzieren Proteinexpression durch die Zugabe von IPTG.

Danach bebrüten Sie die Kultur für drei Stunden bei 37 Grad, während sie ständig zittern. Nach der Inkubation 25 Milliliter der Kultur in saubere 50 Milliliter Zentrifugenrohre übertragen und die Zellen per Zentrifugation ernten. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie die bakteriellen Zellpellets mindestens eine Stunde lang bei minus 70 Grad.

Zellpellets, die die erfolgreich exprimierten fluoreszierenden Proteine enthalten, zeigen deutlich eine Fluoreszenz mit oder sogar ohne Verwendung eines blauen Transilluminaators von Dark Reader. Das gefrorene Zellpellet auf Eis legen und 15 Minuten auftauen lassen. Fügen Sie dem Pellet zwei Milliliter Lysepuffer hinzu und setzen Sie die Zellen aus.

Danach proteame Inhibitor hinzufügen, die Suspension durch Lyzozym und DNase frei, suspendieren die Zellen, und inkubieren die Suspension auf Eis für 15 Minuten. Zwei Mal eine Milliliter-Aufhängung in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohre geben und die Suspensionen drei Minuten lang in Runden von 10 Sekunden Beschallung und fünf Sekunden Pause beschallen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 10.000 g für 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Gelöschte bakterielle Zelllysate, die das fluoreszierende Substrat von Interesse enthalten, zeigen sichtbare Fluoreszenz mit oder sogar ohne Verwendung eines blauen Transilluminaators von Dark Reader. Das Verfahren des entwickelten Protease-Assays beginnt mit der Herstellung der Assayproben. Erstens werden die rekombinanten Substrate mit der Affinität magnetischeRinnen inkubiert, und die substratgebundenen Magnetperlen, abgekürzt als SAMBs, werden gebildet.

SAMBs werden mehrmals gewaschen, und schließlich wird die SAMB-Lagerlösung durch die Aliquotierung vorbereitet, aus der Assayproben erstellt werden. Die Reaktionen werden durch zugabe der Proteaselösung initialisiert. Nach Derspaltung durch die Protease werden die proteolytischen Fragmente in den Überstand freigesetzt.

Die Reaktion wird durch die Trennung der magnetischen Perlen vom Reaktionspuffer beendet, der die fluoreszierenden Spaltungsprodukte und das Enzym enthält. Die Überstandstoffe werden auf die Brunnen einer Mikrotiterplatte aufgetragen und die Fluoreszenz wird durch Fluorimmetrie bestimmt. Kalibrierkurven werden mit gereinigten fluoreszierenden Substraten erzeugt, die in jedem Assaypuffer gelöst werden.

Die Konzentration der C-Terminal-Fluoreszenzspaltungsprodukte sowie der des in den Assayproben aufgebrachten Substrats werden anhand der Steigung der Kalibrierkurven bestimmt. Legen Sie die Röhre mit neuen oder recycelten Nickel-NPA-Magnetagaroseperlen in einen magnetischen Partikelkonzentrator. Perlen können an der Wand und/oder in den Deckel des Mikrozentrifugenrohrs kleben.

Drehen Sie daher den Konzentrator in alle Richtungen auf den Kopf, um sicherzustellen, dass alle Perlen gesammelt werden. Entfernen Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. 1,8 Milliliter Lysepuffer zu den Perlen geben und die geschlossenen Rohre aus dem Konzentrator entfernen.

Hängen Sie die Perlen in der Röhre durch Schütteln und/oder Drehen des Rohres auf den Kopf, bis die Perlen vollständig homogen sind. Legen Sie die Rohre wieder in den Konzentrator und drehen Sie sie in alle Richtungen auf den Kopf, um sicherzustellen, dass alle Perlen gesammelt werden. Öffnen Sie das Rohr und entsorgen Sie den Überstand.

Löschendes bakterielles Lysat, das das substratdes Substrat enthält, hinzufügen und das geschlossene Rohr aus dem Konzentrator entfernen. Drehen Sie die Rohre auf den Kopf, bis die Perlen vollständig homogen sind und drehen Sie die Rohre mit Rotator, langsam, bei Raumtemperatur für 30 Minuten. SAMBs zeigen sichtbare Fluoreszenz mit oder sogar ohne Verwendung eines blauen Transilluminators von Dark Reader.

Waschen Sie die SAMBs dreimal um 1,8 Milliliter 1%Tween 20, Waschpuffer und Dekolletépuffer. Fügen Sie den gewaschenen SAMBs einen Spaltungspuffer hinzu, um eine SAMB-Lagerlösung zu erstellen. Bei Verwendung von zwei Milliliter-Protein-Niedrigbindungs-Mikrozentrifugenröhren beträgt das Volumen des aufgebrachten Spaltungspuffers bis zu 1,9 Milliliter.

Nach dem Hinzufügen des Puffers, schütteln oder drehen Sie das Rohr nicht auf den Kopf. Schließen Sie das Rohr und entfernen Sie es aus dem Konzentrator. Bereiten Sie zwei Milliliter Protein-niedrig bindende Mikrozentrifugen-Röhren für die Assay-Proben vor.

Setzen Sie die SAMB-Lagerlösung aus, bis sie vollständig homogen ist, und messen Sie die Menge des substrats, das in den Reaktionen analysiert werden soll, indem Sie die SAMB-Lagerlösung sofort in die Probenfläschchen übertragen. Das Volumen der zu übertragenden SAMB-Lagerlösung wird auf 25 bis 300 Mikroliter empfohlen, soll aber nach dem individuellen Versuchsdesign eingestellt werden. Legen Sie die Probenröhrchen, die die aliquoteden SAMB-Aufhängungen enthalten, in den Konzentrator.

Entfernen Sie den Überstand vorsichtig aus den SAMBs und entsorgen Sie ihn. Entfernen Sie die Rohre aus dem Konzentrator und fügen Sie den Reaktionspuffer vorsichtig zu den SAMBs hinzu. Das Volumen des zugesetzten Reaktionspuffers ist nach dem individuellen Versuchsdesign zu berechnen, es wird jedoch empfohlen, das Endvolumen des Reaktionsgemisches zwischen 50 und 150 Mikroliter nzuzen, wenn Zweimilliliter-Röhren verwendet werden.

Schließen Sie die Deckel der Rohre. Jetzt sind die Proben für die Initialisiert. Fügen Sie die Enzymlösung zu den Reaktionsproben hinzu.

Rühren Sie die Perlen vorsichtig auf, indem Sie die Rohre vorsichtig bewegen und die Rohre sofort in den bereits schüttelnden Thermoshaker legen. Bei Substrat-Rohproben und Substratkontrollproben je nach Substrat-Leer- und Elutionspuffer hinzufügen. 30 Sekunden vor dem Ende der Inkubation, nehmen Sie die Probe aus dem Thermoshaker und drehen Sie sie prompt.

Legen Sie das Rohr auf den Konzentrator und lassen Sie das Rohr 15 Sekunden stehen. Die Sammlung der SAMBs kann durch leichtes Hin- und Herbewegen des Konzentrators erleichtert werden. Öffnen Sie den Deckel und übertragen Sie den Überstand vorsichtig in eine Platte oder ein neues Rohr.

Berühren Sie die konzentrierten Perlen nicht an der Spitze der Pipette. Der gesammelte Überstand der Substratkontrollproben und der Reaktionsproben mit einem hohen Dekolletégrad kann eine sichtbare Fluoreszenz mit oder sogar ohne Verwendung eines blauen Transilluminaators von Dark Reader aufweisen. Zwei Mal 30 Mikroliter der abgetrennten Probenüberstandmittel in eine schwarze Halbflächen-Mikroplatte übertragen.

Messen Sie die Fluoreszenz durch Fluorimeter mit den entsprechenden Filtern entsprechend dem angewendeten Fluoreszenzprotein. Für die Reinigung der fluoreszierenden Substrate die gleiche Lösung wie zuvor beschrieben vorbereiten und den Überstand entsorgen. 400 bis 600 Mikroliter Elutionspuffer zu den SAMBs geben und die Rohre bei Raumtemperatur fünf Minuten lang langsam rotieren.

Übertragen Sie das Eluat in neue proteinarme Mikrozentrifugenröhrchen. Es zeigt deutlich sichtbare Fluoreszenz mit oder ohne Verwendung eines blauen Transilluminaators von Dark Reader. Nach Reinigung, Pufferaustausch und Messung des Proteingehalts eine doppelte serielle Verdünnung in mindestens acht Schritten, sowohl aus dem Elution-Puffer-als auch aus dem Spaltungspuffer gelösten Substratlösungen, mit Elution bzw. Dekolletépuffer zur Verdünnung.

Übertragen Sie 30 Mikroliter jedes Verdünnungspunktes in eine schwarze Halbflächen-Mikroplatte. Messen Sie die Fluoreszenz nach Fluorimeter mit den gleichen Einstellungen, die bei der Messung der Assay-Probe Überstände angewendet wurden. Als Beispiel für die Datenverarbeitung wurden die substratabhängigen kinetischen Messungen der HIV-1-Protease an einer mTurquoise2-fused Form des rekombinanten Substrats durchgeführt, das die Spaltungsstelle zwischen der Matrix und den Kapsidproteinen im natürlichen klaffenden Proteinvorläufer kodiert.

Zeichnen Sie die korrigierten relativen Fluoreszenzintensitätswerte gegen die Molkonzentration der gereinigten Substrate, lösen Sie entweder den Spaltungs- oder Elutionspuffer und führen Sie eine lineare Regression durch. Berechnen Sie die Molkonzentration der C-Klemmenspaltungsprodukte in den Reaktionsproben mit der Steigung der spaltpufferbasierten Kalibrierkurve. Berechnen Sie auch die aufgebrachte Substratkonzentration in den Reaktionsproben auf Basis der Molkonzentration des eluierten Substrats in den Substratkontrollproben unter Verwendung der Steigung der elutionspufferbasierten Kalibrierkurve.

Die Anfangsgeschwindigkeitswerte wurden aus der Menge der C-Klemmenspaltungsfragmente berechnet und dann gegen die aufgebrachte Substratkonzentration aufgeplottet. Auch kinetische Parameter wurden durch die nichtlineare Regressionsanalyse von Michaelis-Menten bestimmt. Nach der Durchführung des Nickel-NTA-Magnetperlen-basierten Assays können die Assay-Überschärbe auch durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert werden.

Neben der Analyse der Assayproben ist es jedoch auch möglich, die gereinigten fluoreszierenden Substrate und/oder die Spaltungsfragmente nach der In-Lösung-Verdauung zu analysieren. Zur In-Lösung-Verdauung die gereinigten fluoreszierenden Substrate, die im Spaltungspuffer in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren verdaut werden sollen, aliquoten und die Enzymlösung zu den Proben hinzufügen. Inkubieren Sie die Proben nach dem experimentellen Design und beenden Sie die Reaktionen durch das Verfahren der Probenvorbereitung für PAGE.

Mischen Sie die zu analysierenden Proben für die nicht denaturierte Probenvorbereitung mit einem nicht dentierenden Probenladepuffer, der keine Reduktionsmittel enthält. Mischen Sie im Falle der denaturierten Probenvorbereitung die zu analysierenden Proben mit dem Denaturierungsprobenladepuffer und setzen Sie die Proben 10 Minuten lang bei 95 Grad einer Wärmebehandlung aus. Die nicht denaturierten und die denaturierten Proben in die Brunnen des SDS-Polyacrylamid-Gels auftragen und Elektrophorese durchführen.

Entfernen Sie die Gelkassette aus dem laufenden Modul. Nicht denaturierte Proben sind im Gel bereits mit bloßem Auge oder mit dem Blauen Transilluminator Dark Reader sichtbar. Um die fluoreszierenden Komponenten der denaturierten Proben auf dem Transilluminator zu detektieren, führen Sie die In-Gel-Renaturierung durch Waschen des SDS aus dem Gel durch.

100 Milliliter destilliertes Wasser in das Gel geben und mindestens 30 Minuten abspülen. Visualisieren Sie die fluoreszierenden Proteine, indem Sie das ungefärbte Gel auf den blauen Transilluminator von Dark Reader legen. Die rekombinanten fluoreszierenden Fusionsproteine wurden entwickelt, um als Substrate in proteolytischen Assays verwendet zu werden.

Bei Spaltung durch die Protease an der spezifischen Spaltstelle wird das C-terminale fluoreszierende Spaltungsfragment freigesetzt und seine Fluoreszenz kann nachgewiesen werden. Ihre Verwendung in Nickel-NTA-Magnetperlen-basierten Assays und die Fluoreszenzdetektion durch PAGE-Analyse wurden mit HIV-1-Protease optimiert. Die entwickelte Assay-Plattform kann jedoch auch für andere Proteasen geeignet sein.

Kalibrierkurven der in Spaltungs- oder Elutionspuffer gelösten gereinigten Substrate werden an den Beispielen der mTurquoise2- und mEYFP-verschmolzenen Form des rekombinanten Substrats veranschaulicht, das die Spaltseite zwischen der Matrix und den Kapsidproteinen des natürlichen HIV-Anechoproteins kodiert. Der Nickel-NTA-Magnetperlen-Assay ist ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der Wirkung der Substratkonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit und ermöglicht damit auch die Bestimmung der enzymkinetischen Parameter wie Vmax und Km. Diagramm A zeigt ein optimales Ergebnis, das nach einer erfolgreich durchgeführten Analyse der substratabhängigen Aktivität auf einem mApple-verschmolzenen Substrat erzielt wurde.

Im Gegensatz dazu stellt Diagramm B ein suboptimales Ergebnis dar, bei dem die unzureichende Homogenisierung der SAMB-Lagerlösung Probleme bei der Einrichtung der richtigen Substratkonzentrationen verursacht, während eine unsachgemäße Beendigung der Reaktionsproben zu relativ hohen Fehlern führt. Der Assay bietet auch ein geeignetes Werkzeug für die Durchführung von Zeit-Kurs und hemmende Studien sowie. Diagramm A zeigt die zeitliche Abhängigkeit der proteolytischen Spaltung der HIV-1-Protease auf einem mEYFP-gebundenen Substrat, während Diagramm B die hemmende Wirkung von Amprenavir auf die Spaltungsreaktion darstellt.

Aus den durch die hemmende Studie gewonnenen Daten können sowohl die aktive Enzymkonzentration als auch die hemmende Konstante bestimmt werden. Der Assay kann auch optimiert werden, um die Abhängigkeit der Enzymaktivität vom pH-Wert zu untersuchen, wie er durch Diagramm A am Beispiel der Tabak-Etch-Virus-Protease dargestellt wird. Schaubild B weist auf eine Begrenzung des Assays durch pH-Wert hin und zeigt, dass neutraler oder leicht alkalischer pH-Wert vollständig mit den Messungen kompatibel ist, während saurer pH-Wert die spontane Trennung der Substrate von der Oberfläche der Magnetperlen erleichtert.

Die vorliegende Abbildung zeigt die gereinigten intakten fluoreszierenden Substrate, die fluoreszierenden C-terminalen Spaltungsfragmente, die durch in-Solution-Verdauung durch HIV-1-Protease erzeugt werden. Die fluoreszierenden Komponenten können im SDS-haltigen Polyacrylamid-Gel durch Blaulichttransillumination direkt nach der Elektrophorese nachgewiesen werden, wenn während der Probenvorbereitung nicht denaturierende Bedingungen angewendet wurden. Die verschiedenen fluoreszierenden Proteine können je nach Farbe unterschieden werden.

Nach dem magnetischen Perlentest können die nicht denaturierten fluoreszierenden Proteine in den Probenüberbleibsanten auch durch UV-Beleuchtung im Gel nachgewiesen werden. Wenn hingegen während der Probenvorbereitung Denaturierungsbedingungen angewendet werden, können die denaturierten Proteine nicht unmittelbar nach der SDS-SEITE im Gel nachgewiesen werden. Die denaturierten fluoreszierenden Proteine können jedoch durch die Entfernung des SDS aus dem Gel teilweise renaturiert und nachweisbar werden.

Daher folgt auf die SDS PAGE das In-Gel-Renaturierungsverfahren. Die Renaturierungsfähigkeit der fluoreszierenden Proteine ermöglicht ihre Identifizierung nicht nur auf der Grundlage ihrer Fluoreszenz, sondern auch aufgrund ihres Molekulargewichts. Hier haben wir das Protokoll für den Einsatz unserer kürzlich entwickelten magnetperlenbasierten fluoreszierenden Protease-Assay-Plattform demonstriert.

Wir haben die Verwendung dieses Systems am Beispiel von enzymkinetischen Studien zur HIV-1-Protease nachgewiesen. Wir verwendeten mTurquoise-und mApple-fused Formen des rekombinanten Assaysubstrats, das die Spaltungs-Standortsequenz der Protease enthielt. Neben der fluorimetrischen Analyse wurden die Assay-Proben anschließend auch von SDS PAGE analysiert.

Wir haben gezeigt, dass die denaturierten fluoreszierenden Proteine im Gel nach SDS PAGE teilweise renaturiert werden können, was sowohl eine fluoreszierende als auch molekulare Identifizierung des Substrats und der proteolytischen Fragmente ermöglicht.