Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen auf dem Gebiet der zerebralen Gefäßphysiologie zu beantworten, da sie sich auf die Regulierung des zerebralen Durchblutungsflusses während des Alterns und der Entwicklung chronischer Krankheiten bezieht. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die gleichzeitige Messung des intrazellulären Kalziums und des Membranpotentials des zerebralen arteriellen Endothels in seiner nativen Form unter physiologischen Bedingungen ermöglicht. Um das Maushirn zu isolieren, entfernen Sie unter dem Mikroskop die Haut und haare über dem Schädel.

Und entfernen Sie übermäßiges Blut mit kaltem kalziumfreiem PSS. Als nächstes machen Sie einen Schnitt nur mit den Spitzen der Standard-Sezierschere. Ausgehend vom okzipitalen Knochen und sich durch den Nasenbein des Schädels.

Öffnen Sie dann vorsichtig den Schädel entlang des Schnittes, indem Sie grobspitzen Zangen verwenden und das Bindegewebe trennen, um das Gehirn freizulegen. Waschen Sie das isolierte Gehirn vorsichtig mit kaltem kalziumfreiem PSS in einem Becher, um das Blut zu entfernen. Legen Sie die hirnventrale Seite in eine Kammer, die eine kalte Dissektionslösung zur Isolierung von Hirnarterien enthält.

Um die Zerebralparese zu isolieren, sichern Sie das isolierte Gehirn in kalter Dissektionslösung, indem Sie zwei Edelstahlstifte durch sie in eine mit Kohle infundierte Siliziumpolymerbeschichtung an der Unterseite einer Glaspetrischale einfügen. Anschließend isolieren Sie die hinteren Hirnarterien operativ um 0,3 bis 0,5 Zentimeter von den hinteren Kommunikations- und Basilararterien. Verwenden Sie Edelstahlstifte, um beide isolierten hinteren Hirnarterien in der Dissektionslösung in der Petrischale zu sichern.

Reinigen Sie dann die isolierten hinteren Hirnarterien sorgfältig, indem Sie Bindegewebe mit geschärften Feinspitzendrücken entfernen. Schneiden Sie die intakten Arterien zur enzymatischen Verdauung in ein bis zwei Millimeter Segmente. Bereiten Sie bei diesem Verfahren das Triturationsgerät mit einem Mikroskop, einer Kamera und einer Aluminiumbühne vor, die eine Kammer und Mikromanipulatoren hält.

Sichern Sie eine Mikrospritze mit einem Pumpenregler neben der Bühne und der Probe. Als nächstes eine Titrationspipette komplett mit Mineralöl füllen und über den Mikrospritzkolben sichern. Dann mit der Mikrospritze mit dem Pumpenregler ziehen Sie etwa 130 Nanoliter Dissoziationslösung in die Pipette, während das Fehlen von Luftblasen zu gewährleisten.

Anschließend intakte arterielle Segmente in einen Milliliter Dissoziationslösung mit erforderlichen Enzymkonzentrationen in einem 10 Milliliter Glasrohr platzieren. Bei 34 Grad Celsius für 10 bis 12 Minuten für die teilweise Verdauung inkubieren. Ersetzen Sie nach der Verdauung die Enzymlösung durch fünf Milliliter frischer Dissoziationslösung.

Mit einer 1-Milliliter-Pipette ein Segment bei Raumtemperatur in die Kammer mit Dissoziationslösung übertragen. Als nächstes die Pipette in die Dissoziationslösung in der Kammer legen und nahe an einem Ende des verdauten Gefäßes positionieren. Stellen Sie eine Rate im Bereich von zwei bis fünf Nanoliterpro Sekunde auf dem Pumpenregler für sanfte Trituration ein.

Beim Betrachten durch 100-mal bis 200-fache Vergrößerung ziehen Sie sich zurück und werfen sie das arterielle Segment aus, um glatte Muskelzellen zu dissoziieren, während sie ein Endothelrohr erzeugen. Verwenden Sie bei Bedarf sorgfältig feingekippte Zangen, um dissoziierte Adventitien und interne elastische Lamina vom Endothelrohr zu trennen. Bestätigen Sie, dass alle glatten Muskelzellen dissoziiert sind und dass nur Endothelzellen als intakte Röhre erhalten bleiben.

Mit Mikromanipulatoren, sichern Sie jedes Ende des Endothelrohrs auf dem Glasdeckelschlupf der Superfusionskammer mit Borosilikatglas-Pinningpipetten. Waschen Sie die dissoziierte Adventitia und glatte Muskelzellen aus der Kammer. Und ersetzen Sie die Dissoziationslösung durch zwei Mol mehr Calciumchlorid PSS.

Übertragen Sie die mobile Plattform mit gesichertem Endothelrohr auf das Mikroskop von Superfusion und Versuchsanlage. Verwenden Sie dann sechs saubere 50-Milliliter-Reservoirs für die kontinuierliche Lieferung von PSS und entsprechenden Medikamentenlösungen während des Experiments. Verwenden Sie das Inline-Durchflussregelventil, um den Durchfluss manuell so konsistent wie laminierter zu setzen und gleichzeitig die Durchflusszuführung mit der Vakuumabsaugung abzugleichen.

Liefern Sie PSS für die Superfusion des Endothelrohrs für mindestens fünf Minuten in die Kammer, bevor Sie die Hintergrunddaten und die Farbbeladung aufzeichnen. Um das Membranpotential gleichzeitig mit der intrazellulären Kalziumkonzentration zu messen, ziehen Sie eine scharfe Elektrode und füllen Sie sie mit zwei mollaren Kaliumchlorid, um aus Zellen aufzuzeichnen, die mit Fura-2-Farbstoff belastet sind. Um die intrazelluläre Kopplung mittels Farbstofftransfer zu untersuchen, füllen Sie die Mikroelektrode mit 0,1% Propidiumjodid, das in zwei molarem Kaliumchlorid gelöst ist.

Als nächstes legen Sie die Elektrode über einen mit Chlorid beschichteten Silberdraht in den Pipettenhalter, der an einer mit einem Mikromanipulator gesicherten Elektrometerkopfstufe befestigt ist. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Spitze der Elektrode kurz in das fließende PSS in der Kammer zu positionieren, während Sie durch das vierfache Objektiv schauen. Anschließend stellen Sie das ruhende Membranpotential auf Null als konsistent mit dem geerdeten Badpotenzial.

Verwenden Sie auf Wunsch hörbare Basismonitore, die mit Elektrometern verbunden sind, um Tonhöhen mit potenziellen Aufnahmen zu verknüpfen. Danach erhöhen Sie die Vergrößerung auf 400 Mal mit einem 40-fachen Objektiv und positionieren Sie die Elektrodenspitze knapp über der Zelle des Endothelrohrs. Passen Sie das fotometrische Fenster mit der Photometrie-Software an, um sich auf etwa 50 bis 80 Endothelzellen zu konzentrieren.

Legen Sie dann die Elektrode vorsichtig mit dem Mikromanipulator in eine der Zellen des Endothelrohrs und warten Sie mindestens zwei Minuten, bis sich das ruhende Membranpotenzial stabilisiert. Sobald das ruhende Membranpotential bei seinem erwarteten Wert stabil ist, schalten Sie die Photomultiplierröhre auf der Fluoreszenzschnittstelle in Ermangelung von Licht ein und beginnen sie mit der Erfassung der intrazellulären Kalziumkonzentration durch spannende Fura-2 abwechselnd bei 340 und 380 Nanometern, während sie die Blütenstoffemission bei 510 Nanometern sammelt. Sobald gleichzeitige Messungen des Membranpotentials und der intrazellulären Kalziumkonzentration durchgeführt wurden, lassen Sie etwa fünf Minuten für die Superfusion von Endothelrohr mit PSS bei einer konstanten laminaren Durchflussrate vor der Anwendung von Medikamenten.

Tragen Sie das in PSS zubereitete Medikament mit einer konstanten Durchflussrate auf die Superfusionskammer auf. Messen Sie während der medikamentösen Behandlung das Membranpotenzial in den F340/F380-Verhältnissen gleichzeitig. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, ziehen Sie die Elektrode aus der Zelle.

Dann stoppen Sie die jeweiligen Aufzeichnungen des Membranpotentials und der intrazellulären Kalziumkonzentration und speichern Sie die Dateien für die Datenanalyse. Dies ist ein Differentialinterferenzkontrastbild eines Maus-Zerebralen arteriellen Endothelrohrs, das für Experimente im photometrischen Fenster mit einem 40-fachen Objektiv angepasst wurde. Eine scharfe Elektrode wird in eine Zelle gelegt, wie oben im Bild gezeigt.

Hier sind die Beispiele für Rohspuren zur gleichzeitigen Messung des F340/F380-Verhältnisses und des Membranpotenzials als Reaktion auf 100 Mikromolar ATP. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die konfokale Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Mikrodomänensignalisierung von endothelialer Kalzium und reaktiven Sauerstoffspezies als Beispiele zu beantworten. Im Allgemeinen wird diese Technik weiterhin den Weg für Forschungen in der zellulären Physiologie ebnen, um die Vaskuläre Funktion und Alterung im Blut und lymphatischen Kreislauf zu erforschen.