Name: In-vitro- Kratzen Sie Assay veranschaulichen Auswirkungen von Arsen auf Haut Zellwanderung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Erfahren Sie, wie der Scratch-Assay die Auswirkungen von Arsen auf die Zellmigration bei der Wundheilung untersucht. Diese kostengünstige Methode liefert wertvolle Daten vor klinischen Studien.

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Forschung berichtet in dieser Publikation wurde durch das National Institute on Minderheit Gesundheit und gesundheitliche Ungleichheiten der National Institutes of Health unter Preis Anzahl U54MD012388 unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Anwendung des Assays bietet eine Hochdurchsatz- und zeitnahe Bewertung der zelluläre Migration und kann direkt auf komplexen physiologischen Systeme5,6,7übersetzen. Aus diesem Grund wurde das vorgeschlagene Benchtop-Modell abgestimmt und geübt, um die Auswirkungen von verschiedenen Therapeutika und Umweltgiften auf Wundheilung6zu bewerten. Die Konzentrationen von Arsen in der aktuellen Studie verwendeten galten umweltrelevanten durch umfangreiche Literaturrecherche der bekannten Exposition und vom Rückblick auf verschiedene Daten Stützpunkte14,15, 16,17,18,19,20,21. Verwendung von in-vitro- Scratch Assays gezeigt, dass die Exposition zu einer Arsenkonzentration innerhalb der hohen, aber ökologisch relevanten Bereich, verzögert Wundverschluss (zelluläre Migration).
Diese Bench-Top-Modell war auch beschäftigt, zu isolieren und zu eine einzelnen Zelllinie (Fibroblasten) um besser zu verstehen wie Fibroblasten Migration trägt zur Heilung Ergebnisse Wunde zu studieren. Darüber hinaus ist es schwierig, die Funktionen von einer einzelnen Zelllinie in komplexe in-Vivo -Systemen mit vielen anderen Zellen und Geweben vorhanden zu studieren, die die Analyse beeinträchtigen können. Darüber hinaus bietet der Assay ein Mittel zur Erreichung semi-quantitativen Prozent Wunde Schließung Daten, die verwendet werden können spezifische zelluläre Mechanismen durch die Wundheilung Verbindungen beeinflussen können. Zum Beispiel in der Scratch-Test verwendete Zellen gesammelt und in eine gewünschte Reagenz gespeichert und in der Genexpression verwendet werden können (signal-mRNA) oder Protein-Expression assays22. Diese Informationen kann auf die Ermittler nützlich sein, wenn sie versuchen, zu verstehen was Signale oder Proteine weitgehend auf Veränderungen in der zellulären Migration in Anwesenheit von unterschiedlichen Behandlungen (z.B. Arsen)22beitragen können.
Menschliche Neugeborene dermale Fibroblasten wurden für diese Arbeit, basierend auf ihre herausragende Rolle bei der Wundheilung ausgewählt. Allerdings hat dieses Rubbellos Assay-Protokoll umgesetzt worden, mit verschiedenen Zelltypen und für verschiedenste Zwecke. Zum Beispiel wurde der Scratch-Test in dem Gebiet der Onkologie für Migration Inhibition der Chemotherapie Drogen23Studium angenommen; für skelettartigen Muskel Zellwanderung, Vermehrung und Verbreitung24; die Wirkung von Pflanzenextrakten auf zelluläre Migration25zu studieren; und um zu verstehen, wie Keratinozyten Migration und Proliferation zur Heilung9gewickelt. Darüber hinaus bewertet eine frühere Arbeit von Pinto Et Al. die Auswirkungen von Uran (U) und Platelet-Rich Plasma (PRP) auf hDFn Migration mithilfe der Scratch-Test6. Das Ziel dieser Arbeit war das Ausmaß zu verstehen, zu dem dieser Assay die Auswirkungen der Vermittler gedacht, um zelluläre Migration (U) langsam sowie Vermittler gedacht, um zelluläre Migration (PRP) beschleunigen testen konnte. Wie kann man in der oben genannten Arbeiten und Forschung durch andere Forscher, Anwendung der Scratch-Test hat hohes Potenzial für den Einsatz in verschiedenen experimentellen Modellen26. Trotz der Detailliertheit innerhalb der Methoden sollte Varianz zwischen Ermittlern und Experimente erwartet werden. Beispielsweise werden zelluläre Migration Preise wahrscheinlich basierend auf der Zell-Linie im Einsatz, neben der erforderlichen Mikronährstoffe benötigt für einzigartige Zelltypen schwanken. Viele wichtigeren Bemerkungen für Zellausbeute und Rentabilität sind als Notizen in diesem Protokoll aufgeführt. Es ist jedoch dringend empfohlen, dass Ermittler des Herstellers für optimale Wachstumsbedingungen und zur Verwendung dieser Methode als ergänzende Anweisungen für allgemeine Zelle Kultur Arbeit folgen.
Obwohl der Scratch-Test vielseitig einsetzbar für Studie der Zellaktivität ist; unvorhergesehene Verzerrungen entstehen in der Messtechnik. Zum Beispiel wenn ImageJ manuell Zelle Migration Fronten verfolgen, existieren Variation unter den Nutzern, die Genauigkeit und repräsentative Datenerhebung einschränken können. Anzumerken ist, dass Migration Fronten blind auf die Behandlung Benutzer Verzerrungen zu minimieren gelesen werden soll. Darüber hinaus kann manuell identifizieren Migration Fronten führen Fehleinschätzung der durchschnittliche zurückgelegte Strecke durch Pseudopod Bildung von Zellen und ihre Fähigkeit zu erreichen, um Form fokalen Adhäsionen, die optisch irreführend sein kann. In ähnlicher Weise die Verwendung von fluoreszierenden "Zelle Tracker" färbt auf Zelloberfläche oder nuklearen Proteine, Migration zu erkennen können unbeabsichtigt Zellen, was zu Ungenauigkeiten bei der Messung von zellulären Migration im Laufe der Zeit beheben. Es wird empfohlen, entsprechende positive und/oder negative Kontrollen im Rahmen des Experiments völlig Esel eingeschrieben werden die Wirkung der Behandlung auf die Zell-Linien. Praxis des Assays ist als Anerkennung für seine Grenzen auszufüllen. Dieser Assay garantiert nicht, dass zelluläre Migrationsergebnisse aus in-vitro- Experimente direkt zu in Vivo Ergebnisse. übersetzen Wunde heilend und zelluläre Migration in ein komplexes lebendes System umfasst eine Vielzahl von Zelltypen und molekulare Signale; jede davon hat das Potenzial, heilende Reaktionen beeinflussen.
Zusammenfassend lässt sich sagen fand der Scratch-Test, High Throughput Screening der zelluläre Migration in Reaktion auf sich ändernde Umgebungen6,25bieten. Wir nutzten speziell dieses Protokoll um Veränderungen erfolgreich in zelluläre Migration durch Arsen Exposition bei verschiedenen umweltrelevanten Dosen zu erkennen. Diese Angaben haben Rechtfertigung den Scratchen-Test verwenden, um weitere Studie und bewerten die mechanistische Wege der zellulären Arbeitsmigration in diesem Assay und wie diese Wege durch Arsen Exposition verändert werden.

Wundheilung besteht aus einer komplexen Abfolge von überlappenden Schritte, bei denen verschiedene Zelltypen, Signalmoleküle und extrazelluläre Matrix Komponenten1. Diese Komponenten zusammenarbeiten, gemeinsam, um zu erreichen, Wunde Auflösung oder Reparatur, was letztendlich zur Bildung einer schützenden fibrotische Narbe je nach Trauma1führt. Um die einzelnen Prozesse und Funktionen der Wunde zu erfassen ist es schwierig, die Heilung in einem Experiment. einzelnen Schritte innerhalb der Wundheilung müssen identifiziert und separat getestet werden. Unter den vielen Schritten der Wundheilung ist der Prozess der zelluläre Migration kritisch betrachtet worden, heilende Sätze2Bewertung. Zelluläre Migration in allen Phasen der Wundheilung beobachtet werden und somit erfordert weitere Verständnis wie Änderungen an Zellwanderung Wundverschluss auswirken können. Zum Beispiel wird zelluläre Migration in beiden frühen und späten Phase Entzündung mit Blut Koagulation und Thrombozyten-Aggregation auf die Wunde Seite3gesehen. Diese Ereignisse verhindern übermäßigen Blutverlust durch die Bildung einer vorübergehende Blockade um verwundete Flächen frei von Gewebe3zu füllen. Thrombozyten im Umlauf werden synthetisieren und sezernieren vasoaktive Mediatoren zusammen mit chemotaktische Faktoren, welche zusammen Signal für entzündliche Leukozyte Migration (weiße Blutkörperchen) des verletzten Gewebes für Reparatur4. Re Epithelisierung erfolgt innerhalb von Stunden von Gewebeverletzungen und beinhaltet Abdeckung der Wunde durch Aktivität und Migration von epithelialen Keratinozyten um weitere Verschmutzung zu verhindern oder Invasion von Fremdkörpern in die Wunde Seite2. Diese Beispiele erfassen nur wenige der vielen Zellwanderung, die Funktionen im Zusammenhang mit Wundheilung.
Der Scratch-Test worden beschrieben und zum besseren Verständnis Zellwanderung und seine vielen Rollen in5,6der Wundheilung verwendet. Dieser Assay gilt als simpel, bietet hohen Durchsatz und ermöglicht die Ermittler, repräsentative Zelle Migrationsdaten zu sammeln. Migration-Assays haben erfolgreich gezeigt, dass bestimmte Verbindungen können beschleunigen oder die Rate der zelluläre Migration6 verlangsamen. Darüber hinaus bieten diese Untersuchungsergebnisse translationale physiologische Informationen, die verwendet werden, um die Ziel-Behandlungen, Dosierung Konzentrationen und Gene von Interesse vor in Vivo Experimente zu formulieren. Der Test erfordert Grundzelle Kulturtechniken und Lieferungen, eine Zelllinie Wahl und imaging-Technologie, Bewegung oder Bewegung als Reaktion auf die Behandlungen zu erfassen.
Der Test kann leicht manipuliert oder zugeschnitten auf die Bedürfnisse des Prüfers. Allerdings gibt es vier grundlegende Fragen zu prüfen, vor dem experimentieren. Welche allgemeine oder spezifische Frage (n) ist/sind der Prüfleiter zu beantworten versuchen? Dies gilt auch für die meisten Hypothesen Forschung; Allerdings ist es wichtig zu diesem Test, weil es viele Parameter benötigt, um präzise und vollständig beantwortet die Frage (n) bestimmt wird. Was Zelllinie oder Zellinien (falls mehrere) sollten zur Darstellung der physiologischen Systems untersucht? Zum Beispiel in einer kutanen gewickelt, heilende Studie, dermalen Fibroblasten5,6,7, Stammzell-8oder epidermalen Keratinozyten9 könnte als Zellpopulationen gewertet, die normalerweise zu finden sind in Hülle und Fülle in Haut Gewebe10. Alternativ konnte die neutrophilen Granulozyten, Makrophagen und anderen Entzündungszellen in diesem System darzustellen Zellwanderung anderer Komponenten der Wundheilung innerhalb der Haut Gewebe10ausgewertet werden. Darüber hinaus hilft identifizieren die spezifischen Zellinie evaluiert um zu identifizieren, welche Reagenzien optimal zu nutzen, um metabolische Aktivität der Zellen zu fördern sind. Wie wird die Zellwanderung verfolgt/abgebildet sein? Es gibt eine Reihe von Techniken zur Zellwanderung innerhalb einer Platte oder einer Flasche zu beobachten. Zum Beispiel bietet färben oder Gewebekulturen tagging Zellen und Fluoreszenz oder confocal imaging verwenden, um Zellen zu verfolgen einen starken Kontrast, wodurch die Ermittler zu zellulären vs. nicht-Mobilfunk-Standorte und zelluläre Bewegung11 klar definieren . Eine weitere gängige Technik, beschrieben in dieser Studie ist die Verwendung der invertierten Lichtmikroskopie mit Phase Kontrast6,7. Diese Alternative zu Zelle Farbstoffe und Fluoreszenz ermöglicht dem Benutzer, Track Zellen Leben, ohne Zellen vor Bildgebung unheilbar zu beheben und ermöglicht auch für die Aufnahmen der gleichen einzelnen Wells mit verwundeten Monolagen Zellen über Zeitpunkte. Welches Ergebnis misst, wird für die Analyse verwendet werden? Die Verwendung der Bilder gesammelt während der Studie Daten erzeugt werden können, in denen Änderungen an zelluläre Migration verstanden werden können. In unserem Labor mikroskopische Bilder auf dem invertierten Lichtmikroskop, Bildanalyse-Software hochgeladen werden und die prozentuale Wundverschluss und summierte Fläche unter der Kurve (AUC) werden berechnet.
Wir beleuchten den gezielten Einsatz von diesem Assay, Änderungen zur Migration der dermalen Fibroblasten in Anwesenheit von bekannten Umwelt Verunreinigung, Arsen aufzuklären. Arsen ist ein natürlich vorkommendes Halbmetall gefunden innerhalb der Erdkruste. Verschiedenen Orten fanden mit erhöhten Konzentrationen von Arsen, die eine Gefahr für Personen darstellt, die in der Nähe von diesen Orten leben. Infolgedessen wurden Nahrung und Wasser Quellen gezeigt, Arsen Kontaminationsgrad gestiegen, das erhöht die Wahrscheinlichkeit für den einzelnen Arsen ausgesetzt werden. Ökologische Arsen Exposition hat nachweislich langfristigen gesundheitlichen Folgen in menschlichen Populationen oberhalb oder auch unterhalb der aktuellen United States Environmental Protection Agency (USEPA) Max Verunreinigung Ebene (MCL) 10 ppb (10 µg/L)12, 13. Obwohl das USEPA hat diese MCL und hielt es trinkbar Grenzen, Arsenkonzentrationen, die dieses Limit überschreiten sind keine Seltenheit in Wasserquellen weltweit. Im Südwesten der Vereinigten Staaten, wurden zahlreiche Grundwasser Brunnenwasser und Quellen dokumentiert, um Bezug auf Niveaus von Arsen14enthalten. So enthält z. B. im Verde Valley, AZ, Montezuma gut 210 µg/L Arsen15. Grundwasser rund um den Fluss Verde, AZ enthält 16 µg/L Arsen durchschnittlich, mit Spitzenwerten bis 1,3 mg/L15,16. Vor allem überschreiten Arsenkonzentrationen in vielen Brunnen in der Verde River Wasser Schuppen 50 µg/L15,16. Mit diesem wissen, umweltrelevante Arsen-Konzentrationen wurden ausgewählt, dieses Bereichs von unten die MCL bei 0,1 µM (7,5 ppb), um über die MCL bei 10 µM (750 ppb) in der aktuellen Studie14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Aus diesen Experimenten gesammelten Informationen dienen als ein Frühindikator für mögliche Änderungen an zelluläre Migration in einem in Vivo Wunde mit Arsen verseucht. Danach, Signalisierung, dass Moleküle ausgewählt werden können abhängig von ihrer Rolle in der Wundheilung und zelluläre Migration zu erleichtern, und künftige quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR) basierte gen Ausdruck Experimente können nach Abschluss des aktuellen eingerichtet werden Studien. Wenn Migration Rate in diesem Assay in Anwesenheit von Arsen zu ändern, spezifisches gen Ziele zelluläre Migration beteiligt möglicherweise das Ziel für die schädlichen Auswirkungen von Arsen, und so können der Mechanismus der Störung sein.

<table><tbody><tr><td>Klasse II A/B3 Biologische Sicherheitswerkbank</td><td>Forma Scientific</td><td>15201-816</td><td></td></tr><tr><td>Nitrilhandschuhe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>55082</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td></td><td>Präzisionsmodell 182</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Leica</td><td>Q080318</td> CPR-Zentrifuge <td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>349702</td><td></td></tr><tr><td>Analysewaage</td><td>Ohaus</td><td>I093 1125062111P</td><td></td></tr><tr><td>Wiegepapier</td><td>VWR</td><td>H351125781212A</td><td></td></tr><tr><td>Biohazard Bags</td><td>Fisherbran</td><td>01-830A</td><td></td></tr><tr><td>Water Jacketed CO2 Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>309739-31053</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Automatischer Pipettierer</td><td>Drummond</td><td>140685</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nenner</td><td>Fisher Scientific</td><td>D59707</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauer Fleck</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>T75 Gewebekolben</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konisches Röhrchen</td><td>Fisherbrand</td><td>05-539-5</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konisches Röhrchen</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Gewebemarker</td><td>Securline</td><td>92167</td><td></td></tr><tr><td>Tücher</td><td>Kintech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher</td><td>63-67-0</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen ohne Filter</td><td>Fisherbrand</td><td>16160210</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Tolles Preis-Leistungs-Verhältnis</td><td>220-04</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Falcon</td><td></td><td>353915</td><td></td></tr><tr><td>Kryofläschchen-Rack</td><td>Nalgene</td><td>5030-0505</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Gizmo Versorgung</td><td>B00SCOGY56</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Konisches Röhrchengestell</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3598</td><td></td></tr><tr><td>Abfallbecher</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>Lineal</td><td>n/ a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Humane neonatale dermale Fibroblasten (hDFn)</td><td>Lot: 1734, 2902</td><td>106-05n</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio Statistical Software</td><td></td><td>ver: 3.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td>ver: 1.8.0_112</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro- kratzen sie assay veranschaulichen auswirkungen von arsen auf haut zellwanderung

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Das Verständnis der physiologischen Mechanismen der Wundheilung hat seit vielen Jahren im Mittelpunkt der Forschung. Diese Forschung führt direkt zu Veränderungen im klinischen Standards für die Behandlung von Wunden und abnehmende Morbidität und Mortalität bei Patienten. Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der strategischen Zell- und Interaktion und Funktion benötigt. Eine der vielen kritisch wichtigen Funktionen der Wundheilung ist individueller und kollektiver zelluläre Migration. Nach Verletzungen Wandern verschiedene Zellen aus dem Blut, umgebende Binde- und epithelialen Gewebe rapide in der Wunde durch chemische und/oder physikalische Reize. Diese Migration Antwort kann weitgehend diktieren, die Ergebnisse und den Erfolg einer heilenden Wunde. Diese spezifische zelluläre Funktion zu verstehen ist wichtig für Translationale Medizin, die verbesserte Wundheilung Ergebnissen führen kann. Hier beschreiben wir ein Protokoll verwendet, um zellulare Migration besser zu verstehen, wie es bezieht sich auf die Wundheilung, und wie Änderungen an der zellulären Umgebung diesen Prozess erheblich verändern können. In diesem Beispiel-Studie wurden dermale Fibroblasten in Medien mit fetalen bovine Serum (FBS) ergänzt als Monolayer-Kulturen im Gewebe Kulturflaschen angebaut. Zellen wurden aseptisch in Gewebekultur behandelt 12-Well-Platten übertragen und zu 100 % Zusammenfluss gewachsen. Nach dem Zusammenfluss erreichen, wurden die Zellen in der Monolage vertikal zerkratzt mit einer p200 Pipettieren Spitze. Arsen verdünnt in Kulturmedien mit FBS ergänzt wurde einzelnen Wells in ökologisch hinzugefügt, dass relevante Dosen im Bereich von 0,1-10 M. Bilder aufgenommen wurden, alle 4 Stunden (h) über einen Zeitraum von 24 Stunden mit einer invertierten Lichtmikroskop, zelluläre Migration zu beobachten (Wunde (Schließung). Bilder wurden einzeln mit Bildanalyse-Software analysiert und Prozent Wunde Schließung wurde berechnet. Die Ergebnisse zeigen, dass Arsen die Wundheilung verlangsamt. Diese Technik bietet einen schnellen und kostengünstigen ersten Bildschirm für die Bewertung der Auswirkungen von Schadstoffen auf die Wundheilung.

Stichprobengröße (n) für alle Behandlungsgruppen war n = 28. Zellen wurden erfolgreich kultiviert folgende aseptische Techniken und Labor Protokolle (Abbildung 1). Einheitliche Kratzer beobachtet in allen Behandlungsgruppen mit der mittlere Kratzer Breite von 0,8 mm 0,4 mm (Abbildung 2). Kontrollgruppen hatten eine durchschnittliche summierte Fläche unter der Kurvenwert des 1,355.83; 0,01 µM als Behandlungsgruppen gab es durchschnittlich summiert Fläche unter der Kurvenwert des 1,366.21; 0,1 µM als Behandlungsgruppen hatte durchschnittlich summiert Fläche unter der Kurvenwert des 1,326.24, 1,0 µM als Behandlungsgruppe hatten durchschnittlich summiert Fläche unter der Kurvenwert des 1,295.10; und schließlich die 10 µM Behandlungsgruppe hatte eine durchschnittliche summierte Fläche unter der Kurvenwert des 535.12, die statistisch geringer war im Vergleich zu allen anderen Gruppen (p &lt; 0,05) (Abbildung 3). R-Programm für die statistische Analyse wurde verwendet, um führen Sie eine einfache ANOVA mit einem Tukey post Hoc Anpassung an statistischen Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen (p &lt; 0,05) zu bestimmen.
<img alt="Zellwachstum unter Arsenexposition; Ergebnisse der Mikroskopie; Kontrolle, 1,0 μM und 10 μM As über 20 Stunden." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: repräsentative Kratzer assay Bilder über einen Zeitraum von 20 h. Bilder A-D sind zelluläre Migration der Kontrollzellen; Bilder E-H repräsentieren zelluläre Migration von Zellen mit 1,0 µM als kontaminiert; Bilder-L stehen für zelluläre Migration von Zellen mit 10 µM als kontaminiert. Aus diesen Bildern ist es klar, dass zelluläre Migration in Anwesenheit von Arsen gebremst wird. Die Steuerung-Bilder zeigen einen komplett "geheilt" Kratzer nach 20 h, während die anderen beiden Gruppen als Behandlung nicht "geheilt" wurden. Die 10 µM als Behandlung gehemmt vollständige Schließung insgesamt nach 24 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Balkendiagramm, das die Dosisreaktion von Arsen zeigt; summierte AUC bei unterschiedlichen Konzentrationen; experimentelle Ergebnisse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Abbildung 3: Arsen verlangsamt zelluläre Migration in der Scratch-Test. Die Aufnahmen wurden über einen Zeitraum von 24 h, Änderungen an zelluläre Migration in Anwesenheit von unterschiedlichen Konzentrationen von Arsen zu beobachten. RAW-Bilder wurden mit einer automatisierten Software (z. B.in MATLAB), welche ursprünglich gemessenen Wunde Breite berechnet dann Prozent Schließung und schließlich die Fläche unter der Kurve (AUC) analysiert. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwerts. Die 10 µM als Behandlungsgruppe verlangsamt statistisch zelluläre Migration der menschlichen dermalen Fibroblasten Neugeborenen (hDFn), dargestellt durch einen statistisch niedrigere AUC-Wert, im Vergleich zu allen anderen Behandlungsgruppen, verwenden eine einfache ANOVA mit einem Tukey post Hoc Anpassung (p &lt; 0,05). Statistische Unterschiede sind durch den Buchstaben "A" und "B", die gewonnen wurden, durch den Einsatz von kompakten Brief Anzeigemethode in R-Programm vertreten. Behandlungen, die keinen gemeinsamen Brief Teilen sind statistisch signifikant voneinander (p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Diese Studie konzentriert sich auf eine in-vitro- Modell der Wunde heilende (Scratch Assay) als Mechanismus zur Bestimmung wie Umweltschadstoffe wie Arsen Einfluss zelluläre Migration. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser in Vitro Assay schnelle und frühzeitige Hinweise auf Änderungen an zelluläre Migration vor dem in-Vivo -Experimente bietet.

In-vitro- Kratzen Sie Assay veranschaulichen Auswirkungen von Arsen auf Haut Zellwanderung

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

Zelluläre Migration ist ein kritischer Wundheilungsprozess, der das Ergebnis einer heilenden Wunde drastisch verändern kann. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die Wirkung verschiedener Verbindungen auf die zelluläre Migration während der Wundheilung besser zu verstehen. Was oft zu gezielten Behandlungsstrategien für die klinische Medizin führen kann.Der Scratch-Assay ist ein kostengünstiger und hochdurchsatzhoher Ansatz zur Generierung aussagekräftiger Wundheilungsdaten vor kostspieligen und zeitintensiven In-vivo-Tests. Der Kratztest als Methode ist besonders bei Wundheilungsanwendungen relevant. Am spezifischsten die Haut.Der Test ist jedoch wirklich ein Migrationstest und könnte auf jeden Zelltyp angewendet werden, bei dem die Migration von Zellen für die Messung oder Erfassung von Interesse ist. Ähnlich wie klassische Zell- und Gewebekultur, Standard-Operationsverfahren, Training, Technik und Praxis, Praxis, Praxis. Diese sind der Schlüssel zum Erfolg mit dem Scratch-Assay.Das Verfahren wird Nathan Cruz, ein Master-Student, und Oscar Lujan, ein Student des Bachelor-Studiums, demonstrieren. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie den Biosafety II Schrank mit einer 70%isopropyl wässrigen Lösung vor, um ein Sanitärtuch durchzuführen, beginnend an der Rückseite und Seitenwände, und bis zur Grundplatte zu arbeiten. Wischen Sie auch alle Materialien ab, die im Test verwendet werden, bevor Sie sie in den Schrank legen.Als nächstes erhalten Sie Fläschchen mit der gewünschten kryokonservierten Zelllinie und legen Sie eines in ein ein Zentimeter tiefes Wasserbad bei 37 Grad Celsius, um aufzutauen. Fügen Sie 10 Milliliter Medium mit 10%FBS in einen T75 Gewebekulturkolben ergänzt. Öffnen Sie die Durchstechflasche mit dem Zellstock, und saugen Sie die Lösung sorgfältig an.Dann übertragen Sie die Zellen in den T75-Kolben. Entfernen Sie einen Milliliter Medien aus dem Kolben, und übertragen Sie ihn wieder in die Durchstechflasche, und übertragen Sie ihn dann wieder in den Kolben, um die Zellausbeute aus der Durchstechflasche zu maximieren. Ziehen Sie die Kappe des Kolbens fest und schaukeln Sie ihn sanft, um die Zellen in Suspension gleichmäßig über die gesamte Oberfläche zu verteilen.Danach beschriften Sie den Kolben mit den hier gezeigten Informationen und legen ihn 72 Stunden lang in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Rufen Sie zunächst den Gewebekulturkolben aus dem Inkubator ab, und beobachten Sie die im Textprotokoll beschriebenen haftenden Zellen. Saugen Sie das gesamte Medienvolumen aus dem Kolben und übertragen Sie es in einen Abfallbehälter.Fügen Sie dem Kolben fünf Milliliter ausgewogene Salzlösung hinzu und schaukeln Sie ihn sanft, um überschüssige Medien, abgestorbene Zellen oder Abfallprodukte auszuspülen. Dann das gesamte Volumen der Salzlösung aus dem Kolben entfernen und in einen Abfallbehälter entsorgen. Als nächstes fügen Sie dem Kolben zwei Milliliter Trypsin hinzu und schaukeln Sie ihn sanft, um das Enzym über die haftenden Zellen zu verteilen.Stellen Sie sicher, dass die anhantibe Oberfläche vollständig gesättigt ist, und legen Sie den Gewebekolben für zwei bis drei Minuten in den Inkubator. Tippen Sie danach drei- bis fünfmal vorsichtig auf die Seite des Kolbens, um die Zellablösung zu erleichtern. Wischen Sie den Kolben mit 70% Alkohol ab und legen Sie ihn in den Biosicherheitsschrank.Fügen Sie dem Gewebekolben fünf Milliliter Stoffmedien hinzu, um die Enzymsubstratreaktion zu stoppen. Das gesamte Flüssigkeitsvolumen aus dem Kolben absaugen und in ein steriles 15-Milliliter-Konusrohr geben. Zentrifuge bei 200 mal g und bei 25 Grad Celsius für fünf Minuten.Verwenden Sie dann 70% Alkohol, um die Röhre mit den pelletierten Zellen abzuwischen und in den Biosicherheitsschrank zu legen. Pipette aus dem Medium, hinterlässt etwa 250 Mikroliter Flüssigkeit mit dem Zellpellet. Führen Sie den Boden des konischen Rohres über die Durchstechflasche eines Mikrozentrifugenrohrgestells, um eine schnelle Vibration zu erzeugen und das Zellpellet zu stören und wieder aufzuhängen.Wenn die neue Zelllösung korrekt abgeschlossen ist, erscheint sie als trübe Mischung ohne verbleibendes Pellet. Fügen Sie der Zellresuspension zwei Milliliter Medien hinzu. Pipette die Zellen sanft auf und ab der Seite des Rohres 20 Mal, um alle Klumpen zu brechen.Und zeichnen Sie das gesamte Zellsuspensionsvolumen auf. Als nächstes verwenden Sie eine sterile Pipette, um 20 Mikroliter Trypan-Blau-Lager zu einem leeren Brunnen einer 96-Well-Platte hinzuzufügen. Mit einer sterilen Pipettenspitze 20 Mikroliter Zellstock aus dem 15-Milliliter-Rohr in den Brunnen mit der Trypan-Blaulösung geben.Rohrleitung sanft, um den Inhalt zu mischen und übertragen 10 Mikroliter der Mischung zwischen dem Deckel-Schlupf und der Zählkammer auf einem Hämozytometer. Zählen Sie nur die Zellen in der Mitte und vier Eckquadrate, und zählen Sie sowohl die Gesamtzellenzahl als auch die nicht lebensfähige Zellzahl für die fünf identifizierten Quadrate separat. Markieren Sie nach der Berechnung der lebensfähigen Zellzahl eine horizontale Linie über den Boden einer 12-Well-Platte, um während der Bildgebung als Referenzzeichen zu dienen.Verdünnen Sie den Zellbestand mit Medien auf eine Dichte von 19.000 Zellen pro Milliliter. Dann säen Sie jeden Brunnen der 12-Well-Platte mit einem Milliliter des verdünnten Zellbestandes, mischen Sie den Zellstock regelmäßig, um eine gleichmäßige Zellaussaat über alle 12 Brunnen zu gewährleisten. Beschriften Sie jede Platte mit den hier gezeigten Informationen.Und legen Sie es in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, bis die Zellen zu 100% Zusammenfluss wachsen. Holen Sie sich eine 12-Well-Platte mit Zellen aus dem Inkubator. Beobachten Sie mit einem Mikroskop mit einem 10-fachen Objektiv die Zellen und bestimmen Sie den Zusammenfluss in jedem Brunnen.Als nächstes können Sie die Wachstumsmedien aus jedem Brunnen ansaugen und entsorgen. Montieren Sie einen P200 Pipetter mit einer 1-200 Mikroliter sterilen Spitze. Gleiten Sie in jedem Brunnen die Pipettenspitze über die Zelloberfläche von der 12:00-Position bis zum 6:00-Standort, um eine Kratzer-Mock-Wunde zu erzeugen.Spülen Sie jeden Brunnen mit einem Milliliter ausgewogener Salzlösung, um überschüssigen Schmutz und Zellklumpen zu entfernen. Schaukeln Sie die Platte von Seite zu Seite, um das Waschen zu erleichtern. Dann die ausgewogene Salzlösung von jedem Brunnen entfernen und entsorgen.Mit einem P1000 Pipetter mit einer 1.000-Mikroliter-Spitze 1.000 Mikroliter aus den vorbereiteten Arsenbeständen in Brunnen geben, die zufällig mit einer Behandlungsgruppe zugeordnet wurden. Verwenden Sie eine neue Pipettenspitze für jeden Brunnen, und notieren Sie die Zeit, zu der die Behandlungen hinzugefügt werden. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Um die Platten abzubilden, erfassen Sie Bilder von jedem Brunnen bei 10-facher Objektivvergrößerung alle vier Stunden über einen Zeitraum von 24 Stunden. Verweisen Sie auf die zuvor auf der Unterseite der Platte gezeichnete Linie, um die gleiche Position entlang des Kratzers in jedem Bohrwert an jedem Zeitpunkt abzubilden. In dieser Studie wird ein In-vivo-Scratch-Test-Test verwendet, um die Auswirkungen von Arsen auf die Zellmigration zu beobachten.In allen Behandlungsgruppen werden gleichmäßige Kratzer mit einer mittleren Kratzbreite von etwa 0,8 Millimetern beobachtet. Die Kontrollzellen zeigen nach 20 Stunden einen vollständig geheilten Kratzer. Die beiden Arsengruppen zeigen diesen Heilungsgrad nicht.Mit der 10-Mikromolaren-Behandlung, die den Verschluss insgesamt für 24 Stunden hemmt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Vorhandensein von Arsen die zelluläre Migration verlangsamt. Die während des Tests aufgenommenen Rohbilder werden mit automatisierter Software analysiert, um die Wundbreite zu messen, dann den prozentualen Verschluss zu berechnen und schließlich die Fläche unter der Kurve zu berechnen.Die 10-Mikromolar-Behandlungsgruppe zeigt eine statistisch verlangsamte zelluläre Migration von humanen neonatalen dermalen Fibroblasten im Vergleich zu allen anderen Behandlungsgruppen. Es ist wichtig, diese Technik gründlich zu üben, um die Konsistenz beim Kratzen der Zellen zu erhöhen. Unbeabsichtigte Variabilität zwischen Assays kann Daten möglicherweise verzerren und Schlussfolgerungen ändern.Weitere molekulare Techniken wie quantitative Polymerase-Kettenreaktion und enzymgebundene Immunsorbent-Assays können nach dem Kratzer-Assay eingesetzt werden, um Botensignale und Proteine zu identifizieren, die das Ziel für Veränderungen der Zellmigration sein können, die im Test beobachtet wurden. Dieser Test hat zum Verständnis der Forscher über Krebsmetastasen, neue aufkommende Krebstherapien, Stammzellen und regenerative Medizin und viele andere wissenschaftliche Meilensteine beigetragen.

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Forschung

JoVE Journal

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Umwelt

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Hier stellen wir ein Protokoll für einen In-vitro-Scratch-Assay mit primären Fibroblasten und für einen in vivo Hautwundheilungstest bei Mäusen vor. Beide Assays sind einfache Methoden zur Beurteilung der In-vitro- und In-vivo-Wundheilung.

Scratch Migration Assay und Dorsal Skinfold Kammer für In Vitro und In Vivo Analyse der Wundheilung

Wir präsentieren eine kostengünstige Methode zum Scratch-Migrationstest, die einen neuen Ansatz zur Bestimmung der Zellmigration ohne den Einsatz geräteintensiver Methoden bietet. Während Fibroblasten in diesem Protokoll verwendet wurden, kann es angepasst und verwendet werden, um zusätzliche Zelltypen und Einflüsse auf die Zellmigration zu untersuchen.

Ein kostengünstiger und anpassungsfähiger Scratch-Migrationstest

Durch die Einbeziehung des Interaktionserlebnisdesigns und der Analyse der Benutzeranforderungen führen wir einen innovativen Zellschaber ein, der zelluläre Wundheilungsassays in Bezug auf Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit, Praktikabilität, zelluläre Integrität und Benutzererfahrung verbessert.

Ein Tool zur automatischen Erstellung stabiler und reproduzierbarer zellfreier Lücken zur Verbesserung der Zuverlässigkeit von Zellwundheilungsassays

In dieser Arbeit werden der zweidimensionale (2D) Scratch Wound Migration Assay und der dreidimensionale (3D) Sphäroid-Sphäroide-Assay zusammen mit ihren jeweiligen nachgeschalteten Analysemethoden, einschließlich RNA-Extraktion und Immunzytochemie, als geeignete Assays zur Untersuchung der Angiogenese in vitro vorgestellt.

Untersuchung der Angiogenese auf funktioneller und molekularer Ebene durch Nutzung des Scratch Wound Migration Assay und des Spheroid Sprouting Assay

Erfahren Sie, wie der Scratch-Assay die Auswirkungen von Arsen auf die Zellmigration bei der Wundheilung untersucht. Diese kostengünstige Methode liefert wertvolle Daten vor klinischen Studien.

In-vitro- Kratzen Sie Assay veranschaulichen Auswirkungen von Arsen auf Haut Zellwanderung

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