Lipid Bilayer Experimente mit Kontakt Blase Bilayer für Patch-reckenden
16. Januar 2019
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Bildung von Lipid Bilayer mit einer Kontakt-Blase Bilayer Methode. Eine Wasser-Blase wird in einem organischen Lösungsmittel, geblasen, wobei eine Monolage an der Wasser-Öl-Grenzfläche gebildet wird. Zwei Pipetten werden manipuliert, um die Luftblasen zu einem Bilayer anzudocken.
Die Contact Bubble Bilayer-Methode ist eine alternative Technik für herkömmliche Lipid Bilayers. und diese Methode ermöglicht vielseitigere Vibrationen durch die Membran. Die CBB-Methode integriert die Vorteile der Planar Lipid Bilayer und Patch Clamp Methode.
Als Lipid-Bilayer-Technik kann ein CBB mit einer beliebigen Lipidzusammensetzung gebildet werden. Wir haben einen CBB für Einkanal-Stromaufnahmen mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis entwickelt. Diese Methode ermöglicht Verschiedene von Membranschwingungen und bietet eine riesige Typplattform zur Kanalmembranschnittstelle.
Jeder hat erlebt, wie er eine Seifenblase bläst. Ähnliche Manöver werden für die CBB-Bildung durchgeführt, indem der aufgebrachte Druck manuell verfeinert wird, anstatt durch den Mund zu blasen. Üben und genießen Sie die CBB.
Um dieses Verfahren zu dispergieren Phospholipide in Chloroform in einer gewünschten Konzentration in einem runden Bodenkolben. Legen Sie die Phospholipidlösung auf einen Drehverdampfer, der mit einer Stickstoffgasflasche verbunden ist. Drehen Sie den Kolben unter Stickstofffluss bei Raumtemperatur, bis ein dünner Phospholipidfilm erscheint.
Als nächstes legen Sie den offenen Kolben in einen Trockenkörper, der mit einer Vakuumpumpe verbunden ist. Mit der Vakuumpumpe aspirieren Sie das Innere des Trockenators für mehrere Stunden, um das Chloroform gründlich zu entfernen. Anschließend ein geeignetes Volumen elektrolytlösung in den Kolben geben und das Phospholipid aussetzen, um eine 2 Milligrmas pro Milliliter Phospholipidsuspension zu erhalten.
Sonciate die Suspension für 20 bis 30 Sekunden mit einem Bad Beschallungsmittel, um eine mehrschichtige Vesikelsuspension zu erhalten. Zur Herstellung von Proteoliposomen, die Ionenkanalproteine enthalten, fügen Sie der mehrschichtigen Vesikelsuspension eine Proteinlösung hinzu. Und beschallen Für einige Sekunden mit dem Bad Beschallungsmittel.
Um große Glaspipetten vorzubereiten, legen Sie eine Glaskapillare in einen Pipettenzieher und fertigen Sie die Mikropipette mit einer feinen verjüngten Spitze durch zweistufiges Ziehen. Dann stellen Sie die Mikropipette auf eine Mikroschmiede und kontaktieren Sie die Spitze der Mikropipette mit einem Platin-Filament im verjüngten Teil mit einem Durchmesser von 30 bis 50 Mikrometern. Das Filament kurz erhitzen und sofort ausschalten.
Mit destilliertem Wasser und Ethanol reinigen Sie die Oberfläche der Glasrutsche mit einem flachen Brunnen. Als nächstes das Silikonisierende reagenz auf den Glasschlitten auftragen und das Reagenz vollständig in der Luft trocknen lassen. Legen Sie dann die Glasrutsche auf die Bühne eines invertierten Mikroskops.
Fügen Sie 100 Mikroliter Hexadecan in den flachen Brunnen des silikonisierten Glasschlittens ein. Mit einer Tuberkulinspritze füllen Sie die Elektrolytlösung bis zur Hälfte der Länge der Mikropipette. Als nächstes stellen Sie die Mikropipette auf den Mikropipettehalter mit dem Druckanschluss, so dass die Silber/Silberchlorid-Drahtelektrode in der Pipettenelektrolytlösung einweichen kann.
Schließen Sie einen der Mikropipette-Halter an die Kopfstufe eines Patchklemmverstärkers und den anderen an den elektrischen Boden an. Anschließend einen Mikroinjektor an den Druckanschluss des Mikropipettehalters anschließen. Stellen Sie die Mikropipette mit dem Mikromanipulator an eine geeignete Position über der Stufe eines invertierten Mikroskops ein.
Um das Elektrodenversatzpotential einzustellen, legen Sie einen Mikroliter der gleichen Elektrolytlösung, mit der die Mikropipette auf der flachen Oberfläche um den flachen Brunnen des Glasschlittens gefüllt wird, um eine Elektrolytkuppel zu erzeugen. Die Spitze beider Mikropipetten in der Elektrolytkuppel einweichen. Danach stellen Sie das Elektrodenversatzpotential des Patchklemmenverstärkers ein.
Um die Liposomenlösung von der Spitze zu ziehen, fügen Sie einen Mikroliter Liposomenlösung auf die flache Oberfläche um den flachen Brunnen des Gleitglases. Als nächstes die Spitze der Mikropipette in die Liposomen-haltige Kuppel legen. Aspirieren Sie die Liposomen-haltige Lösung mit dem Mikroinjektor.
Wiederholen Sie den Vorgang für die andere Mircopipette zur Ansaugung kanalrekonstituierter Liposomen. Nun legen Sie die Mikropipette in das Hexadecan eimtin im flachen Brunnen. Blasen Sie eine Wasserblase langsam, indem Sie den Druck erhöhen, bis die Blase die gewünschte Größe erreicht, und halten Sie danach den gleichen Druck aufrecht.
Entsorgen Sie die Blase, indem Sie die Spitze durch die Öl-Luft-Schnittstelle passieren, wenn es schwierig ist, die Größe der Blase stabil zu halten. Wiederholen Sie die Prozeduren, bis zwei stabile Blasen gebildet werden. Stellen Sie einen Kontakt zwischen den beiden Blasen her.
Optimieren Sie den Druck, um die Blasengröße beizubehalten, da sich die Größe auch beim konstanten Intra-Blasendruck allmählich ändern kann. Stellen Sie das Membranpotential mit dem Patch-Anspruchsverstärker auf den entsprechenden Wert ein und warten Sie, bis der Kanalstrom entsteht. Für eine stabile Lipid-Bilayer-Bildung ist es wichtig, die Blotter zu reinigen.
Glaskapillar- oder Pipettenzubereitungen sollten gründlich gewaschen werden und eine Kontamination durch die Waschmittelmoleküle vermeiden. Nachdem die CBB die Kanalmoleküle entweder in wässriger Lösung oder im Liposom gebildet hatten, wurden sie innerhalb von wenigen bis Dutzenden Minuten spontan in die Bilayer eingeführt. Einfügungen der Kanäle wurden durch die schrittweise Erhöhung der Stromamplitude unter dem aufgebrachten Membranpotential bestätigt.
Ein durch die CBB-Methode gebildeter Doppelschichtkannin kann in zwei Monolayer zerfallen werden. Der pTB-Kanalstrom trat unmittelbar nach dem Anbringen der beiden Monolayer auf. Und der Strom wurde größer, als die Kontaktaufnahme die Amplitude des Stromes mit der Trennbefestigungsmanipulation des CBB synchronisiert wurde.
Wenn die Anzahl der Blasen ausblasen, nimmt die Lipidkonzentration in der wässrigen Lösung ab und die Monoschicht wird nicht gebildet. Dann versuchen, Druck auf Liposomenabschnitt zu entlasten. Sobald die CBB-Bildung und Kanalrekonstitution etabliert sind, können Sie versuchen, Zusammensetzungen der wässrigen Lösung und Membran durch Überprofusion oder Injektion einer hydrophilen oder hydrophoben Substanzen zu variieren.
Die CBB-Methode hat vielseitige Möglichkeiten eröffnet, Channel-Membran-Wechselspiele zu erforschen.
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Überblick
Diese Studie stellt die Contact Bubble Bilayer (CBB) Methode zur Bildung von Lipiddoppelschichten vor und bietet eine innovative Alternative zu herkömmlichen Techniken. Die Methode ermöglicht vielseitige Membranschwingungen und Aufzeichnungen mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis von Einzelkanalströmen, was die Untersuchung von Kanal-Membran-Interaktionen verbessert.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biophysik
- Elektrophysiologie
- Lipidmembrantechnologie
Hintergrund
- Lipiddoppelschichten sind für die Untersuchung von Membranproteinen lebenswichtig.
- Die herkömmlichen Methoden haben Einschränkungen in Bezug auf Flexibilität und Stabilität.
- Die CBB-Methode vereint die Vorteile von planaren Lipiddoppelschichten und Patch-Clamp-Techniken.
- Diese Technik ermöglicht hochwertige Aufzeichnungen von Ionenkanalaktivitäten.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer robusten Methode zur Lipiddoppelschichtbildung unter Verwendung eines Kontaktblasen-Ansatzes.
- Ermöglichung von Einzelkanalaufnahmen mit verbesserter Qualität.
- Erforschung von Membrandynamiken und Kanal-Membran-Interaktionen.
Verwendete Methoden
- Die CBB-Methode nutzt die kontrollierte Manipulation von Wasserblasen in einem organischen Lösungsmittel, um Doppelschichten zu erzeugen.
- Phospholipide werden vorbereitet und sonifiziert, um mehrschichtige Vesikel zu bilden, gefolgt von der Einarbeitung von Ionenkanalproteinen.
- Mikropipetten werden für die präzise Applikation und Stabilisierung von Blasen während der Doppelschichtbildung hergestellt.
- Experimentelle Einrichtungen umfassen Patch-Clamp-Verstärker zur Überwachung von Ionenkanalströmen nach der Doppelschichtbildung.
Hauptergebnisse
- Die CBB-Methode unterstützt effektiv die Einfügung von Kanalproteinen in Doppelschichten, was durch Änderungen in der Stromamplitude bestätigt wurde.
- Es wurden stabile Doppelschichten gebildet, die die Fähigkeit zur Aufzeichnung von Einzelkanalströmen demonstrieren.
- Die Methode zeigte, dass Anpassungen der Blasengröße die Membranstabilität und Stromkontinuität beeinflussen können.
Schlussfolgerungen
- Die CBB-Methode stellt einen bedeutenden Fortschritt in der Lipiddoppelschichtbildung dar und ermöglicht vielseitige Anwendungen in elektrophysiologischen Studien.
- Dieser innovative Ansatz verbessert unser Verständnis der Kanal-Membran-Dynamik.
- Die Ergebnisse unterstreichen das Potenzial zur Anpassung von Lipiddoppelschichttechnologien für verschiedene experimentelle Bedingungen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
The Contact Bubble Bilayer (CBB) method addresses a key challenge in ion channel research by enabling high signal-to-noise ratio recordings while allowing precise control over lipid composition and membrane mechanics. This capability supports mechanistic de-risking of therapeutic targets by clarifying channel-membrane interactions under physiologically relevant conditions. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing a reproducible platform for functional validation of ion channel targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by studying ion channel function in defined lipid environments.
- Operational Value: Supports functional target validation through reproducible single-channel current measurements with low electrical noise.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by elucidating how lipid composition modulates channel activity and stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated lipid bilayer systems for downstream compound screening by incorporating channel-reconstituted liposomes.
- Operational Value: Enables assay standardization via controlled bubble formation and consistent bilayer renewal.
- Scalability: Supports platform reuse through repeated CBB formation and disruption cycles.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains relevance from discovery through preclinical work by modeling disease-relevant lipid compositions.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of how membrane perturbations affect channel function, informing safety and efficacy predictions.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lipid-dependent channel phenotypes that may correlate with clinical responses.
Pipeline & Workflow Integration
The CBB method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing a lipid-controllable platform for ion channel characterization prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled variation of membrane lipid composition.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible bilayer formation and stable ion channel incorporation.
- Analytics: Provides quantitative single-channel current readouts that allow comparison of channel behavior under different conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling study of channel-membrane interactions in disease-relevant lipid environments.
- Enterprise Reuse: Functions as a renewable capability rather than a single-use technique, supporting sustained use across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in channel-membrane interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled bubble size maintenance and bilayer renewal.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable functional data on ion channel targets early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of ion channel programs based on validated membrane-dependent activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid handling, electrophysiology, and microfluidic manipulation.
- Depends on patch-clamp amplifiers, glass capillary pullers, and microinjectors for bubble formation and pressure control.
- Necessitates cross-team standardization of lipid preparation, bubble size control, and cleaning protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different ion channel types or lipid mixtures.
- Includes practical limitations such as the need for meticulous bubble size maintenance and contamination avoidance during pipette preparation.
