Name: Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Erfahren Sie die Echtzeit-Erkennung von Tumorzell-Apoptose durch CD8+ T-Zellen zur Untersuchung immunsuppressiver Funktionen tumorinfiltrierender myeloider Zellen. Diese Methode ermöglicht hochsensitive Analysen für die Krebsimmuntherapie.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese Methode basiert auf zwei separaten Kokultur Schritten: Co Kultivierung CD8-+ T Zellen mit potenziellen Suppressor-Zellen und Co Kultivierung der "Pre-bedingt" CD8-+ T Zellen mit Tumor Zielzellen (Abbildung 1). Der erste Kokultur Schritt ist ganz ähnlich wie für CD8+ T Zell-Proliferation Assays häufig verwendet, um die Auswirkungen von Suppressor-Zellen auf CD8 ermitteln+ T-Zell-Funktion. T-Zell-Proliferation korreliert jedoch nicht immer mit ihrer Zytotoxizität. Zum Beispiel haben wir gefunden, dass Kokultur mit M-MDSCs oder MAMs erhöht anstatt reduzierte Proliferation von CD8+ T-Zellen in Anwesenheit von CD3/CD28 aktivieren Antikörper (ergänzende Abbildung 3), während diese CD8 Pre konditioniert+ T-Zellen nachgewiesen reduziert Zytotoxizität gegen Krebszellen (Abbildung 4, Bild 5, Bild 6). Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Bewertung der funktionelle Aktivität, belegt durch Ziel Krebs Zelle Apoptosis, angeboten von diesem CD8+ T-Zell-Zytotoxizität-Assay.
In diesem Test, wir haben festgestellt, dass CD8+ T Zellen erfordert ca. 15 h Kokultur um maximale Apoptose der E0771-LG Maus Mamma Tumorzellen (Abbildung 5) zu induzieren. Diese Verzögerung möglicherweise aufgrund der Verzögerung zwischen Erstkontakt der Effektorzellen mit Ziele sowie begleitende immun Synapse Bildung und Zeitaufwand induzieren Apoptotic Signale in Ziele gemessen durch Aktivierung von Caspase-3 (ergänzende Movie 1 ). Wir auch identifiziert, die die Anzahl der apoptotischen Tumorzellen nach 24 h, ein Plateau erreicht, das ist wahrscheinlich durch die Beseitigung der Ziele von T-Zellen und/oder Verlust von Fluoreszenzsignal aus abgestorbenen Zellen. Diese Fähigkeit, die Zeit der Höhepunkt Apoptose zu identifizieren ist ein großer Vorteil von diesem Test, da Bestimmung einer optimalen Zeitpunkt für entsprechende Vergleiche zwischen verschiedenen Bedingungen wichtig. In unserem Fall zum Beispiel der Unterschied in der Zytotoxizität zwischen Steuerung CD8+ T Zellen und CD8 MDSC/MAM-gebildete+ T Zellen war viel größer im Vergleich zu 72 h (Abbildung 5) 15-18 Uhr, und so ein Endpunkt experimentieren mit einem 72 h Inkubationszeit würden zu irreführende Ergebnissen führen.
Diese Methode ermöglicht auch die Visualisierung der Echtzeit-Effektor-Zielzelle Interaktion, die bessere Einblicke in den Mechanismus begrenzt Zytotoxizität von CD8 bieten würde+ T Zellen vorab mit Suppressor-Zellen inkubiert. Zum Beispiel, wir beobachtet, dass CD8+ T Zellen, die bereits mit M-MDSCs oder MAMs inkubiert begegnet und interagiert mit Ziel Tumorzellen aber nicht immer induzieren Apoptose (ergänzende Movie 4, ergänzende Film 5 ergänzende Film 6). Obwohl wir dieses Ereignis nicht quantifizieren, wäre es möglich und interessant zu quantifizieren und den Anteil von Begegnungen und ihre Interaktionszeit im Zusammenhang mit Apoptose-Induktion zu vergleichen. Ein weiterer großer Vorteil ist, dass diese Methode eine kleine Anzahl von Zellen (z.B. 1 x 103 des Ziels) und 4 x 103 Effektor Zellen pro Bohrloch erfordert. In der Tat kann dieses Protokoll für das 384-Well-Plattenformat weiter miniaturisiert werden, falls gewünscht. Daher eignet sich dieser Assay für Hochdurchsatz-Screening und Experimente wo Zellzahlen sind beschränkt, wie z. B. in-vitro- Tests mit kostbaren Zellen von in-vivo und ex Vivo Proben abgeleitet.
Auf der anderen Seite ist eine Einschränkung des aktuellen Tests das Vorhandensein einer beträchtlichen Anzahl von Toten Effektorzellen in einigen Bedingungen. Zur Erhöhung der Genauigkeit bei der Unterscheidung von Apoptose von Krebszellen von der Effektor CD8+ T-Zellen, die Kerne des Ziels, die Zellen gekennzeichnet sind und eine Zellkerne, die Datenanalyse in diesem Größenbeschränkung (das schließt Effektorzellen) beantragt wird Assay (Abbildung 2). Es gibt jedoch einige Fälle wo Überlagerung der Aggregate (grün) apoptotische CD8+ T auf Zielzellen Krebs-apoptotische Zellen, die die Ergebnisse verwirren kann. Diese Einschränkung kann entgegengewirkt werden, indem Verwendung eine tote Zelle entfernen Spalte auf Effektor Zellen vor dem Co Kultur mit Ziel Tumorzellen, vorausgesetzt, dass Effektorzellen in ausreichender Zahl zur Verfügung stehen. Bei komplexer Mikroskopiesysteme, kann es auch sein kann das falsche positive Signal durch Kennzeichnung der Effektor CD8+ T-Zellen mit einem Fluorophor unterscheidet sich von der Ziel-Zellkerne und das Fluorogenic Caspase-3 Substrat.
So weit, dieses Protokoll verwendet worden, um die Antigen-spezifische Aktivierung des CD8 untersuchen+ T Zellen. Obwohl MDSCs und TAMs in den Tumor Mikroumgebung T Zellfunktionen durch Antigen-spezifische Mechanismen unterdrücken, unterdrücken MDSCs in den peripheren lymphatischen Geweben T-Zell-Antworten in ein Antigen spezifisch18. Zu unterdrückende Immunfunktionen solche Zelltypen, untersuchen, eine in-vitro-Vermehrung-Assay mit CD8 Zellen+ T von OT-1 transgene Mäuse wird häufig verwendet. In diesem Test die OT-1 T-Zellen (Ausdruck von Ovalbumin (OVA)-spezifischen T-Zell-Rezeptor) Co kultiviert mit Suppressor MDSCs in Anwesenheit von OVA Peptide, das gilt für die erste Kultur in unseren Zytotoxizität Assay (dh., Aktivierung der T-Zellen das Vorhandensein oder Fehlen der Unterdrücker). Es ist auch möglich, manipulieren Krebszellen auszudrücken, OVA, die Antigen-spezifische Krebs Zelle Tötung von OT-1 T-Zellen induzieren können. Daher wird der Test auch Untersuchung der MAM/MDSC-vermittelten Unterdrückung der Antigen-spezifischen T-Zell-Aktivierung aktiviert werden. Es ist auch möglich, die Probe um menschliche Zellen zu untersuchen, wie Aktivierung Antikörper gegen menschliche CD3 und CD28 im Handel erhältlich sind, und ein Protokoll zum menschlichen TAMs von klinischen Proben isolieren etablierten19 wurdeanzuwenden.
Kollektiv, dieser Assay ist sehr vielseitig und kann verwendet werden, um die Zytotoxizität von anderen Immunzellen Arten zu untersuchen. Derzeit in unseren Labors, es wird erweitert um Zelle Antigen-abhängige Zytotoxizität unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen und durchleuchtet auch für hohen Durchsatz entwickelt.

Es ist bekannt, dass CD8+ T Zellen können Tumorzellen zu beseitigen, wenn sie ihre volle Zytotoxizität ausüben. Nach der Aktivierung der T-Zell-Rezeptor (TCR), CD8+ T Zellen vermehren und zytotoxische Effektorzellen differenzieren. Die erweiterte und aktivierte CD8+ T Zellen sezernieren zytotoxischen Granulat, einschließlich Perforin und Granzyme, die in Zielzellen überführt und verschiedene lytische Wege zu initiieren, wie z. B. Caspase-3 vermittelte Apoptose1. CD8+ T Zellen können auch induzieren Tumor Zelle Apoptosis durch die Aktivierung der Rezeptoren auf den Zielzellen, wie Rezeptoren für Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), erste Apoptose signal Liganden (FasL) oder TNF-related Apoptose induzierenden Liganden (TRAIL). Darüber hinaus die aktivierte CD8+ T Zellen sezernieren Interferon-γ (IFN-γ), die Tumor-Zell-Proliferation zu unterdrücken und erhöhen die Empfindlichkeit der Tumorzellen zu CD8+ T-Zellen über die Up-Verordnung FasL Rezeptor1. Angesichts des Potenzials für CD8+ T Tumor Tötung Fähigkeit, mehrere Strategien zur Förderung ihrer Zytotoxizität (z. B. Checkpoint-Inhibitoren, Krebs-Impfung und Adoptiveltern Übertragung von Chimären Antigen-Rezeptor (Auto) mit dem Ausdruck T-Zellen) haben sich etabliert und gezeigte signifikante therapeutische Wirkung auf bestimmte Arten von Krebs2. Sammeln Beweise zeigen jedoch, dass Tumor infiltrieren wie regulatorische T-Zellen Immunzellen, myeloische abgeleitet Suppressor Zellen (MDSCs) und Tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs) können CD8 unterdrücken+ T Handy-Funktionen und Wirksamkeit einschränken Immuntherapien3,4,5. Um solche Immuntherapien zu verbessern, ist es wichtig zu verstehen, wie immun Suppressor Zellen Grenze CD8+ T-Zell-Zytotoxizität. Die Identifizierung von CD8+ T Zelle Unterdrückungsmechanismen sowie druggable Ziele zu überwinden erfordert die Entwicklung und Nutzung von in-vitro-Untersuchungen.
Der Gold-Standard-Methode zur Messung der CD8+ T-Zell-Zytotoxizität ist Chrom Release Assays in die Zellen die Freisetzung von radioaktiven Sonde (51Cr), vom Ziel, sind durch CD8 lysiert+ T-Zellen, ist bestimmt6. Dieser Test hat jedoch mehrere Nachteile einschließlich relativ geringe Empfindlichkeit, hohe Hintergrund, Unfähigkeit zur Erkennung von frühen Apoptotic Ereignisse, gefährliche Entsorgungsprobleme und begrenzte Kompatibilität mit automatisierten Handhabung von Flüssigkeiten und Erkennung zu unterstützen Anwendungen mit höheren Durchsatz. Eine weitere gängige Methode ist Flow durchflusszytometrischen Analyse in die Apoptose von Tumorzellen Ziel von annexin V verbindlich7erkannt wird. In diesem Test ist es möglich, andere Parameter wie Ziel Zelltod mit Propidium Jodid (PI) oder 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) und Effektor-Zell-Aktivierung von CD107a oder CD69 Ausdruck, neben der Apoptose in Zielzellen7 angegebenen erkennen . Dieser Assay erfordert jedoch eine große Anzahl von Suppressor-Zellen im Vergleich zu der Chrom-Release-Assay. Es erfordert auch die Ablösung und Aufschlüsselung der anhaftende Zielzellen und dies kann die Ergebnisse beeinflussen. In der Tat, das Chrom release Assay oder Fluss durchflusszytometrischen Assay werden nicht häufig verwendet, um Suppressor Cell Effekte auf T-Zell-Funktionen zu untersuchen. Stattdessen die Messung der T-Zell-Proliferation gekennzeichnet durch Verdünnung von einem Fluoreszenzfarbstoff (z. B. CFSE) vorinstalliert in T-Zellen häufig verwendet wird, um die Hemmung der CD8 bewerten+ T-Zellfunktion durch Suppressor-Zellen. Nachweis von IFN-γ Produktion von kultivierten T-Zellen ist ein weiterer standard-Methode zur Bewertung der Auswirkungen von Suppressor-Zellen auf T-Zell-Aktivierung-8,-9. Jedoch die Ergebnisse aus diesen Tests nicht unbedingt der Zielzelle töten Fähigkeit der CD8 korrelieren+ T Zellen.
Wir stellen Ihnen hier einen alternative funktionelle Assay zur Bewertung der Auswirkungen von Suppressor-Zellen, vor allem Makrophagen im metastasierten Tumoren auf die Zytotoxizität von CD8+ T Zellen. Diese Methode bestimmt Zytotoxizität von CD8+ T Zellen, Pre kultiviert mit oder ohne die Suppressor-Zellen in Anwesenheit von Anti-CD3/CD28 aktivierende Antikörper, durch das Erkennen von Tumor Zelle Apoptosis, gekennzeichnet durch Fluoreszenz von einem Fluorogenic Caspase-3 Substrat mit6 automatisierten Zeitraffer-Mikroskopie (Abbildung 1). Dieses Protokoll hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden; Es erfordert nur eine kleine Anzahl von Zellen, ermöglicht eine Erfassung von anhaftenden Tumor Zelltod mit hoher Empfindlichkeit, kann Bild Echtzeit-Effektor-to-Target-Interaktion und ist offen für Hochdurchsatz-Screening.
In diesem Protokoll sind Metastasen-assoziierten Makrophagen (MAMs) und ihre Vorläuferzellen monozytären-MDSCs (M-MDSCs) von metastatischen Tumoren in Mäusen isoliert als Suppressor-Zellen verwendet. In Maus-Modellen von metastasierendem Brustkrebs, eine eindeutige Bevölkerung von Makrophagen gekennzeichnet als F4/80hochLy6G–CD11bhoheLy6Cniedrigen reichert sich in der Lunge mit metastasierten Tumoren. Diese Makrophagen Bevölkerung ist selten in der normalen Lunge gefunden und so genannte Metastasen-assoziierten Makrophagen (MAMs)10. In diese Maus-Modellen anderen myeloischen Zelle Bevölkerung, definiert als F4/80hochLy6G–CD11bhoheLy6Chohe, auch sammelt sich überwiegend in der Metastasen Lunge, wo es gibt Anlass zu MAMs11. Basierend auf ihre Eigenschaften, können die CD11bhoheLy6Chohe MAM Vorläuferzellen M-MDSCs12darstellen.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Zellkulturplatte</td><td>Freiner Bio-One</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>5 ml-Plystyrol-Rundbodenröhrchen</td><td>FALCON</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturplatte (rund </td><td>Co-Kultur</td><td></td><td>von CD8+T-Zellen mit sortierten myeloischen Zellen</td></tr><tr><td>96-Well-Platte (flacher Boden)</td><td>Nunc</td><td>165305</td><td>Co-Kultur von CD8+T-Zellen mit Zielzellen für den Zytotoxizitätsassay</td></tr><tr><td>AF647 Anti-Maus F4/80 Antikörper</td><td>BIO-RAD</td><td>MCA497A647</td><td>Klon: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 &mu; L/1x10^6 Zellen</td></tr><tr><td>AlexaFluor700 Anti-Maus CD8 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>100730</td><td>Klon: 53-6.7, Los#: B205738, 0.5 &mu; L/1x10^6 Zellen</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD28 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>102111</td><td>Aktivierung von isolierten CD8+ T-Zellen, Klon: 37.51, Lot#: B256340</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD3e Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td>Aktivierung von isolierten CD8+ T-Zellen, Klon: 145-2C11, Los#: B233720</td></tr><tr><td>APC Anti-Maus CD3 Antikörper</td><td>Biolegend 100236</td><td></td><td>Klon: 17A2, Los#: B198730, 0,5 &mu; L/1x10^6 Zellen</td></tr><tr><td>APC/Cy7 Anti-Maus Ly6C Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>128026</td><td>Klon: HK1.4, Los#: B248351, 1 &mu; L/1x10^6 Zellen</td></tr><tr><td>Rinderserum Albmin</td><td>Sigma</td><td>A1470-100G</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb (100&mu; m Nylon)</td><td>FALCON</td><td>352360</td><td>Zum Zerschlagen der Milz</td></tr><tr><td>Zellsieb (40&mu; m Nylon)</td><td>FALCON</td><td>352340</td><td>Zur Filterung der Lungenverdauung</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biolegend</td><td>422801</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s modifizierter Eagle&prime; s Medium</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Maus CD8+ T-Zell-Isolationskit</td><td>StemCell Technologies</td><td>19853</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti-Maus CD4 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>100406</td><td>Klon: GK1.5, Los#: B179194, 0,5 &mu; L/1x10^6 Zellen</td></tr><tr><td>Geltrex gebrauchsfertig</td><td>Gibco</td><td>A1596-01</td><td>Beschichtung der 96-Well-Platten für den Zytotoxizitätsassay</td></tr><tr><td>IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagenz</td><td>Essen BioScience</td><td>4476</td><td>Lenti virale Partikel kodieren mKate2</td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td>Detector (Fluoreszenzmikroskop)</td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM 2018A</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td>Analysesoftware</td></tr><tr><td>L-Glutamin (100X)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>Lungendissoziationskit</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-927</td><td>Herstellung einer Einzelzellsuspension aus der tumortragenden Lunge</td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td><td>Lonza</td><td>LT07-318</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäure (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>NucView488</td><td>Biotium</td><td>10403</td><td>Fluoregene Caspase-3-Substrat</td></tr><tr><td>PE Anti-Maus Ly6G Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>127607</td><td>Klon: 1A8, Los#: B258704, 0,5 &mu; L/1x10^6 Zellen</td></tr><tr><td>PE/Cy7 Anti-Maus CD11b Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>Klon: M1/70, Los#: B249268, 0,5 &mu; L/1x10^6 Zellen</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Penicillin Streptomycin für die Primärkultur von Zellen</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 Anti-Maus CD45 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>103132</td><td>Klon: 30-F11, Los#: B249564, 0,5 &mu; L/1x10^6 Zellen</td></tr><tr><td>Polybren (Hexadimethrinbromid)</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Erythrozyten-Lysepuffer (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus IL-2</td><td>Peprotech</td><td>212-12</td><td>Aktivierung von isolierten CD8+ T-Zellen</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100X)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>TruStain fcX (Anti-Maus CD16/32) Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>101320<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">&nbsp;: Nikon 10X Objektiv (Auflösung 1,22 & Mikro; m) &nbsp;: Anregung im grünen Kanal: 440 - 480 nm &nbsp;: Emission im grünen Kanal: 504 - 544 nm &nbsp;: Anregung im roten Kanal: 565-605 nm &nbsp;: Emission im roten Kanal: 625 - 705 nm</td></tr></tbody></table>

echtzeit-erkennung von in vitro tumor zelle apoptose induziert durch cd8+ t-zellen, unterdrückende immunfunktionen tumor infiltrieren myeloische zellen zu studieren

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Potenzierung der Tumor-Tötung-Fähigkeit der CD8+ T Zellen in Tumoren, zusammen mit ihre effiziente Tumor Infiltration, ist ein zentrales Element der erfolgreichen Immuntherapien. Mehrere Studien haben gezeigt, dass eindringende myeloische Tumorzellen (z. B. myeloische abgeleitet Suppressor-Zellen (MDSCs) und Tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs)) Zytotoxizität von CD8 unterdrücken+ T-Zellen im Tumor Mikroumgebung und das targeting Diese regulatorischen myeloischen Zellen können Immuntherapien verbessern. Hier präsentieren wir eine in-vitro-Testsystem um immun unterdrückende Wirkung von monozytären MDSCs und TAMs auf die Tumor-Tötung-Fähigkeit der CD8 bewerten+ T Zellen. Zu diesem Zweck kultiviert wir zunächst naiv Milz CD8+ T-Zellen mit Anti-CD3/CD28 aktivierende Antikörper in das Vorhandensein oder Fehlen von Suppressor-Zellen und dann Co kultiviert die voraktivierten T-Zellen mit Krebszellen in Anwesenheit eines Fluorogenic Caspase-3 Substrat. Fluoreszenz vom Substrat in Krebszellen wurde durch Echtzeit-Fluoreszenz-Mikroskopie als Indikator für T-Zellen induziert Tumor Zellapoptose gefunden. In diesem Test können wir erfolgreich die Erhöhung der Tumor Zelle Apoptose durch CD8 erkennen+ T Zellen und ihre Unterdrückung durch Vorkultur mit TAMs oder MDSCs. Diese funktionelle Assay eignet sich für die Untersuchung von CD8+ T Zelle Unterdrückungsmechanismen durch regulatorische myeloische Zellen und identifizierenden druggable Ziele, sie über Hochdurchsatz-Screening zu überwinden.

Diese Methode basiert auf einfachen Kokulturen von Krebszellen mit Effektor CD8+ T Zellen, die mit oder ohne Suppressor-Zellen in Anwesenheit von Anti-CD3/CD28 aktivierende Antikörper bereits kultiviert wurde. Es erkennt CD8+ T-Zell-induzierten Krebs Zelle Apoptose im Laufe der Zeit folgende Kokultur, wodurch die Bewertung der Auswirkungen von Suppressor-Zellen auf die Zytotoxizität von CD8+ T Zellen.
Krebszellen erhöhen in der Regel grün fluoreszieren in ihren Kernen nach der Aktivierung einer nuklearen Zielversionen Caspase-Biosensor, wenn diese Zellen nehmen Sie Kontakt mit CD8+ T Zellen, werden durch Antikörper in der Abwesenheit von Suppressor-Zellen (Pre aktiviert Abbildung 3; Ergänzende Film 1). Grüne Fluoreszenz vom Substrat Caspase war nachweisbar mindestens 15 h nach Apoptose initiiert wurde. Einige spontane Apoptose von Effektor CD8+ T Zellen wurde auch im Laufe der Zeit beobachtet, auch wenn diese Zellen gezüchtet wurden, isoliert (Abbildung 4; Ergänzende Film 2). Jedoch Kerne Größen der CD8+ T Zellen sind kleiner als die von Krebszellen und somit apoptotische "Effektorzellen" von apoptotischen 'Ziel' Zelle zählt durch eine Größe Beschränkung Bild Analysemethode (Abbildung 2 und Abbildung 4) ausgeschlossen werden können. Obwohl einige Krebszellen eine kleine abgerundete Form ohne grüne Fluoreszenz zeigen, berührt dies nicht die Analyse wie diese Zellen sind in der Mitose anstatt Apoptose (ergänzende Movie 3) und sind somit von Apoptotic 'Target' ausgeschlossen Zelle zählt durch eine rot/grün Überlappung Maske (ergänzende Abbildung2). Spontanen Apoptose von Krebszellen ist gelegentlich auch in die einzige Kultur (ergänzende Movie 3) gefunden. Jedoch der Kokultur Ziel Krebs Zellen mit voraktivierten CD8+ T Zellen erhöhte Tumor Zellapoptose über dem Niveau der spontanen Apoptose in Monokultur von Krebszellen (Abbildung 4). Im Allgemeinen kann bei der Verwendung von eines optimalen Verhältnis von Krebszellen Effektor Zellen ein Höhepunkt in der Reihe von apoptotischen Krebszellen (Abb. 5A) beobachtet werden. Dieser Gipfel ist stärker ausgeprägt, wenn die Daten als apoptotische Bruchteil der Zelle Zielpopulation (Abbildung 5 b) ausgedrückt werden. In diesem Experiment der basalen Apoptose von Tumorzellen Ziel erreichte bei 24 h (mit Apoptotic Bruch = 0,08), aber CD8+ T-Zell-induzierten Apoptose erreicht ein Maximum um 17 Uhr (mit Apoptotic Bruch = 0,66).
Weiter fanden wir, dass CD8+ T Zellen inkubiert Pre mit MAMs oder M-MDSCs machen konnte Kontakt mit Krebszellen, aber dieser Kontakt schien weniger Fälle von Krebs Zelle Apoptose im Vergleich zu CD8 führen+ T Zellen aktiviert Pre ohne Suppressor-Zellen (Abbildung 3 und Abbildung 4; " Ergänzende Film 4 und ergänzende Film 5). Obwohl die CD8+ T Zellen bereits gelegentlich mit der myeloischen Zellen inkubiert induzierte Zellapoptose Krebs, gab es auch einige Vermehrung von Krebszellen, die nicht in dem zeitlichen Verlauf der Apoptose angeregt wurden die Experiment (ergänzende Film 6). Im Einklang mit diesen Erkenntnissen, der Spitze Anteil der Apoptotic Zellen kultiviert mit CD8+ T Zellen vorab mit myeloische Zellen inkubiert (Apoptotic Bruchteil = 0,38 um 23 Uhr für MDSC-E und 0,25 um 20 Uhr für MAM-E) war deutlich geringer als die von Krebszellen kultivierte mit CD8 Zellen+ T, die nicht vorab inkubierten mit den Suppressor-Zellen (Abbildung 6) waren.
<img alt="CD8+ T-Zell-Aktivierung und Apoptose-Diagramm von Krebszellen; Kultureinrichtung und Bildgebungsergebnisse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: ein Schema zeigt die Versuchsdurchführung. Naive Milz CD8+ T Zellen sind mit Anti-CD3/CD28 aktivierende Antikörper mit oder ohne Metastasen-assoziierten Makrophagen (MAMs) kultiviert oder monozytären myeloische-abgeleitete Suppressor Zellen (M-MDSCs). Nach 4 Tagen, schwimmende CD8+ T Zellen werden gesammelt und gemeinsam mit Krebszellen in Anwesenheit von Fluorogenic Caspase-3 Substrat kultiviert. Apoptotische Zellen werden unter Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie erkannt. Gezeigten Bilder wurden mit Hilfe einer live Cell Imaging Plattform erworben (siehe Tabelle der Materialien). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Fluoreszenzmikroskopie-Diagramm, Rot/Grün-Kanäle, Apoptose-Detektionsmasken, Zellviabilitätsanalyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: Identifizierung der Apoptotic Zellen unterscheidet sich von apoptotischen Effektorzellen. Obere Reihe: Bildaufnahme im roten Kanal ermöglicht die Identifikation von Ziel Zellkerne von Ziel-Erkennung-Maske (rosa Analyse Maske). Mittlere Reihe: Bilder erwarb der Grünkanal zeigen Apoptotic Zellen Effektor und Ziel. Asize eingeschränkte Apoptose Maske (Teal Analyse Maske; größer 80 µm2) können einzelne Apoptotic Effektorzellen aus der Analyse ausgeschlossen werden. Untere Reihe: zusammengesetzte Bilder zusammengeführten roten und grünen Kanäle mit Phase Kontrast Bild (links) oder rot/grün überlappen Maske (rechts). Identifizierung der Co lokalisierte, Größe eingeschränkt grün fluoreszieren mit rote Fluoreszenz (gelbe Analyse Maske), ermöglicht genauere Erkennung des apoptotischen Ziel Kerne (gelbe Pfeilspitze) durch den Ausschluss der Aggregate des apoptotischen Effektorzellen (weiß Pfeilspitzen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Zellapoptose im Laufe der Zeit; Mikroskopie-Bilder; Effektor-Ziel-Interaktion; apoptotische Marker; 12-30 Uhr." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Abbildung 3: Interaktion zwischen CD8+ T Zellen und Krebszellen. Stills aus repräsentativen Zeitraffer-Filme von E0771-LG_NLR Zielzellen (T) Zusammenarbeit mit Effektor CD8 kultiviert+ T Zellen (E) im Verhältnis 4:1 Effektor/Target. MDSC-E und MAM-E zeigen Effektorzellen mit M-MDSCs und MAMs bzw. vorab inkubiert. Zusammengesetzte Bilder (einschließlich Bilder aus Phase Kontrast, rot und grün) angezeigt werden. Pfeilspitzen verfolgen die gleichen Zellen durch die verschiedenen Felder und Zeitpunkten. Gelbe Pfeilspitzen: ein Ziel, das verbindet mit Effektoren und Apoptose, weiße Pfeilspitzen erfährt: ein Ziel, das verbindet mit Effektoren aber nicht Apoptose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Effektor-Ziel-Interaktionsassay; Fluoreszenzmikroskopie; zusammengesetzte und rote Kanalansichten; Zellanalyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Abbildung 4: Nachweis von Krebszellen Apoptotic. Repräsentativen Bereichen von Zeitraffer-Filme um 18 Uhr nach dem Imaging extrahiert. Zusammengesetzte Bilder (links; Phase Kontrast, rot und grün-Kanäle) und Bilder aus roten Kanal ohne (Mitte) oder mit (rechts) rot/grün Überlappung Maske (gelb) angezeigt werden. Gelbe Punkte in der rechten Spalte darstellen Apoptose von Krebszellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Apoptotische Krebszellzahl über die Zeit bei verschiedenen E:T-Verhältnissen, experimentelle Grafik, statistische Analyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Abbildung 5: CD8+ T-Zell-induzierten Krebs Zelle Apoptose. (A) Anzahl der Apoptotic Zellen kultiviert mit Effektor C8+ T-Zellen bei verschiedenen Effektor Ziel-Verhältnis (E:T). (B) apoptotische Bruchteil der Ziel-Zell-Population. Daten sind Mittel ± SD Mean Fläche unter der Kurve (AUC) auch gezeigt wird. Ungepaarten t-Test mit Welch es Korrektur wurde verwendet, um die AUC zu analysieren. * P &lt; 0,0001 im Vergleich zu E:T = 0:1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Apoptose-Diagramm der Krebszelle; Experimentelle Grafik zum Vergleich des Zelltods im Laufe der Zeit für verschiedene Behandlungen." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Abbildung 6: Auswirkungen der Tumor infiltrieren myeloische Zellen auf die Zytotoxizität von CD8+ T Zellen. (A) Anzahl der Apoptose von Krebszellen (Ziel: T) kultiviert mit C8+ T Zellen (Effektor: E) mit 4:1 der E:T Verhältnis. CD8+ T Zellen wurden vorab in Abwesenheit (schwarzer Kreis) oder Vorhandensein von monozytären myeloische-abgeleitete Suppressor-Zellen kultiviert (MDSC-E: blauer Kreis) oder Metastasen-assoziierten Makrophagen (MAM-e: roter Kreis). Daten sind Mittel ± SD (B) apoptotische Bruchteil der Ziel-Zell-Population. Daten sind Mittel ± SD bedeuten AUC auch gezeigt wird. Ungepaarten t-Test mit Welch es Korrektur wurde verwendet, um die AUC zu analysieren. * P &lt; 0,0001 im Vergleich zu T nur, #P &lt; 0,0001 im Vergleich zu E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Abbildung 1. Gating Strategie, Suppressor-Zellen von metastasierendem Lungenkrebs zu isolieren. (A) repräsentativen Punkt Grundstücke, monozytären myeloische abgeleitet Suppressor-Zellen (M-MDSCs) und Metastasen-assoziierten Makrophagen (MAMs) zu isolieren. Die Schwelle der Ly6C Ebene zu unterscheiden, MAMs (Ly6Cniedrig) und M-MDSCs (Ly6Choch) basiert auf dem Wohnsitz alveolären Makrophagen (RMAC). (B) Reinheit sortiert M-MDSCs (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Choch) und MAMs (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Cniedrig). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS1_Rvd.pdf">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2. Repräsentative Bilder der mitotischen Zellen. Stills aus repräsentativen Zeitraffer-Filme von Ziel E0771-LG_NLR Mono-Zellkultur. Oben: zusammengesetzte Bilder einschließlich Bilder von Phase Kontrast, rot und grün-Kanäle. Unten: zusammengesetzte Bilder (roten und grünen Kanäle) mit rot/grün überlappen Maske. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS2_Rvd.pdf">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Abbildung 3. Beeinflussung der Tumor infiltrieren myeloische Zellen Proliferation von CD8+ T-Zellen. (A) repräsentative Histogramme zeigen Verdünnung der fluoreszierenden Beschriftung mit CFSE in CD8+ T Zellen. Naive Milz CD8+ T Zellen wurden isoliert, wie in Protokoll Nr. 3 beschrieben und mit 5 µM von CFSE bei 37 ° C für 15 min gekennzeichnet. Die beschrifteten T-Zellen wurden in Anwesenheit von IL-2 kultiviert und Anti-CD3/CD28 Antikörper mit oder ohne myeloische Zellen zu aktivieren, wie im Protokoll Nr. 4 beschrieben. Nach 4 Tagen wurde grün fluoreszieren in T-Zellen durch Durchflusszytometer gefunden. (B) Division Index der CD8+ T Zellen als zuvor beschriebenen17berechnet. Daten sind Mittel ± SEM. * P &lt; 0,01 im Vergleich um zu kontrollieren, #P &lt; 0,05 im Vergleich zu αCD3/CD28 ab. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS3_Rvd.pdf">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Film 1. Film der Figuren 3 und 4; E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS1.mp4">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Film 2. Film der Figuren 3 und 4; Effektor (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS2.mp4">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Film 3. Film der Figuren 3 und 4; Ziel (T). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS3.mp4">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Film 4. Film der Figuren 3 und 4; MDSC-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS4.mp4">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Film 5. Film der Figuren 3 und 4; MAM-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS5.mp4">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Film 6. Film der Figuren 3 und 4; MAM-E + T (Proliferation). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS6.mp4">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Zytotoxizität von pre-activated CD8 untersuchen+ T-Zellen gegen Krebszellen durch das Erkennen von apoptotischen Krebs Zellen über Echtzeit-Mikroskopie. Dieses Protokoll kann Mechanismen hinter myeloische Zellen-induzierte T-Zell-Unterdrückung untersuchen und zu bewerten Verbindungen auffüllen T Zellen durch Blockade von Immunzellen suppressive myeloische abzielen.

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Unser Protokoll bewertet die Auswirkungen von myeloiden suppressorischen Suppressorzellen und die tumorassoziierten Makrophagen bei t-zellinduzierter Tumorzellapoptose. Neben der Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen potenzieller therapeutischer Interventionen. Dieses Protokoll evaluiert direkt t-zellinduzierte Tumorzellapoptose mit hoher Empfindlichkeit und ermöglicht Längsinalanalysen und Bildgebung von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen.Die Wirksamkeit von Checkpoint-Hemmern wird am besten durch tumorinfiltrierende myeloische Zellen bei bestimmten Tumortypen betrachtet. Diese Technik könnte zur Identifizierung neuartiger Therapien für diese Tumoren führen. Diese Methode könnte nicht nur die Krebsimmunologieforschung voranbringen, sondern potenziell auch Einblicke in die Immunschwäche- und Autoimmunerkrankungen geben.Zur Aktivierung und Erweiterung von Milz-isolierten CD8-positiven T-Zellen zunächst einmal 10 zu den fünften CD8-positiven T-Zellen in 50 Mikrolitern E-DMEM in einzelne Bohrungen einer 96-Well-U-Bodenplatte. Als nächstes fügen Sie ein mal 10 zu den fünften Suppressorzellen in 50 Mikroliter e-DMEM oder 50 Mikroliter E-DMEM allein in jeden Brunnen von T-Zellen. Dann 50 Mikroliter frisch zubereitetes Aktivierungsmedium und 50 Mikroliter E-DMEM mit oder ohne testreagenzien in die entsprechenden Brunnen geben.Und legen Sie die Platte in einem 37-Grad-Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator mit 95% Luftfeuchtigkeit für vier Tage. Um eine voraktivierte CD8-positive T-Zell-Zielzell-Kokultur einzurichten, fügen Sie zunächst 30 Mikroliter 1-bis-100-verdünnter wachstumsfaktorreduzierter löslicher Kellermembranmatrix in die entsprechenden Brunnen einer 96-Well-Flachbodenplatte, die für die Mikroskopie geeignet ist, hinzuzufügen. Schütteln Sie die Platte, um die Matrix gleichmäßig zu verteilen, und legen Sie die Platte mindestens eine Stunde lang im Zellkultur-Inkubator.Während die Platte ausgeglichen ist, bereiten Sie die Zielzellen vor. Das Medium ansaugen, mit PBS waschen und einen Milliliter 05%Trypsin-EDTA bei Raumtemperatur für eine Minute hinzufügen. Fügen Sie neun Milliliter DMEM hinzu, ergänzt durch sanftes Pipettieren mit fetalem Rinderserum, und übertragen Sie die dissoziierten Zellen in Röhren.Nach dem Zentrieren der Zellen, setzen Sie die Palette in 500 Mikroliter E-DMEM. Filtern Sie die resuspendierten Zellen durch ein Zellsieb, und zählen Sie die lebenden Zellen. Dann stellen Sie die Dichte auf viermal 10 auf die vierte Zielzelle pro Milliliter in frischem E-DMEM auf Eis ein.Als nächstes pipette die voraktivierten CD8-positiven T-Zellen ein paar Mal, um die Zellen in eine einzelne Zellsuspension wieder auszusetzen, und übertragen Sie die schwimmenden T-Zellen in eine 1,5-Milliliter-Röhre pro Bedingung. Sammeln Sie alle verbleibenden Zellen mit 200 Mikroliter PBS pro Brunnen, übertragen Sie die Washes in die entsprechenden 1,5-Milliliter-Röhren und Zentrifugen. Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie jedem Rohr einen Milliliter E-DMEM für die Zentrifugation hinzu.Nach der Zentrifugation die Pellets in 100 Mikroliter frischer E-DMEM pro Tube wieder aufsetzen. Passen Sie die Zellen in jedem Rohr nach der Zählung auf eine Dichte von 1,6 mal 10 bis zu den fünften voraktivierten CD8-positiven T-Zellen pro Milliliter Medium an, und legen Sie die Zellen auf Eis. Wenn die Zellen fertig sind, aspirieren Sie die Kellermembranmatrix aus jedem Brunnen der 96-Well-Mikroskopieplatte und fügen Sie 50 Mikroliter Zielzellen zu einzelnen Brunnen innerhalb der inneren 60 Brunnen der Platte mit Mischen hinzu.Fügen Sie 25 Mikroliter E-DMEM, ergänzt mit viermal 10, bis zur dritten Einheit pro Milliliter IL2 und 10-Mikromol-fluorogenem Caspase-3-Substrat in die entsprechenden Brunnen. Dann 25 Mikroliter voraktivierte CD8-positive T-Zellen in die entsprechenden Brunnen geben. Und schließlich fügen Sie E-DMEM zu den entsprechenden Brunnen hinzu, um ein Gesamtvolumen von bis zu 100 Mikrolitern zu machen.Fügen Sie 200 Mikroliter PBS oder steriles Wasser in alle leeren Brunnen. Schütteln Sie die Platte, und lassen Sie die Platte auf einer flachen Oberfläche für 10 Minuten. Um die Zellen abzubilden, stellen Sie das Mikroskop so ein, dass Bilder im Phasenkontrast erfasst werden.Neben Fluoreszenzkanälen, die für das kernstoffbegrenzte fluoreszierende Protein geeignet sind, und den im Experiment verwendeten fluorogenaktivierten Caspase-3-Substratfluorophoren. Dann erfassen Sie Bilder von jedem experimentellen Brunnen im Phasenkontrast und die beiden Fluoreszenzkanäle alle ein bis drei Stunden für mindestens 72 Stunden. Um die aufgenommenen Bilder zu analysieren, öffnen Sie ein Bild aus einem Kontrollbrunnen, der nur Zielzellen und Medium ohne Caspase-3-Substrat im Fluoreszenzkanal enthält, der für substratssignals verwendet wird.Beobachten Sie, ob ein unangemessenes Fluoreszenzsignal von den Kernen emittiert wird. Wenn das Substratsignal innerhalb der Kerne sichtbar ist, verwenden Sie das spektrale Unmixen, um den Prozentsatz des substraten Signals zu erhöhen, das vom Kernsignal entfernt wird, bis das Substratsignal verschwindet. Als Nächstes sehen Sie einen Kontrollbrunnen, der nur nicht beschriftete Effektorzellen in Medium ohne Caspase-3-Substrat in den beiden Fluoreszenzkanälen einzeln enthält.Beobachten Sie, ob ein Signal von den Kernen emittiert wird. Wenn in den einzelnen Kanälen kein Signal erkennbar ist, ist keine spektrale Unmischung erforderlich. Um die fluoreszierenden Objekte in beiden Fluoreszenzkanälen aufzulösen, verwenden Sie eine Fluoreszenz-Hintergrundsubtraktionsmethode mit relevanten Parametern für die Probe und den entsprechenden Parametern für die Kantenaufteilung.Verwenden Sie Bilder der Zielzellmonokultur, um Parameter für die Kernfluoreszenz der Zielzelle festzulegen. Verwenden Sie Bilder der Effektorzellmonokultur, um Parameter für substratinduzierte apoptotische Kernfluoreszenz festzulegen. Verwenden Sie Bilder der Co-Kultur, um Parameter für substratinduzierte apoptotische Kernfluoreszenz in Zielzellen zu verifizieren oder zu verfeinern.Um die minimale Größe der Zielkerne zu bestimmen, verwenden Sie Bilder im Kernsignalkanal aus den Brunnen, die nur Zielzellen mit Caspasesubstrat enthalten. Um die durchschnittliche Größe der apoptotischen Effektorkerne zu bestimmen, verwenden Sie Bilder im Substratsignalkanal aus den Brunnen, die nur Effektorzellen mit Caspasesubstrat enthalten. Um die Anzahl der Fluoreszenzzielzellkerne zu zählen, richten Sie ein Analyseverfahren mit einer geeigneten Mindestgrößenbeschränkung ein.Mit Effektorzellmonokulturbildern, richten Sie ein zweites Analyseverfahren ein, um die Anzahl der apoptotischen Kerne zu zählen, die größer als die mittlere Größe der apoptotischen Effektorkerne sind. Richten Sie dann ein drittes Analyseverfahren ein, um die Anzahl der apoptotischen Zielzellen zu zählen, indem Sie die Anzahl der Kerne zählen, in denen das Kernsignal und das größenbeschränkte Substratsignal signifikant mitlokalisieren. Typischerweise erhöhen Krebszellen das Fluoreszenzsignal in ihren Kernen nach der Aktivierung eines kernzielbaren Caspase-Biosensors, wenn die Zellen Kontakt mit CD8-positiven T-Zellen aufnehmen, die ohne Suppressorzellen durch Antikörper voraktiviert werden.Die Kerngrößen von CD8-positiven T-Zellen sind kleiner als die von Krebszellen. Daher können apoptotische Effektorzellen durch eine Bildanalysemethode zur Größenbeschränkung von der apoptotischen Zielzellzahl ausgeschlossen werden. Obwohl einige Zielkrebszellen eine kleine abgerundete Form ohne Substratfluoreszenz aufweisen, hat dies keinen Einfluss auf die Analyse.Da diese Zellen eher an Mitose als an Apoptose leiden und daher von der apoptotischen Zielzellzahl durch eine nukleare Substratsignalüberlappungsmaske ausgeschlossen werden. Die Co-Kultur von Zielkrebszellen mit voraktivierten CD8-positiven T-Zellen erhöht die Tumorzellapoptose über dem Niveau der spontanen Apoptose in Krebszellmonokulturen. Im Allgemeinen kann bei verwendung eines optimalen Verhältnisses von Zielkrebszellen zu Effektorzellen ein Spitzenwert in der Anzahl der apoptotischen Zielkrebszellen beobachtet werden.Dieser Peak wird deutlicher, wenn die Daten als apoptotischer Bruchteil der Zielzellpopulation ausgedrückt werden. Das Wichtigste, was man beim Versuch dieses Protokolls beachten sollte, ist die Einrichtung von Monokulturen von Zielzellen und Monokulturen von Effektorzellen für die Entwicklung der Analysemasken. Diese Methode kann Einblick in die Dauer und Häufigkeit von T-Zell-zu-Krebs-Zell-Wechselwirkungen und die Bedingungen im Zusammenhang mit genabhängiger Zytotoxizität sowohl in menschlichen als auch in Mauszellen geben.Wir entwickeln diesen Test derzeit zu einem High-Throughput-Bildschirm mit menschlichen Zellen, um Verbindungen zu identifizieren, die myeloische zellvermittelte Immunsuppression hemmen und dadurch die Wirksamkeit von Checkpoint-Inhibitoren verbessern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video zeigt einen Apoptose-Assay in Krebszellen, der durch voraktivierte Effektor-T-Zellen induziert wurde. Durch die Co-Kultivierung dieser Zellen mit Krebszellen, die mit fluoreszierenden Zellkernen markiert sind, wird ein Caspase-spaltbares fluorogenes Substrat hinzugefügt. Apoptotische Krebszellen zeigen in ihren Zellkernen eine andere Farbe, was zu einer dualen Fluoreszenz führt. Diese duale Fluoreszenz ist ein Hinweis darauf, dass Krebszellen eine Apoptose durchlaufen.

Ein in vitro Assay zur Untersuchung der Zytotoxizität von präaktivierten CD8+ T-Zellen gegen Krebszellen

Dieses Video demonstriert eine in-situ Fluoreszenz-Multispektral-Bildgebungstechnik zur Analyse verschiedener Subpopulationen von infiltrierenden T-Zellen im Tumorgewebe. Eine Kryosektion des Nierenzellkarzinoms wird mit Antikörpern behandelt, um CD8+ T-Zellen zu markieren, die spezifische inhibitorische Rezeptoren exprimieren und einen immuntherapieresistenten Phänotyp aufweisen. Der markierte Schnitt wird mit einem Multispektralmikroskop visualisiert, um die unterschiedlichen CD8+...

Multiplex-Immunfluoreszenz-Bildgebung zur Analyse immuntherapieresistenter T-Zell-Subpopulationen

Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur detaillierten Bewertung von Leukozyten-Untergruppen innerhalb der Tumormikroumgebung in einem Maustumormodell. Chemerin-exprimierende B16-Melanomzellen wurden subkutan in syngene Mäuse implantiert. Zellen aus der Tumormikroumgebung wurden dann gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert, was eine detaillierte Analyse der Leukozyten-Untergruppe ermöglichte.

Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Bild resident Tumor infiltrieren CD8 T-Zellen beschriftet mit Gewebekulturen gekoppelten Antikörpern im menschlichen Lunge Tumor Scheiben. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen von CD8 T Zelle Migration mit der konfokalen Mikroskopie.

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

Studium der Tumor Mikroumgebung kann prognostische und prädiktive Biomarker des klinischen Ansprechens auf Immuntherapie identifizieren. Hier präsentiert, ist eine innovative Methode basierend auf in Situ Fluoreszenz multispektralen imaging, zu analysieren und automatisch verschiedene Subpopulationen von CD8 zählen+ T Zellen. Diese reproduzierbare und zuverlässige Technik eignet sich für große Kohorte Analysen.

Gemultiplext Immunfluoreszenz Analyse und Quantifizierung der intratumorale PD-1+ Tim-3+ CD8+ T-Zellen

Wir beschreiben hier einen in vivo tötenden Assay basierenden Strömungszysam, der die Untersuchung der Immunodominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) auf ein Modell-Tumor-Antigen ermöglicht. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie dieser elegante Test für mechanistische Studien und für die Wirksamkeit von Medikamenten eingesetzt werden kann.

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Entstehung von orthotopischen Bauchspeicheldrüsentumoren und die schnelle Verdauung von frisch isolierten murinen Bauchspeicheldrüsentumoren. Nach der Verdauung können lebensfähige Immunzellpopulationen für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden, einschließlich der Ex-vivo-Stimulation von T-Zellen zur intrazellulären Zytokindetektion durch Durchflusszytometrie.

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

Hier stellen wir ein Tumortransplantationsprotokoll zur Charakterisierung von tumorinhärenten und peripherieabgeleiteten tumorinfiltrierten Lymphozyten in einem Maustumormodell vor. Die spezifische Verfolgung des Zustroms von Empfänger-abgeleiteten Immunzellen mit Durchflusszytometrie zeigt die Dynamik der phänotypischen und funktionellen Veränderungen dieser Zellen während der Antitumor-Immunantwort.

Tumortransplantation zur Beurteilung der Dynamik tumorinfiltrierender CD8+ T-Zellen in Mäusen

Im Folgenden stellen wir ein einfaches, schnelles und zuverlässiges multiparametrisches Durchflusszytometrie- und Tumor-on-a-Chip-gestütztes Protokoll vor, um die Schritte des Krebsimmunitätszyklus zu überwachen und zu charakterisieren. In der Tat liefert ein gründliches Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Krebs und Immunzellen entscheidende Erkenntnisse, um Tumore zu überlisten und die klinische Versorgung zu leiten.

Co-Kultur in vitro Systeme zur Reproduktion des Krebs-Immunitäts-Zyklus

Das vorliegende Protokoll beschreibt einen experimentellen Arbeitsablauf, der die ex vivo Analyse der Stimulation humaner T-Zellen in einem allogenen Co-Kultursystem mit vorbehandelten Tumorzellen ermöglicht.

Analyse der Aktivität humaner T-Zellen in einer allogenen Co-Kultur von vorbehandelten Tumorzellen

Erfahren Sie die Echtzeit-Erkennung von Tumorzell-Apoptose durch CD8+ T-Zellen zur Untersuchung immunsuppressiver Funktionen tumorinfiltrierender myeloider Zellen. Diese Methode ermöglicht hochsensitive Analysen für die Krebsimmuntherapie.

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren (Video) | JoVE Journal

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8⁺ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

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