Name: Vorbereitung der Poly(pentafluorophenyl acrylate) funktionalisiert SiO2 Perlen Proteinreinigung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von poly(PFPA)-funktionalisierten SiO₂-Perlen zur Proteinreinigung durch Immunopräzipitation. Diese Methode ermöglicht effiziente Antikörperimmobilisierung für biomolekulare Anwendungen.

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1. Vorbereitung des Poly(PFPA) Homopolymer
<ol><li>Rekristallisation der Havariekommission<ol>
<li>Kombinieren Sie 5 g 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (Havariekommission) mit 25 mL Methanol in einem 250 mL Becherglas. Tauchen Sie den Becher in ein Ölbad 60 ° C, dann rühren Sie kräftig die Mischung mit Stir Bar bis Havariekommission vollständig aufgelöst ist.</li>
		<li>Filtern Sie die warme Lösung durch Filterpapier (5-8 μm Partikel Retention) und speichern Sie das Filtrat bei 4 ° C langsam erlauben die Kristalle zu bilden.</li>
		<li>Sammeln Sie die umkristallisiert Havariekommission durch Filtration. Kombinieren Sie das gesammelte Produkt mit 25 mL frischem Methanol und wiederholen Sie den Vorgang der Rekristallisation.</li>
		<li>Trocknen Sie 2 x umkristallisiert Havariekommission in einem Vakuumofen bei Raumtemperatur (RT) über Nacht. Lagern Sie das Produkt im Dunkeln bei <-10 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synthese von Benzyl Dithiobenzoate25<ol>
<li>Bereiten Sie einen 500 mL drei Hals Rundboden Kolben ausgestattet mit einer magnetischen Stir Bar, einen refluxing Kondensator, einen Tropftrichter und ein Gummiseptum. Verbinden Sie den Kolben mit der Stickstoff-Gas-Linie durch den refluxing Kondensator und spülen Sie die innere Luft mit Stickstoff. Legen Sie einen Thermometer durch das Septum. Fügen Sie 41 mL (0.041 Mol) 1 M Lösung von Phenylmagnesium Bromid in Tetrahydrofuran (THF) über eine Spritze durch das gleiche Septum.</li>
		<li>Wärmen Sie die Phenylmagnesium-Bromid-Lösung auf 40 ° C in einem Ölbad. Dann fügen Sie 3,1 g (0.041 Mol) Schwefelkohlenstoff durch den Tropftrichter langsam, Aufrechterhaltung der Temperatur der Lösung bei 40 ° C.</li>
		<li>Die resultierende Mischung durch den Tropftrichter über 15 min. Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50 ° c 7,1 g (0.042 Mol) Benzyl Bromid hinzufügen Bei dieser Temperatur für 45 Minuten weiterrühren.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch in einen separatory Trichter zu übertragen und mit 15 mL eiskaltes Wasser verdünnen. Extrahieren Sie das Produkt durch Zugabe von 15 mL Diethylether zu, und entfernen Sie die untere Wasserschicht. Wiederholen Sie die Extraktion mit Diethylether noch zweimal.</li>
		<li>Waschen Sie die kombinierten organischen Phasen mit reichlich Wasser und Sole (Lösung von 50 % (w/V) NaCl in Wasser) und trocknen Sie das Produkt über wasserfrei Magnesiumsulfat.</li>
		<li>Entfernen Sie das Lösungsmittel im Vakuum bei 35 ° C mit einer Drehverdampfer.</li>
		<li>Reinigen Sie das Produkt durch Säulenchromatographie mit 400 mL Silica-Gel (Porengröße 60 Å, 63-200 Mesh Partikelgröße) und Petrolether als Laufmittel, 5 g Benzyl Dithiobenzoate (BDB) als rotes Öl nachgeben. Bestätigen Sie die Produktreinheit von 1H NMR (400 MHz, CDCl-3): δ 8.02-7,99 (2 H, m), 7,55-7.50 (1 H, m), 7.41-7,29 (7 H, m), 4.60 (2 H, s).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synthese von poly(PFPA) über RAFT Polymerisation9,26<ol>
<li>Handelsübliche PFPA Monomer enthält kleine Menge von Inhibitoren. Entfernen Sie vor der Polymerisation die Inhibitoren indem man das Monomer durch eine Einwegspritze mit grundlegenden Aluminiumoxid verpackt.</li>
		<li>Ein 20 mL-Schlenk-Kolben 0,4 mg (0.0024 Mmol) umkristallisiert Havariekommission, 4,3 mg (0.018 Mmol) der BDB, 1012 mg (4,25 Mmol) Inhibitor-freie PFPA und 0,7 mL wasserfreiem Anisole hinzufügen.</li>
		<li>Verbinden Sie den Kolben mit Schlenk Linie und Entgasen der Mischung mit mindestens drei Gefrier-Pumpe-Tau-Zyklen. Kurz, das Reaktionsgemisch in ein Bad von flüssigem Stickstoff eingefroren. Gelten Sie Vakuum um das Gas im Gasraum zu entfernen. Verschließen Sie die Flasche dann entfernen von flüssigem Stickstoff, um den Inhalt bei RT auftauen lassen</li>
		<li>Legen Sie die Flasche in ein Ölbad 70 ° C und für 4 h unter N2 Säuberung reagieren.</li>
		<li>Um die Reaktion zu beenden, entfernen Sie die Flasche aus dem Ölbad und setzen Sie die Reaktion Inhalt in die Luft.</li>
		<li>Das Polymer in kaltem Methanol ausgefällt, dann das wiederhergestellte Polymer in einem Vakuumofen bei 40 ° C über Nacht trocknen.</li>
		<li>Um das Molekulargewicht Polymer zu messen, verwenden Sie Gel Permeation Chromatographie (GPC). Verwenden Sie THF, wie die mobile Phase bei 35 ° C mit einer 1 mL/min Durchfluss und die Eichkurve mit monodispersen Polystyrolstandards zu konstruieren. GPC-Messung zu erwerben, lösen Sie das Polymer in THF (1-2 mg/mL) und Filter durch 0,2 μm Einweg Polytetrafluorethylen (PTFE) Filter auf. Injizieren Sie 100 μl der Probe in der GPC-Instrument. Konvertieren Sie die gemessene Probe Retentionszeit in Molekulargewicht mit Polystyrol Kalibrierkurve.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung des Poly(PFPA) funktionalisiert SiO2 Perlen
<ol><li>Behandlung von SiO2 Perlen mit APTES<ol>
<li>SiO2 Partikel gibt es in Form einer wässrigen Suspension 5 % (w/V). Kombinieren Sie 0,8 mL SiO2 Suspension mit 40 mg APTES und 8 mL Methanol in einer 20 mL funkeln Durchstechflasche mit Stir Bar ausgestattet.</li>
		<li>Lassen Sie die Reaktion auf das Vorgehen bei RT für 5 h mit kräftig rühren.</li>
		<li>Übertragen Sie die Lösung auf einem konischen Rohr. Um die APTES isolieren funktionalisiert SiO2 Perlen, die Lösung bei 10.000 x g für 5 min Zentrifugieren, dann den Überstand zu entfernen. Waschen Sie die Perlen durch Dispergieren sie erneut in 3 mL frischem Methanol. Schütteln Sie das Rohr von hand mischen, aber wenn nötig verbessern Sie die Dispersion durch Ultraschallbehandlung in einem Wasserbad für ein paar Sekunden. Zentrifugieren Sie den Perlen bei 10.000 x g für 5 min. Entfernen des Überstands und wiederholen Sie der Waschschritt noch einmal zu.</li>
		<li>Kombinieren Sie das Methanol gewaschen SiO2 Perlen mit 3 mL Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Schütteln Sie die Mischung mit der hand, oder wenn nötig beschallen, für ein paar Sekunden, bis die Perlen in DMSO vollständig dispergiert sind. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 10.000 x g für 5 min, dann entfernen Sie den überstand. Wiederholen Sie den Schritt, um komplette Lösungsmittelaustausch aus Methanol zu DMSO zu gewährleisten. Hinweis: Enthält die endgültige Aufhebung des APTES funktionalisiert SiO2 Perlen verstreut in 4 mL DMSO.</li>
		<li>Prüfen Sie die Partikelgrößenverteilung, durchführen Sie DLS-Analyse. Nehmen Sie einen Tropfen der Suspension in Schritt 2.1.4 und Ort in einem Einweg-UV Küvette vorbereitet. Die Probe verdünnen, indem Sie die Küvette mit frischen DMSO, bis es 2/3 ist voll. Legen Sie die Probe in der Küvettenhalter Datenerfassung beginnen. Für die Messung der Partikelgröße, verwenden Sie die folgenden Setup-Parameter: Temperatur: 25 ° C; Gleichgewichtherstellung Zeit: 120 s; Messdauer: automatische.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Zusammensetzung die Oberfläche durchführen Sie XPS Analyse. Trocknen Sie eine kleine Auswahl aus der Suspension zubereitet im Schritt 2.1.4 im Vakuumofen bei 40 ° C über Nacht. Nehmen Sie die getrocknete Polymer und Packung gleichmäßig auf einem 0,5 cm x 0,5 cm-Probenhalter. Laden Sie die Probe in die hohen Vakuumkammer (10-8 Torr) und beginnen Sie Datenerfassung. Für das jeweilige XPS-Instrument verwendet, erzeugen die Photoelektronen mit einem monochromen Al Kα Röntgen betrieben um 15 kV und 6,7 mA und sammeln mit Hybrid-Modus Vergrößerung mit dem Analyzer bei 50 eV pass Energie für hochauflösende Spektren und 100 eV geben Energie für elementare Umfragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Poly(PFPA), APTES Pfropfen funktionalisiert SiO2 Perlen<ol>
<li>Bereiten Sie die poly(PFPA)-Lösung von 20 mg poly(PFPA) in 2 mL DMSO in einer 20 mL funkeln Durchstechflasche auflösen. Hinweis: In dieser Studie wird ein relativ niedrigem Molekulargewicht poly(PFPA) (20 kg/Mol) verwendet. So wird trotz der hochpolymeren Konzentration (10 mg/mL), keine Hinweise auf Polymer Vernetzung beobachtet. Wenn ein höheres Molekulargewicht Polymer verwendet wird, müssen Polymer Lösungskonzentration angepasst werden, um mögliche Vernetzung zu vermeiden.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL APTES funktionalisiert SiO2 Perlen in DMSO (aus Schritt 2.1.4), die poly(PFPA)-Lösung suspendiert. Reagieren Sie bei RT für 1 h mit kräftig rühren.</li>
		<li>Isolieren Sie die poly(PFPA) gepfropft SiO2 Perlen durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 5 min, gefolgt von der Entfernung des Überstands. Waschen Sie die Perlen durch Zugabe von 3 mL DMSO und Mischung von beiden schütteln mit der Hand oder einige Sekunden der Zellulite. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 10.000 x g für 5 min, dann entfernen Sie den überstand. Wiederholen Sie waschen der poly(PFPA) gepfropft SiO2 Perlen mit DMSO zweimal.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen mit dreifach destilliertem Wasser (TDW) zwei Mal mehr. In diesem Schritt die Perlen mit 3 mL tdw zu kombinieren, dann durch Schütteln mit der Hand oder einige Sekunden der Zellulite mischen. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 10.000 x g für 5 min, dann entfernen Sie den überstand.</li>
		<li>Um die Partikelgrößenverteilung zu überprüfen, führen Sie DLS Anschluss an das Verfahren in Schritt 2.1.5 beschrieben. Um die Oberflächenchemie zu überprüfen, führen Sie XPS nach dem Verfahren in Schritt 2.1.6 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung der SiO2 Perlen mit PEG ersetzt Poly(PFPA) veredelt
<ol><li>Um die poly(PFPA) Lösung vorzubereiten, lösen Sie auf, 20 mg poly(PFPA) in 2 mL DMSO in ein 20 mL-Fläschchen funkeln.</li>
	<li>Zur Vorbereitung der PEG-Lösung lösen sich Amin funktionalisiert PEG in 1 mL DMSO. Die genaue Höhe der PEG verwendet richtet sich nach den gewünschten Grad der PFP-Substitution, bestimmt durch die Gleichung unten gezeigt: Betrag von amino-PEG (g/g-poly(PFPA)) = (N_poly(PFPA) x % PEG-Sub) X (MW_PEG / MW_poly(PFPA)) wo N_poly(PFPA) = poly(PFPA) Grad der Polymerisation PEG-Sub % = Prozent PEG-Substitution MW_PEG = Molekulargewicht von amino-PEG MW_ poly(PFPA) = Molekulargewicht von poly(PFPA)</li>
	<li>Übertragen Sie die PEG-Lösung auf die poly(PFPA)-Lösung. Reagieren Sie bei RT für 1 h mit kräftig rühren.</li>
	<li>Zur Vorbereitung des APTES funktionalisiert SiO2 Perlen in DMSO ausgesetzt, die gleichen Schritte in Schritt 2.1 gezeigt. 1 mL der Suspension Perle in die PEG ersetzt poly(PFPA) Lösung in Schritt 3.3 vorbereitet zu übertragen. Lassen Sie die Pfropfung zwischen poly(PFPA) und APTES funktionalisiert SiO2 Perlen um fortzufahren bei RT für 1 h mit kräftig rühren.</li>
	<li>Isolieren Sie die Perlen durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 5 min, gefolgt von der Entfernung des Überstands. Waschen Sie die Perlen durch Zugabe von 3 mL DMSO und Mischung von beiden schütteln mit der Hand oder einige Sekunden der Zellulite. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 10.000 x g für 5 min, dann entfernen Sie den überstand. Wiederholen Sie die DMSO waschen zweimal.</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen zwei Mal mehr mit TDW. In diesem Schritt die Perlen mit 3 mL TDW zu kombinieren, dann durch Schütteln mit der Hand oder einige Sekunden der Zellulite mischen. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 10.000 x g für 5 min, dann entfernen Sie den überstand.</li>
	<li>Trocknen Sie die Perlen bei 40 ° C in einem Vakuumofen über Nacht.</li>
</ol>(4) Antikörper Immobilisierung auf Poly(PFPA) gepfropft SiO2 Perlen
Hinweis: Das gleiche Verfahren wird unabhängig von Prozent PEG-Substitution auf poly(PFPA) verwendet. Bereiten Sie Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch Auflösen von PBS Tablet im TDW. Bereiten Sie 0,1 % (V/V) Phosphat gepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20 (PBST vor) durch Zugabe von 1/1000 der Tween 20 in PBS.
<ol><li>Fügen Sie 5 mg poly(PFPA) SiO2 Perlen zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch veredelt.</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen durch Hinzufügen von 800 µL PBS und Mischung gut aufschütteln. Zentrifugieren Sie den Perlen bei 10.000 x g bei RT für 1 min. Entfernen des Überstands und wiederholen Sie der Waschschritt dreimal.</li>
	<li>Fügen Sie 350 µL frische PBS, 50 µL 0,1 % (V/V) PBST und 6,67 µg des Antikörpers. Inkubieren Sie ~ 20 h auf ein Rotator bei 4 ° c</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 400 X g und 4 ° C für 1 min. Überstands entfernen und hinzufügen 400 µL Lyse Puffers sorgfältig. Sanft wieder aussetzen der Perlen von fünf Mal rauf und runter pipettieren. Hinweis: Lysis Puffer verwendet, um die Perlen zu waschen sollte die gleiche verwendet während der Zelle Lysis und IP, außer dass die Zugabe von Dithiothreitol und Protease-Hemmer sind optional, (siehe Schritt 5).</li>
	<li>Wiederholen Sie diese Waschschritt dreimal. Entfernen Sie nach dem letzten Waschen den überstand so weit wie möglich.</li>
</ol>(5) Zell-Lyse und Immunopräzipitation
<ol><li>Vorbereitung der Lyse Puffer und Waschpuffer<ol>
<li>Bereiten Sie die Lyse-Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM KCl, 0,5 % (V/V) NP-40, 10 % (V/V) Glycerin, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und Protease-Inhibitor cocktail).</li>
		<li>Bereiten Sie die Waschpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM KCl, 0,1 % (V/V) NP-40 und 10 % (V/V) Glycerin).</li>
		<li>Die Pufferlösungen bei 4 ° c lagern</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Zellen<ol>
<li>Saatgut (HeLa-Zellen) ein oder zwei Tage vor IP-Experiment, und wachsen die Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
		<li>Sammeln Sie etwa 1,4 x 107 Zellen mit einer Zelle Schaber und Transfer in ein 15 mL konische Röhrchen. Zentrifuge, die Zellen bei 380 X g bei RT für 3 min. Überstand zu entfernen und wieder mit 1 mL kaltem PBS und Überführung in ein 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auszusetzen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 10.000 x g bei 4 ° C für 30 S. Entfernen der Überstand sauber. Zelle Pellets können bei-80 ° C gelagert werden, nach dem Entfernen des Überstands.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Zelle lysates<ol>
<li>Wieder aussetzen der Zelle Pellet mit 400 µL des Puffers Lyse. Beschallen Sie die Zellen mit einem Ultrasonicator.</li>
		<li>Nach der Beschallung, Vortex kurz und Zentrifuge lysate bei 20.000 x g bei 4 ° C für 10 Minuten.</li>
		<li>Übertragen Sie den Überstand auf eine neue 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunopräzipitation<ol>
<li>Übertragen Sie 300 µL der Zelle lysate auf vorbereitete Antikörper inkubiert poly(PFPA) gepfropft SiO2 Perlen. 30 µL der Zelle lysate als Eingabe Probe in einen neuen Microcentrifuge Schlauch zu behalten. Das Eingabesample bei 4 ° c lagern Hinweis: Die Gesamtmenge an Protein in der Zelle lysate sollte etwa 4 mg.</li>
		<li>Inkubieren Sie die lysate/Perlen-Mischung für 3 h auf ein Rotator bei 4 ° c</li>
		<li>Zentrifugieren Sie der Mischung auf 400 X g bei 4 ° C für 1 min. Entfernen des Überstands und fügen Sie 400 µL Waschpuffer sorgfältig hinzu. Aussetzen Sie vorsichtig wieder die Perlen durch Pipettieren etwa fünf Mal rauf und runter.</li>
		<li>Wiederholen Sie diese Waschschritt dreimal. Entfernen Sie nach dem letzten Waschen den überstand so weit wie möglich.</li>
		<li>Bereiten Sie 2 x Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) laden Farbstoff (25 % (V/V) Glycerin, 0,1 % (w/V) Bromo Phenol blau (BPB), 60 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2 % (w/V) SDS und 2,75 mM 2-Mercaptoethanol vor). Speicher 2 x SDS laden Farbstoff bei-20 ° C. Die Perlen und die gespeicherten Eingabesample 30 µL 2 x SDS laden Farbstoff hinzu, und Wärme sie für 10 min bei 95 ° C.</li>
		<li>Nach dem erhitzen, analysieren Sie die Probe mittels Western Blot-27oder speichern Sie das Sample bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Synthese von poly(PFPA) gepfropft SiO2 Perlen in Abbildung 1dargestellt ist. Durch den Einsatz von APTES als Linker Molekül, können poly(PFPA) Bürsten kovalent gepfropft, SiO2 Substrat über einen einfachen Schritten zubereitet werden. Obwohl einige der PFP-Einheiten für die Reaktion mit APTES geopfert werden, sollen eine große Anzahl von PFP-Einheiten für spätere Reaktion mit amino-PEG oder Antikörper verfügbar bleiben. Die PFP-Gruppen sind dafür bekannt, niederener...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58843/preparation-poly-pentafluorophenyl-acrylate-functionalized-sio2-beads">Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification</a>.&#160; Throughout the article, the term &#34;3-aminopropyltriethoxysilane&#34; has been replaced with &#34;3-aminopropyltrimethoxysilane&#34;, and &#34;APTES&#34; with &#34;APTMS&#34;.

Erratum: Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Reaktive Polymer Bürsten haben viel Interesse in den letzten Jahren erhalten. Sie können verwendet werden, um funktionelle Moleküle auf organische oder anorganische Materialien für aktivierte Oberflächen mit Anwendungen in Bereichen wie Erkennung und Trennung1,2,3,4zu immobilisieren, 5. Unter die reaktive Polymere berichtet sind jene mit Pentafluorophenyl Ester Einheiten besonders aufgrund ihrer hohen Reaktivität mit Aminen und Beständigkeit gegenüber Hydrolyse6. Eine solche Polymer ist poly(PFPA) kann, und es ohne weiteres funktionalisierten nach Polymerisation mit Molekülen, die mit primären oder sekundären Aminen7,8,9,10. In einem Beispiel wurden poly(PFPA) Bürsten mit amino-Spiropyrans Licht reagierende Oberflächen7erstellen reagiert.
Die Vorbereitung der poly(PFPA) und deren Anwendungen wurden in einer Reihe von früheren Publikationen6,7,8,9,10,11,12 beschrieben ,13,14,15,16,17. Insbesondere berichtet Theato und Mitarbeiter die Synthese von poly(PFPA) Bürsten über "Pfropfen zu" und "Pfropfen aus" Methoden7,8,10,11,12 . In der "Pfropfen" Ansatz, eine Poly (Methylsilsesquioxane)-Poly (Pentafluorophenyl Acrylat) (poly(MSSQ-PFPA))-Hybrid-Polymer synthetisiert8,10,11,12war. Die poly(MSSQ)-Komponente konnte Form starke Adhäsion mit einer Reihe von verschiedenen organischen und anorganischen Oberflächen, so dass die poly(PFPA)-Komponente, die eine Bürste auf der beschichteten Oberfläche bilden. In der "Pfropfen aus" Ansatz, Oberfläche initiiert reversible Addition und Fragmentierung Kette Transfer (SI-FLOß) Polymerisation wurde eingesetzt, um poly(PFPA) Bürsten7vorzubereiten. In diesem Fall hing eine Oberfläche immobilisiert Kette Transferstelle (SI-CTA) zuerst kovalent an das Substrat durch Kieselsäure-Silan-Reaktion. Immobilisierte SI-CTA nahm dann in der SI-RAFT Polymerisation PFPA Monomere, dicht gepackten poly(PFPA) Bürsten mit stabile kovalente Anbindung an das Substrat zu erzeugen.
Durch die Nutzung der poly(PFPA) Bürsten über SI-RAFT Polymerisation synthetisiert, haben wir vor kurzem die Immobilisierung von Antikörpern auf poly(PFPA) gepfropft Silica-Partikel und deren spätere Anwendung in Protein Reinigung18gezeigt. Die Verwendung von poly(PFPA) Bürsten für Antikörper Immobilisierung erwies sich um eine Reihe von Fragen im Zusammenhang mit aktuellen Protein Trennung durch IP-zu lösen. Herkömmliche IP beruht auf der Verwendung von Protein A/G als ein Linker für Antikörper Immobilisierung19,20,21. Da die Verwendung von Protein A/G der Antikörper mit einer bestimmten Orientierung angebracht werden kann, wird eine hohe Ziel Antigen Erholung Effizienz erreicht. Allerdings leidet die Verwendung von Protein A/G unspezifische Protein-Interaktion sowie der Verlust von Antikörpern während Proteingewinnung, die ein hohes Maß an Rauschen beitragen. Um diese Mängel zu beheben, wurde die direkte Vernetzung von Antikörpern gegen eine feste Stütze erforschten22,23,24. Die Effizienz solcher Techniken ist in der Regel gering aufgrund der zufälligen Orientierung der Antikörper vernetzt. Für das Substrat poly(PFPA) gepfropft ist die Immobilisierung von Antikörpern dauerhaft, durch Austausch Reaktion zwischen PFP Einheiten und Amin Funktionalitäten auf Antikörper erreicht. Obwohl die Antikörper-Ausrichtung noch zufällig ist, profitiert das System haben viele reaktive PFP-Sites, steuerbar durch den Grad der Polymerisation. Darüber hinaus zeigten wir, dass durch partielle Substitution von PFP-Einheiten mit amino-PEG, kann Oberfläche Hydrophilie abgestimmt werden weitere Effizienzsteigerungen Protein Recovery System18. Insgesamt zeigten die poly(PFPA) gepfropft Silica-Partikel eine wirksame Alternative zu traditionellen IP mit angemessenen Effizienz sowie viel sauberer Hintergrund sein.
In diesem Beitrag berichten wir über eine alternative Methode zur poly(PFPA) veredelte Oberfläche Antikörper Immobilisierung und IP-Anwendung vorzubereiten. In zwei einfachen Schritten, wie in Abbildung 1dargestellt ein APTES Linker Molekül zuerst lagert sich auf die Silizium-Oberfläche, dann poly(PFPA) Polymer ist kovalent angeschlossen an die Linker-Molekül durch die Reaktion zwischen der PFP-Einheiten auf die Polymer und Amin-Funktionen auf APTES. Diese Vorbereitung Methode ermöglicht die permanente Vernetzung der poly(PFPA) auf einer Substratoberfläche, aber vermeidet viele Komplikationen im Zusammenhang mit SI-CTA-Synthese und SI-RAFT Polymerisation von poly(PFPA) Bürsten. Teilsubstitution der PFP-Einheiten mit amino-PEG kann noch durchgeführt werden, ermöglicht die Feinabstimmung der Oberflächeneigenschaften der Polymer-Pinsel. Wir zeigen die poly(PFPA) gepfropft Kieselsäure Perlen so vorbereitet mit Antikörper immobilisiert und zur Proteinanreicherung über IP verwendet werden können. Die detaillierte Wulst Vorbereitung Verfahren, Antikörper Immobilisierung und IP-Tests sind in diesem Artikel dokumentiert, für Leser interessierten bei der Suche nach eine Alternative zu herkömmlichen Protein A/G IP-basierte.

<table><tbody><tr><td>2,2-Azobisisobutyroniril, 99%</td><td>Daejung Chemicals</td><td>1102-4405</td><td></td></tr><tr><td>Methylalkohol für die HPLC, 99,9%</td><td>Duksan Pure Chemicals</td><td>d62</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmagnesiumbromidlösung 1,0&nbsp; M in THF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelkohlenstoff wasserfrei, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>335266</td><td></td></tr><tr><td>Benzylbromid, 98</td><td>%Sigma-Aldrich</td><td>B17905</td><td></td></tr><tr><td>Erdölether, 90%</td><td>Samchun Chemicals</td><td>P0220</td><td></td></tr><tr><td>Ethylether, 99%</td><td>Daejung Chemicals</td><td>4025-4404</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat wasserfrei, Pulver&nbsp; 99%</td><td>Daejung Chemicals</td><td>5514-4405</td><td></td></tr><tr><td>Pentafluorphenylacrylat</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-264001</td><td>enthält den Inhibitor</td></tr><tr><td>Aluminiumoxid, aktiviert, basisch, Brockmann I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199443</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Daejung Chemicals</td><td>7548-4400</td><td></td></tr><tr><td>Anisol wasserfrei, 99,7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296295</td><td></td></tr><tr><td>Siliziumdioxid-Nanopartikel</td><td>Mikropartikel GmbH</td><td>SiO2-R-0,7</td><td>5 % w/v wässrige</td></tr><tr><td>Suspension 3-Aminopropyltrimethoxysilan, >96,0 %</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>T1255</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid für die HPLC, &ge; 99,7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>Aminoterminiertes Poly(ethylenglykol)-</td><td>methylether Polymerquelle</td><td>P16082-EGOCH3NH2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalztablette</td><td>Takara</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Calbiochem</td><td>9480</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8,0)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AM9640G</tr><tr><td>NP-40</td><td>VWR</td><td>E109-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Biosesang</td><td>D1037</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor</td><td>Merck</td><td>535140-1MLCN</td><td></td></tr><tr><td>Bromo phenol blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 6,8)</td><td>Biosolution</td><td>BT033</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Biosolution</td><td>BS003</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>PKR Antikörper</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>12297S</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-32233</td><td></td></tr><tr><td>Normale Kaninchen-IgG-Zellsignaltechnologie</td><td></td><td>2729S</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>Korea Cell Line Bank</td><td>10002</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WUC-D10H</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>BMBio</td><td>BR2006A</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge I</td><td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge II</td><td>LABOGENE</td><td>1736R</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>FINEPCR</td><td>ROTATOR/AG</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumschrank</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>ThermoStable OV-30</td><td></td></tr><tr><td>Gelpermeationschromatographie (THF)</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>Röntgen-Photoelektronenspektrometer</td><td>Thermo VG Scientific</td><td>Sigma Sonde</td><td></td></tr><tr><td>Dynamische Lichtstreuung</td><td>Malvern Instruments</td><td>ZEN 3690</td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung der poly(pentafluorophenyl acrylate) funktionalisiert sio2 perlen proteinreinigung

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Wir zeigen eine einfache Methode um Poly (Pentafluorophenyl Acrylat) vorzubereiten (poly(PFPA)) gepfropft Kieselsäure Perlen für Antikörper Immobilisierung und nachfolgende Immunopräzipitation (IP) Anwendung. Die poly(PFPA) veredelte Oberfläche ist über einen einfachen Schritten bereit. Im ersten Schritt wird 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) wie ein Linker-Molekül auf der Oberfläche Kieselsäure hinterlegt. In einem zweiten Schritt poly(PFPA) Homopolymer, über die reversible Addition und Fragmentierung Kette Transfer (FLOß) Polymerisation synthetisiert ist gepfropft an die Linker-Molekül durch die Reaktion der Austausch zwischen den Pentafluorophenyl (PFP) Einheiten auf die Polymer und Amin Gruppen auf APTES. Die Abscheidung des APTES und poly(PFPA) auf die Kieselsäure Teilchen sind durch Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) bestätigt, sowie durch die Änderung der Größe der Partikel überwacht über dynamische Lichtstreuung (DLS) gemessen. Verbesserung der Oberfläche Hydrophilie der Perlen, partielle Substitution von poly(PFPA) mit Poly(ethylene glycol) Amin funktionalisiert wird auch (amino-PEG) durchgeführt. Die PEG ersetzt poly(PFPA) gepfropft Kieselsäure, die Perlen mit Antikörpern für IP-Anwendung dann immobilisiert sind. Zur Demonstration ein Antikörper gegen Proteinkinase RNA aktiviert (PKR) beschäftigt, und IP-Effizienz wird durch Western blotting bestimmt. Die Ergebnisse der Analyse zeigen, dass die Antikörper immobilisiert Perlen in der Tat lässt sich PKR zu bereichern, während unspezifische Protein-Interaktionen minimal sind.

Ein Schaltplan für die Zubereitung von poly(PFPA) gepfropft SiO2 Perlen, mit oder ohne PEG Substitution ist in Abbildung 1dargestellt. Zur Überwachung der APTES und poly(PFPA) Prozess, nackten SiO2 Perlen, Pfropfung APTES funktionalisiert SiO2 Perlen und poly(PFPA) gepfropft SiO2 Perlen von DLS (Abbildung 2) und XPS (Abbildung 3) gekennzeichnet sind. IP-Eff...

Ein Protokoll für die Zubereitung von Poly (Pentafluorophenyl Acrylat) (poly(PFPA)) gepfropft Kieselsäure Perlen wird vorgestellt. Die poly(PFPA) funktionalisierten Oberfläche ist dann mit Antikörper immobilisiert und die Protein-Trennung durch Immunopräzipitation erfolgreich eingesetzt.

Vorbereitung der Poly(pentafluorophenyl acrylate) funktionalisiert SiO2 Perlen Proteinreinigung

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Diese Methode kann zur Herstellung biomolekülaktivierter Oberflächen eingesetzt werden, die in Bereichen wie Arzneimittelabgabe, biologisches Zielnachweis und Biotrennung Anwendung finden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Poly-PFPA-Bürsten mit Auminen hochreaktiv sind und die Immobilisierung von Antikörpern durch Inkubation in Pufferlösung für einige Stunden erreicht wird. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Proteinreinigung durch Immunreinigung, da der immobilisierte Antikörper erfolgreich mit Zielantigenen binden kann.Obwohl diese Methode für die Antikörpermobilisierung und Proteinreinigung demonstriert wird, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, die eine biomolekulare Mobilisierung erfordern. Zur Behandlung von Siliziumdioxidperlen mit APTES erhalten Sie zunächst Siliziumdioxidpartikel in Form einer wässrigen Suspension mit einem Volumen von 5 %. Kombinieren Sie 0,8 Milliliter Siliziumdioxidsuspension mit 40 Milligramm APTES und acht Milliliter Methanol in einer 20-Milliliter-Szintillationsdurchstechflasche mit Rührstange.Lassen Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für fünf Stunden mit kräftigem Rühren ablaufen. Nach fünf Stunden die Lösung auf ein konisches Rohr übertragen. Um die funktionalisierten Silicondioxidperlen aptES zu isolieren, zentrieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei 10.000 G.Entfernen Sie dann den Überstand. Waschen Sie nun die Perlen, indem Sie sie in drei Milliliter frisches Methanol röten. Schütteln Sie das Rohr von Hand zum Mischen, aber wenn nötig, verbessern Sie die Dispersion durch Beschallung in einem Wasserbad für ein paar Sekunden.Zentrifugieren Sie wie zuvor, und wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. Kombinieren Sie die Methanol-Waschsilikondioxidperlen mit drei Millilitern Dimethylsulfoxid oder DMSO. Schütteln Sie die Mischung von Hand, oder bei Bedarf für ein paar Sekunden beschallen, bis die Perlen vollständig im DMSO verteilt sind.Entfernen Sie nach der Zentrifugation zuvor den Überstand. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt ein letztes Mal, um einen vollständigen Lösungsmittelaustausch von Methanol zu DMSO zu gewährleisten. Um die Poly-PFPA-Lösung vorzubereiten, lösen Sie 20 Milligramm Poly-PFPA in zwei Milliliter DMSO in einer 20-Milliliter-Szintillationsdurchstechflasche auf.Um PEG-Lösung vorzubereiten, lösen Sie Amin funktionalisierte PEG in einem Milliliter DMSO. Übertragen Sie nun die PEG-Lösung auf die Poly-PFPA-Lösung. Reagieren Sie bei Raumtemperatur für eine Stunde mit kräftigem Rühren.Übertragen Sie einen Milliliter der in DMSO aufgehängten APES-funktionalisierten Siliciumdioxidperlen in die PEG-substituierte Poly-PFPA-Lösung. Lassen Sie die Veredelung zwischen Poly-PFPA und APTES funktionalisierten Siliziumdioxidperlen bei Raumtemperatur für eine Stunde mit kräftigem Rühren ablaufen. Dann isolieren Sie die Perlen durch Zentrifugation bei 10.000 G für fünf Minuten, gefolgt von der Entfernung des Überstandes.Waschen Sie die Perlen, indem Sie drei Milliliter DMSO hinzufügen, und mischen Sie sie von Hand oder mit ein paar Sekunden Beschallung. Zentrifugieren Sie die Perlen wie bisher. Und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie die DMSO-Wäsche zweimal wiederholen.Waschen Sie die Perlen zweimal mehr mit drei Milliliter dreifach destilliertem Wasser. Dann von Hand oder mit ein paar Sekunden Beschallung mischen. Zentrifugieren Sie die Perlen wie bisher und entfernen Sie den Überstand.Zum Schluss trocknen Sie die Perlen bei 40 Grad Celsius über Nacht im Vakuumofen. Fügen Sie fünf Milligramm Poly-PFPA-veredelte Siliziumdioxidperlen zu einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr hinzu. Waschen Sie die Perlen, indem Sie 800 Mikroliter PBS hinzufügen, und mischen Sie gut durch Wirbeln.Zentrifugieren Sie die Perlen bei 10.000 G bei Raumtemperatur für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand, und wiederholen Sie den Waschschritt dreimal. Fügen Sie nun 350 Mikroliter frisches PBS, 50 Mikroliter 0,1% PBST und 6,67 Mikrogramm des Antikörpers hinzu.Etwa 20 Stunden auf einem Rotator bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Perlen und Zentrifuge bei 400 G und vier Grad Celsius für eine Minute waschen. Entfernen Sie dann den Überstand und fügen Sie vorsichtig 400 Mikroliter Lysepuffer hinzu.Die Perlen vorsichtig wieder aussetzen, indem Sie fünfmal nach oben und unten pfeifen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Nach der letzten Wäsche so viel vom Überstand wie möglich entfernen.Bereiten Sie Zellen und Lysepuffer wie im Textprotokoll beschrieben vor. Dann das Zellpellet mit 400 Mikrolitern des Lysepuffers wieder aufhängen. Beschallen Sie die Zellen mit einem Ultraschallgerät.Nach der Beschallung kurz Wirbel. Dann zentrifugieren Sie das Lysat bei 20.000 G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr.Um Immunpräzipitation durchzuführen, übertragen Sie 300 Mikroliter Zelllysat auf zuvor vorbereitete Antikörper immobilisierte Poly PFPA-veredelte Siliziumdioxidperlen. Bewahren Sie 30 Mikroliter der Zelle lysiert als Eingangsprobe in einem neuen Mikrozentrifugenrohr auf. Die Lysatperlenmischung drei Stunden lang auf einem Rotator bei vier Grad Celsius inkubieren.Nach der Inkubation zentrieren Sie die Mischung bei 400 G bei vier Grad Celsius für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand, und fügen Sie vorsichtig 400 Mikroliter Waschpuffer hinzu. Die Perlen vorsichtig wieder aussetzen, indem Sie etwa fünfmal nach oben und unten pfeifen.Entfernen Sie nach drei Washes so viel vom Überstand wie möglich. Fügen Sie 30 Mikroliter 2x SDS-Ladefarbstoff zu den Perlen und zur Eingangsprobe hinzu. Dann erhitzen Sie sie für 10 Minuten bei 95 Grad Celsius.Analysieren Sie die Probe nach dem Erhitzen mit Dem westlichen Blotting, oder lagern Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius. Die funktionalisierten Kieselsäureperlen werden mittels Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) untersucht, um die Oberflächenzusammensetzung zu bestimmen. Repräsentative XPS-Daten werden hier angezeigt.Nach der APTES-Behandlung wird der Stickstoff-1s-Peak, der mit der Amingruppenzone APTES verbunden ist, nachgewiesen. Nach der Poly-PFPA-Behandlung wird die fluor-1s-Spitze, die mit den PFP-Einheiten auf dem Polymer verbunden ist, nachgewiesen. Proteinkinase-RNA aktiviert, oder PKR-Anreicherung durch Immunpräzipitation durchgeführt, und die angespielte Proteinprobe wird mit Western Blotting analysiert.Wie erwartet zeigen immobilisierte Perlen ohne Antikörper oder eine unspezifische Antikörpermischung keine PKR-Wiederherstellung. Die mit Anti-PKR bebrüteten Perlen können PKR erfolgreich bereichern, wie das Vorhandensein eines PKR-Bandes und das Fehlen eines GAPDH-Bandes zeigen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass beim Vergleich von Systemen die IP-Experimente sowie die anschließende Western-Blotting-Analyse gleichzeitig durchgeführt werden sollten.Nach seiner Entwicklung kann diese Technik zur Immobilisierung verschiedener biomolekularer oder materieller Substrateingesetzt eingesetzt werden. Darüber hinaus hat diese Methode den zusätzlichen Vorteil der Abstimmung Only Surface-Eigenschaft, die auf die Anforderungen jeder Anwendung zugeschnitten werden kann.

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Peptid tertiäre Amide (PTA) sind eine Superfamilie von Peptidmimetika umfassen, sind aber nicht auf Peptide, Peptoide und N-methylierten Peptide beschränkt. Hier beschreiben wir eine Synthesemethode, die sowohl Split-and-Pool-und Sub-Monomer-Strategien kombiniert, um eine ein-Bead-one-Verbindung Bibliothek von PTAs synthetisieren.

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