Name: Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kultur embryonaler Maus-Neuralstammzellen aus der Ganglienhöckerregion. Diese Mikrochirurgie-Technik liefert hochwertige Zellen für die Neurogenese-Forschung.

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Diese Arbeit wurde von Royan-Institut unterstützt.

Alle Operationen und Prozeduren auf Tier stimmten mit der Tierethik-Ausschuss des Instituts Royan, Teheran, Iran.
1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten, Wasch-Puffer (HEPES-MEM), Zellkulturmedien und Kultur Zellplatten
<ol><li>Chirurgische Instrumente (Schere, Skalpell Klinge Griff und Zange) durch Autoklavieren sie basierend auf den routinemäßigen Sterilisation Leitlinien zu sterilisieren.</li>
	<li>Bereiten Sie eine angemessene Menge HEPES-MEM-Puffer (etwa 100 mL ist ausreichend für jede Schwangere Mäuse). Hohe Konzentrationen von Antibiotika (Penicillin/Streptomycin 10 %) in den Puffer HEPES-MEM hinzufügen. Diese Konzentration von Antibiotika ist notwendig, um das Risiko einer mikrobiellen Kontamination.<ol>
<li>Um HEPES-MEM Puffer vorzubereiten, 100 mL von MEM (minimale wesentliche Mittel) 0,5958 g HEPES Pulver hinzufügen und gut verrühren. Den pH-Wert 7,3-7,4 einstellen und das Medium mit einem 0,22 µm-Filter filtern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NSC Mittel enthaltenden Neurobasal Mittel (NB) zu machen, ergänzt mit 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF 100 x N2-Zuschlag von 1 % oder 1 % B27 ergänzen (ohne Vitamin A), 1 U/mL Heparin, 1 % L-Glutamin, 1 % nicht-essentielle Aminosäure (NEAA), 1 % Penicillin/Streptomycin, und 0,1 mM β-Mercaptoethanol.</li>
</ol>(2) Tier Chirurgie und Mikro-Dissektion
<ol><li>Eine schwangere Maus aufdem 13 Tag der Trächtigkeit zu betäuben (hier Verwendung BALB/c Belastung im Alter von 4 Monaten) durch intraperitoneale Injektion von Ketamin-Xylazin, 100 mg/kg und 10 mg/kg Körpergewicht bzw..<ol>
<li>Bestätigen Sie Tiefe Narkose durch einen schmerzhaften Reiz (z. B. Prise mit Zange) am Fuß des Tieres ausüben und wenn es keine Schmerz-Reflex gibt, Opfern Sie das Tier durch zervikale Dislokation zu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sauber und Desinfektion der Haut des Bauches durch Besprühen 70 % Ethanol.</li>
	<li>Kontrolle der Haut über den Bauch und dann schneiden Sie die Haut und die darunter liegenden Faszie mit einer Schere, die Bauchhöhle und die Gebärmutter Hörner aufzudecken.<ol>
<li>Entfernen Sie der Gebärmutter Hörner mit den Embryonen von Schere und übertragen Sie sie in ein 50 mL konische Röhrchen mit 25 mL kalte HEPES-MEM-Puffer.</li>
		<li>Das konische Rohr unter der Laminar-Flow-Haube und öffnen Sie die Kappe unter der Haube. Bringen Sie die uterine Hörner aus der Röhre und 3 Mal mit genügend Volumen des frischen kalten HEPES-MEM-Puffers zur Beseitigung von Schmutz und Blut spülen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie das uterine Gewebe auf einer 10 cm Petrischale mit 7-10 mL kalte HEPES-MEM-Puffer. Öffnen Sie die uterine Hörner mit feinen Schere und Transfer Embryonen um eine neue Schale mit 7-10 mL kalte HEPES-MEM-Puffer. Setzen Sie nun die 10 cm Teller mit Embryonen unter dem sezierenden Mikroskop für den Mikro-Dissektion Betrieb.</li>
	<li>Biegen Sie ein 25-27 G Spritze Nadelspitze durch seine Spitze auf einem Stahl Skalpell Klinge Griff drücken. Biegen Sie die Spitze der Nadel, bis die Spitze in einem Winkel von 70-90 ° gebogen ist. Überprüfen Sie die Spitze der Nadel unter dem sezierenden Mikroskop zu sehen, die Biegung an der Spitze der Nadel. Hinweis: Natürlich haben Embryonen eine seitliche Position in der Schale.</li>
	<li>Ohne ihre Position zu ändern, halten Sie den Hals und Körper des Embryos mit feinen Zangen und legen Sie das Biegeteil der Nadelspitze in den frontalen Fontanelle des Embryos Kopfes. Kleine Blutungen oder ein Blutgerinnsel es gäbe.<ol>
<li>Verschieben Sie die Nadelspitze oberflächlich. Während das Biegeteil innerhalb der Beule auf der Stirn und dann in Richtung Rückseite des Kopfes befindet, stellen Sie sicher, Schnitt durch die Haut und der Schädel und nicht die zugrunde liegende Gehirn beschädigen.</li>
		<li>Drücken Sie die Haut mit der Spitze der Nadel seitlich um das Gehirn aufzudecken und stechen die Nadel aus der lateralen Seite der Haut auf den Bereich unterhalb des Gehirns. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel indem man es aus dem seziert Schädel herauskommt.</li>
		<li>Halten Sie das Gehirn ruhig mit den gebogenen Pinzette und schneiden Sie den Kortex des jede Hemisphäre mit Mikro-Schere, um ganglionic Eminenz verfügbar zu machen.</li>
		<li>Halten Sie das Gehirn und platzieren Sie die sezierte ganglionic Eminenz in der 15 mL Zentrifugenröhrchen mit neuronalen Stammzellen Medium. Die ganglionic Eminenz ist mit seiner mittleren und seitlichen Teile deutlich.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Gehirne Mikro seziert wurden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schneiden Sie sezierte ganglionic Eminenz, indem man die Pipettenspitze gegen den Boden des Röhrchens. Pipette die Aussetzung nach oben und unten 4 bis 5 Mal, bis das Gewebe für eine einzelne Zelle Aussetzung zu brechen.<ol>
<li>Zentrifugieren Sie der Federung bei 110 X g für 5 min. Entfernen des Überstands und wieder auszusetzen Sie, die Zellen in 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellsuspension in einem 37 ° C für 10 min, und fügen Sie dann eine gleiche Menge an Soja Trypsin Inhibitor (25 µg/mL), die Trypsin-Aktivität zu stoppen. Pipette die Zellsuspension rauf und runter, um sicherzustellen, dass die Trypsin völlig inaktiv gewesen ist.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 110 X g, für 5 min. Überstand zu entfernen und wieder auszusetzen, die Zellen in 1 mL der kompletten NSC Medium und die Anzahl der Zellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platte der Zellen (2 x 105 Zellen/mL) bei NSC Medium in die passende Größe Gewebekultur Flasche. Übertragen Sie 5 mL auf T25, 20 mL T75 und 40 mL bis T175 Kolben. Hinweis: Neurosphären erscheint nach 3 Tage Kultur bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. Nach 6-7 Tagen die Kugeln sollten zwischen 150-200 µm im Durchmesser messen und werden bereit für Subkultur. Durch den Anbau von 1 Million primäre NSCs nach sieben Tagen steigt die Anzahl der Zellen auf 3 Millionen.</li>
</ol>3. Trypsinization und Passagierung von Neurospheres
<ol><li>Zur Subkultur der Neurosphären übertragen Sie das Medium mit abgehängten Neurosphären auf die Zentrifugenröhrchen, 110 X g für 5 min Zentrifugieren Sie und verwerfen Sie den überstand. Fügen Sie 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA und bei 37° C für 10 min inkubieren.<ol>
<li>Die Trypsin mit Soja-Trypsin-Inhibitor und Pipette den Neurosphären sanft bis zu inaktivieren und hinunter machen sie einzelne Zellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Zellsuspension bei 110 X g für 5 min Zentrifugieren, überstand verwerfen und erneut aussetzen der Zellen in 1 mL der NSC Medium. Diese Zellen sind bereit für die nächste Subkultur oder Kultur auf Laminin und Poly-L-Ornithin beschichteten Oberflächen für fortgeschrittene Experimente.</li>
	<li>Für die nächste Subkultur NSCs in den neuen Kolben (folgen Schritt 2,8) zu übertragen und sie im NSC Medium Kultur. Für die Induktion von neuronaler Differenzierung Kultur NSCs in der NSC-Medium in der Abwesenheit von bFGF und EGF Laminin und Poly-L-Ornithin beschichtete Platten (Abbildung 1 b).</li>
	<li>Für den Beschichtungsvorgang voll Mantel der Zelloberfläche Kultur von der Zellplatte Kultur genügend Volumen der Lösung verdünnt Poly-L-Ornithin (25 µg/mL) hinzufügen und Inkubation bei 37 ° C für 2 h.<ol>
<li>Aspirieren Sie Poly-L-Ornithin und spülen Sie die gut 2 X mit PBS. Fügen Sie genügend Volumen von 5 µg/mL Laminin vollständig bedecken die Oberfläche Kultur und Inkubation bei 37 ° C für 2 h Aspirat die Laminin vor galvanischen Zellen oder Platte bei 4 ° C bis benötigt speichern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Flow Cytometry Assay
Hinweis: Der Ausdruck spezifischer Marker des NSCs, Neuronen und Gliazellen kann Flow Cytometry Assay13gemessen werden. Das Protokoll basiert auf Menon Et Al.,13 mit geringfügigen Änderungen.
<ol><li>Neurosphären distanziert oder kultivierten NSCs aus beschichteten Platten durch Trypsinization Sie einzelne Zellen zu lösen. 100 µL Zellsuspension (rund 1 sind Millionen Zellen genug zum Beizen mit jeder Antikörper) 500 µL Fixierung Puffer (2 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer) hinzu, und dann inkubieren Sie die Rohre bei RT für 15 min.</li>
	<li>Wash-Zellen durch Zugabe von 1 mL PBS Tube und Zentrifuge bei 110 X g für 5 min. überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet, verlassen ca. 100 µL in der Röhre.<ol>
<li>Permeabilize Zellen mit Tween-20 (0,7 % Tween 20 in PBS) durch Zugabe von 500 µL Puffer Tween-20 bis 100 µL Zellsuspension. Inkubieren Sie die Rohre bei RT für 15 min auf einem Orbitalschüttler (100 u/min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiederholen Sie die Zentrifugation und PBS waschen. Entfernen Sie den Überstand von den Röhren vollständig, nur das Pellet hinterlässt. Fügen Sie 100 µL verdünnter Primärantikörper (Kaninchen anti-Maus βtub-III und GFAP, Nestin Antikörper bei 1: 200-Konzentration) in Verdünnungspuffer mit 1 % Rinderserumalbumin, 10 % Serum (Ziegenserum) und 0,5 % Tween 20 in PBS und sanft genannte mischen. Inkubieren Sie die Rohre bei RT für 30 min auf einem Orbitalschüttler.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und entfernen Sie den Überstand aus den Rohren vollständig, nur das Pellet hinterlässt.<ol>
<li>Fügen Sie 100 µL verdünnter Sekundärantikörper (Ziege anti-Kaninchen-FITC konjugiert in Konzentration von 1: 500) mit PBS-Puffer zum Zelle Pellet und sanft genannte um zu mischen. Inkubieren Sie die Rohre bei RT für 30 min auf einen Shaker im Dunkeln.</li>
		<li>Waschen Sie die Proben 2 X mit PBS und dann waschen einmal mit Flow-Puffer. Zentrifugieren und Zellen in ca. 150 µL fließen Puffer für Flow Cytometer Analyse wieder auszusetzen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Navarro Quiroz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Signaling+in+Neuronal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cell Signaling in Neuronal Stem Cells.</a> Cells. 7 (7), (2018).</li>
<li>Choi, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Thrombin+Receptor+Restricts+Subventricular+Zone+Neural+Stem+Cell+Expansion+and+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9360(2018).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+novel+rat+neural+progenitor+clone+that+expresses+Dlx+family+transcription+factors+and+gives+rise+to+functional+GABAergic+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture.</a> Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+phenotypically+diverse+neural+culture+from+hESC+by+combining+adherent+and+dissociation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2018).</li>
<li>Dhara, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+progenitor+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures.</a> Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).</li>
<li>Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Biopsy+Method+for+Isolating+Neural+Stem+Cells+from+the+Subventricular+Zone+of+the+Adult+Rat+Brain+for+Autologous+Transplantation+in+CNS+Injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries.</a> Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).</li>
<li>Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerrari%2C+D+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22">Current Protocols in Stem Cell Biology</a>. , Chapter 2 Unit2D.6 (2010).</li>
<li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nature Protocols. 7 (2012), (2005).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+Number+is+a+Major+Contributor+to+Genomic+Structural+Variations+in+Mouse+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs.</a> Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).</li>
<li>Diaferia, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Chromosomal+Analysis+of+Cultured+Mouse+Neural+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines.</a> Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).</li>
<li>Hemmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Neural+Stem+Cells+Achieve+Long-Term+Survival+and+Functional+Integration+in+the+Adult+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+Protocols+for+Surface+and+Intracellular+Antigen+Analyses+of+Neural+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241(2014).</li>
<li>Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnesium+lithospermate+B+promotes+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+in+vitro+and+enhances+neurogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo.</a> Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).</li>
<li>Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle1+as+positive+regulator+of+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation.</a> Neuroscience. 364, 107-121 (2017).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+differentiation+from+human+neural+stem+cells%3A+A+novel+role+for+c-Src%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src.</a> Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).</li>
<li>Palanisamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxytocin+alters+cell+fate+selection+of+rat+neural+progenitor+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191160(2018).</li>
<li>Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+dynamic+synaptic+reorganization+after+GABAergic+precursor+cell+transplantation+into+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).</li>
<li>Precious, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP1+marks+medium+spiny+neurons+from+precursors+to+maturity+and+is+required+for+their+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation.</a> Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).</li>
</ol>

Kein Interessenkonflikt erklärt.

Mit einer geeigneten Bezugsquelle von neuralen Stammzellen ist sehr wichtig für die Neurowissenschaftler. Neurale Stammzellen könnten aus verschiedenen Bereichen des Gehirns Embryo geerntet werden und sie können bestimmte Typen von Neuronen und Gliazellen zu generieren. Es gibt mehrere Methoden für die Induktion der Differenzierung der neuralen Stammzellen induzieren sie Reifen Neuronen und Gliazellen zu generieren. Es gibt zahlreiche Berichte, wonach unter bestimmten Kulturbedingungen und trophischen Faktor Regimenter, ...

Neurale Stammzellen (NSCs) befinden sich in verschiedenen Regionen des Gehirns Erwachsener und Embryo und sie haben eine Tendenz, verschiedene Arten von Neuronen und Gliazelle1zu generieren. Die subventricular Zonen im erwachsenen Gehirn von Säugetieren2 und ganglionic Eminenz im Embryo Gehirn sind NSC reichen Regionen3. In das sich entwickelnde Gehirn liefert die ganglionic Eminenz die meisten kortikale Interneurone und insbesondere GABAergen Interneuronen3. Es gibt auch weniger invasiven Methoden zur Erzeugung von neuronalen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen (WSR) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), die Senkung der Nachfrage nach Tier verwenden. Trotz der Tatsache, dass die Erzeugung von NSCs aus WSR oder iPSCs möglich4,5ist hat es einige vor- und Nachteile im Vergleich zur Isolierung von neuralen Stammzellen von Erwachsenen oder Embryo Gehirn6,7, 8. Die Protokolle zur Induktion der Differenzierung der WSR und iPSCs gegenüber neuronalen Phänotypen sind immer Zeit- und verbrauchen und die Rate der Erfolg (70-80 % Nestin positive Zellen)5 sind niedriger im Vergleich mit direkten Isolierung der NSCs aus dem tierischen Gehirn ( mehr als 99 % Nestin positive Zellen)9. Darüber hinaus verlieren die Stammzellen ihre genetische Stabilität und Differenzierung Tendenz nach mehreren Passagen10,11. Obwohl es andere neue Berichte über die direkte Umwandlung von Körperzellen in NSCs gibt, diese Zellen sind gentechnisch verändert und sind nicht leicht zugänglich in jedem Labor-12. Daher gibt es noch eine große Nachfrage für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus dem tierischen Gehirn; Es ist möglich, die Menge an tierischen Verbrauch zu reduzieren, durch die Verbesserung der Operationstechniken. Durch Reduzierung der OP-Dauer und die Techniken zu verbessern, ist es möglich, halten Zellen weg von Schäden und die höchste Rate an NSCs von jedem Tier zu erhalten.
Hier stellen wir eine vereinfachte und reproduzierbare Technik zur Isolierung von neuronalen Stammzellen von Embryos Gehirn der Maus E13 .

<table><tbody><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Adson Pinzette, 12 cm, gerade</td><td>WPI</td><td>14226</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Schale 10cm&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Verbandzange, 12,5 cm, gerade</td><td>WPI</td><td>15908</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzette, 11 cm, gerade</td><td>WPI</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glutamat</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G3291</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen Anti Kaninchen FITC konjugierter Sekundärantikörper</td><td>Sigma</td><td>AP307F</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Heparin&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>h3149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>90909C</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritze mit 25-27 Gauge Nadel&nbsp;</td><td>SUPA medical</td><td>A1SNL127</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>sigma&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma</td><td>M2279</td><td></td></tr><tr><td>N2 Ergänzung</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NB Medium</td><td>Gibco</td><td>21103-31</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäure (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PBS ohne Ca und Mg</td><td>Gibco</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/ Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>5140122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; P4957</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Maus Beta Tubulin-III Antikörper</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti Maus GFAP Antikörper</td><td>Sigma</td><td>G4546</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti Maus Nestin Antikörper</td><td>Sigma</td><td>N5413</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff #3</td><td>WPI</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Schere Kurve</td><td>WPI</td><td>14396</td><td></td></tr><tr><td>Schere scharf gerade</td><td>WPI</td><td>14192</td><td></td></tr><tr><td>Sojabohnen-Trypsin-Hemmer</td><td>Roche</td><td>10109886001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturflaschen, T25</td><td>BD</td><td>353014</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturflaschen, T75</td><td>BD</td><td>353024</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Schere, 8 cm, gerade&nbsp;</td><td>WPI</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation und kultur der embryonalen maus neurale stammzellen

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neurale Stammzellen (NSCs) multipotent sind und kann die drei wichtigsten Zelltypen des zentralen Nervensystems (ZNS) entstehen. In-vitro- Kultur und den Ausbau der NSCs bieten eine geeignete Quelle von Zellen für Neurologen, die Funktion von Neuronen zu studieren und Gliazellen zusammen mit ihren Interaktionen. Es gibt verschiedene gemeldeten Techniken für die Isolierung von neuralen Stammzellen von Erwachsenen oder Embryo Säugetier-Gehirne. Während der mikrochirurgischen Operation, NSCs aus verschiedenen Regionen des embryonalen ZNS zu isolieren ist es sehr wichtig, den Schaden zu reduzieren, die Gehirnzellen, das höchste Verhältnis von Live- und erweiterbare Stammzellen zu erhalten. Eine mögliche Technik zum Stressabbau während Isolierung dieser Zellen aus dem Gehirn der Maus-Embryo ist die Reduzierung von OP-Dauer. Hier zeigen wir eine entwickelte Technik für schnelle Isolierung dieser Zellen aus der E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz. Chirurgische Eingriffe sind Ernte E13 -Maus-Embryonen aus der Gebärmutter, schneiden die vordere Fontanelle des Embryos mit einer gebogenen Nadelspitze, extrahieren das Gehirn aus dem Schädel, Mikrodissektion von isolierten Gehirn ganglionic Eminenz zu ernten, Dissoziation des geernteten Gewebes im NSC Medium um eine einzelne Zelle Aussetzung zu gewinnen und schließlich Beschichtung Zellen in Suspensionskultur, Neurosphären zu generieren.

Micro-Dissektion, Zelle Isolation und Kultur Neurosphäre. Hier präsentierten wir eine schnelle und effiziente Methode zur Maus E13 Gehirn Mikrochirurgie und Isolierung von neuralen Stammzellen. Dieser Artikel zeigt, dass es möglich ist, das ganze Gehirn von einem E13 Maus Embryo Schädel durch einen feinen Bruch im vorderen Fontanelle zu entfernen. Mit dieser Methode wird das Gehirn erträgt weniger Schaden und es ist möglich, Zellen aus verschiedenen ...

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Das Ziel dieses Videoprotokolls ist die Etablierung eines Quell- und effizienten Protokolls für embryonale Maus-Neural-Stammzellisolation und -kultur. Hallo, ich bin Maryam Sadeghi-Zadeh. Ich bin Masterstudent für Zell- und Molekularbiologie am Royan Institute.Heute wollen ich und mein Kollege Ihnen zeigen, wie man neuronale Stammzell von 13 embryomausenkinischen Eminenz erntet. Hallo, ich bin Bahareh Alizadeh-Shoorjestan. Ich bin Masterstudent für Zell- und Molekularbiologie in der Stammzellabteilung des Royan Institute for Biotechnology.Hallo, ich bin Reza Dehghani-Varnamkhasti. Außerdem studiere ich Zell- und Molekularbiologie am Royan Institute. Chirurgische Verfahren umfassen die Ernte von jedem 13 Maus-Embryonen aus der Gebärmutter.Schneiden sie die Vorderseite des Fontanels des Embryos mit einer gebogenen Nadelspitze, die das Gehirn aus dem Schädel extrahiert. Mikro-Sektion des isolierten Gehirns, um die ganglionische Eminenz zu ernten. Dissoziation des geernteten Gewebes in einem neuronalen Stammzellmedium, um eine einzelzellige Suspension zu erhalten.Und schließlich, Beschichtung von Zellen in einer Suspensionskultur, um Nervenzellen zu erzeugen. Reinigen und desinfizieren Sie die Haut des Bauchbereichs durch Sprühen mit 70% Ethanol. Kontrollieren Sie die Haut nach oben Bauch und dann schneiden Sie die Haut und betonte Gesichtsmitschnitt mit Schere, um Bauchhöhle und Gebärmutterhörner aufzudecken.Entfernen Sie die Gebärmutterhörner, die die Embryonen enthalten, per Schere und übertragen Sie sie in ein 50 ml konisches Rohr mit 25 ml kaltem HEPES MEM Puffer. Legen Sie das konische Rohr unter die laminale Durchflusshaube. Öffnen Sie die Kappe unter der Haube.Bringen Sie die Uterushörner aus der Röhre und spülen Sie dreimal mit genügend Volumen des frischen kalten HEPES MEM Puffers, um Schmutz und Blut zu beseitigen. Übertragen Sie das Gebärmuttergewebe in eine 10 cm Petrischale mit 7 bis 10 ml kaltem HEPES MEM Puffer. Öffnen Sie die Uterushörner mit einer feinen Schere und übertragen Sie Embryonen in eine neue Schale, die 7 bis 10 ml kalten HEPES MEM Puffer enthält.Nun stellen Sie die 10 cm Schale mit Embryonen unter das Seziermikroskop für den Mikro-Sektionsbetrieb. Biegen Sie die Spitze einer Spritzennadel, indem Sie ihre Spitze auf einen Stahlskalpellklingengriff drücken. Biegen Sie die Spitze der Nadel, bis die Spitze in einem Winkel von 70 bis 90 Grad gebogen ist.Überprüfen Sie die Spitze der Nadel unter dem Sezieren des Mikroskops, um die Biegung an der Spitze der Nadel zu sehen. Natürlich haben Embryonen dabei eine seitliche Position. Ohne ihre Position zu ändern, hielten Sie den Hals und Körper des Embryos mit feiner Zange und legen Sie dann den gebogenen Teil der Nadel tief in die Vorderseite des Fontanels des Embryokopfes.Dort würde es eine kleine Blutung oder ein Blutgerinnsel geben. Bewegen Sie die Nadelspitze oberflächlich, während sich der gebogene Teil innerhalb der Wölbung in Richtung Stirn und dann in Richtung hinterden Kopf befindet. Achten Sie darauf, durch die Haut und den Schädel zu schneiden, und nicht das darunter liegende Gehirn zu beschädigen.Drücken Sie die Haut mit der Nadelspitze seitlich, um das Gehirn zu entdecken. Setzen Sie die Nadel von der seitlichen Seite der Haut auf den unter dem Rahmen von der seitlichen Seite der Haut in den Bereich unter dem Gehirn. Und dann entfernen Sie das Gehirn von dieser Kopfhaut, indem Sie es schieben, um aus dem sezierten Schädel zu kommen.Die ganglionische Eminenz wird im Video mit ihren medialen und seitlichen Teilen deutlich dargestellt. Halten Sie das Gehirn stabil mit den Pflegezangen und dann mit Mikroschere, um den Kortex jeder Hemisphäre zu schneiden, um die ganglien Eminenz zu entlarven. Halten Sie das Gehirn und legen Sie sezierte ganglionische Eminenz in die 15 ml Zentrifugenröhre mit neuronalen Stammzellenmedien.Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte Gehirn mikroseziert wurde. Schneiden Sie sezierte ganglionische Eminenz, indem Sie die Pipettespitze gegen den Boden des Rohres und Pipette die Suspension nach oben und unten für 2 5 Mal, um das Gewebe zu brechen, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 110 g für 5 Minuten.Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml 0,05%Tube in EDTA wieder aus. Inkubieren Sie die Zellsuspension in einem 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Und dann fügen Sie ein gleichwertiges Volumen von Soja-Trypsin-Hemmer, um Trypsin-Aktivität zu stoppen.Pipette die Zellsuspension nach oben und unten, um sicherzustellen, dass das Trypsin vollständig inaktiviert wurde. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 110 g für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml vollständiger neuronaler Stammzellmedium und zählen Sie die Anzahl der Zellen.Die Zellen an neuronalen Stammzellenmedium in den geeigneten Gewebekulturkolben der Größe einschließen. 5 ml 2T25, 20 ml auf T75 und 40 ml auf T175-Flaschen übertragen. Neurosphären erscheinen nach 3 Tagen Kultur bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2.Um die Neurosphären zu saugen, übertragen Sie das Medium mit schwebenden Neurosphären für 5 Minuten auf die Zentrifuge zu Zentrifuge bei 110 g und entsorgen Dann den Überstand. Bei 1 ml 0,05% Trypsin EDTA und bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren. Dann inaktivieren Sie das Trypsin mit Sojatyrpsin-Inhibitor und Pipette die Neurosphären sanft nach oben und unten, um sie zu einzelnen Zellen zu machen.Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 110 g für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 1 ml neuronalen Stammzellenmedium. Diese Zellen sind bereit für die Kultur des nächsten Schritts auf Laminat und voll beschichtete Oberfläche für fortgeschrittene Experimente.Durch den Anbau von einer Million primärer neuronaler Stammzellen nach sieben Tagen wird die Anzahl der Zellen auf drei bis vier Millionen ansteigen. Nach sechs bis sieben Tagen sollten die Kugeln zwischen 150 und 200 Mikrometer Durchmesser messen und in Abwesenheit von bFGF und EGF für die neuronale Differenzierung für die Subkultur auf Laminat-Poly-Ornithin-beschichteten Schalen bereit sein. Flow Cytometry Assay Ergebnisse zeigen, dass fast 95% der Zellen, die die Neurosphären bildeten Nestin-positiv, die ein bekannter Marker für neuronale Stammzellen ist.Assays mit Beta-Tubulin III und Ganglio-Faserprotein-Antikörpern zeigen, dass durch die Kultivierung neuronaler Stammzellen auf beschichteter Oberfläche etwa 94% neuronaler Phänotyp und etwa 5% gliaren Phänotyp zeigen. In nur diesem kurzen Video eine Labortechnik zur schnellen Isolierung der neuronalen Stammzelle von 13 Mausembryonk-Ganglionen-Eminenz. Ich hoffe, Dass Sie in Ihrer neuronalen Stammzellkultur erfolgreich sein werden.

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video beschreibt die Methode zur Isolierung von neuroprecursors aus den Entwicklungsländern Kortex embryonaler Mäuse verwendet. Das Verfahren zur Entfernung von Embryonen aus der Gebärmutter, sezieren die kortikale Gewebe und verdauen die isolierten Hirnrinde dargestellt.

Kultur der Maus Neural Stem Cell Precursors

Dieses Video-Protokoll zeigt die Anwendung der Neurosphäre Assay für die Isolierung und Expansion von neuronalen Stammzellen, die aus den Ganglien-Eminenzen der embryonalen Tag 14-Maus-Gehirn.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

Ein alternativer Weg zur Isolierung von embryonalen Maus-Motoneurone aus dem Rückenmark beschrieben. Die Methode berücksichtigt die Tatsache, dass Lektin kann die geringe Affinität nerve growth factor receptor p75NTR binden. Das Lektin-basierte preplating ermöglicht eine Reinigung ähnlich wie mit einem spezifischen Antikörper gegen das p75NTR.

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Isolierung von embryonalen Neuralleiste vom Neuralrohr erleichtert die Verwendung...

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

Das Video zeigt den Prozess der Isolierung und Kultivierung von neuralen Stammzellen aus der subkallosalen Zone des Mäusegehirns. Dabei geht es um das Präparieren von Gewebe, die enzymatische Dissoziation und die Kultivierung mit Differenzierungsfaktoren, um sich zu reifen Nervenzellen zu entwickeln.

Isolierung und Kultivierung adulter neuraler Stammzellen aus der subkallosalen Zone der Maus

Dieses Video demonstriert eine Methode zur in vitro Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen (NPCs) aus embryonalen Stammzellen (mESCs) der Maus. Die mES-Zellen werden in Suspension kultiviert, um Embryoidkörper (EBs) zu bilden, die dann durch Retinsäurebehandlung in einer adhärenten Kultur zur Differenzierung in NPCs geführt werden.

Eine Technik zur Erzeugung neuraler Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von Stammzellen aus dem postnatalen Kleinhirn der Maus und zur Differenzierung in Nervenzellen. Stammzellen aus der isolierten Zellsuspension werden mit Antikörper-beschichteten Magnetbeads aufgereinigt und zu Neurosphären kultiviert. Die Neurosphären werden dann in einem Differenzierungsmedium gehalten, um Nervenzellen zu erzeugen.

Isolierung von Stammzellen aus dem postnatalen Kleinhirn der Maus und Differenzierung in Nervenzellen

Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Methode zur Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen unter Verwendung einer serumfreien Monolayer-Methode. Diese Vorläuferzellen können verwendet werden, um reife neuronale Zelltypen abzuleiten oder den Prozess der neuronalen Spezifikation zu untersuchen, und sind für die Skalierung im Multiwell-Format für das Screening von Verbindungen zugänglich.

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

Die Etablierung von Kultursystemen für die Expansion adulter neuraler Stammzellen (aNSCs) ermöglicht die Untersuchung und Anwendung von aNSCs für die Therapie. Die subkallosale Zone (SCZ) wurde kürzlich als neuartige Neuroblasten-bildende Region bei erwachsenen Mäusen erkannt. Hier werden Methoden zur Isolierung, Expansion und Differenzierung von SCZ-aNSCs beschrieben.

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Lernen Sie die Isolierung und Kultur embryonaler Maus-Neuralstammzellen aus der Ganglienhöckerregion. Diese Mikrochirurgie-Technik liefert hochwertige Zellen für die Neurogenese-Forschung.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

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