Name: Neue Sequenz Entdeckung durch subtraktive Genomics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Erfahren Sie subtraktive Genomik zur Identifizierung neuer Sequenzen, die sich nicht von co-purifizierenden Sequenzen isolieren lassen. Diese kostengünstige Methode nutzt freie Software und ist flexibel für verschiedene biologische Fragestellungen.

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Die Autoren erkennen Michelle Biederman, Alyssa Pedersen und Colin J. Saldanha für ihre Hilfe mit dem Zebrafinken Genomics Projekt in verschiedenen Stadien. Wir anerkennen auch Evgeny Bisk für computing-Cluster-System-Administration und NIH Grant 1K22CA184297 (zu J.R.B.) und NIH-NS-042767 (zu C.J.S).

1. de Novo montieren beginnend Sequenz
Hinweis: Alle Next-Generation-Sequenz (NGS) Daten können verwendet werden, solange eine Baugruppe aus diesen Daten hergestellt werden kann. Geeignete Eingabedaten enthält Illumina, PacBio, oder Oxford Nanopore montierten in einer Fasta-Datei liest. Für Konkretheit, dieser Abschnitt beschreibt eine Illumina-basierte transkriptomischen-Assembly für die Zebrafinken-Studie führten wir7; Beachten Sie jedoch, dass die Besonderheiten werden je nach Projekt variieren. Für unser Beispielprojekt wurden raw-Daten stammen aus einer MiSeq und ca. 10 Millionen gekoppelten liest von jeder Probe.
<ol><li>Verwenden Sie Trimmomatic 0.3214 , Illumina-Adapter und minderwertige Basen zu entfernen. In der Befehlszeile eingeben: Java-jar Trimmomatic 0.32.jar PE-phred33 forward.fq.gz reverse.fq.gz - Baseout Quality_and_adaptor_trimmed ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 führende: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:40
</li>
	<li>Verwenden Sie Birne15 v. 0.9.6 erstellen Sie qualitativ hochwertige zusammengeführten liest aus Trimmomatic Ausgang gepaart liest, mit Standard-Parameter. In der Befehlszeile eingeben: Birne -f < quality_and_adaptor_trimmed_1P.fastq > - R < quality_and_adaptor_trimmed_2P.fastq >
</li>
	<li>Verwendung Reptil v. 1.116 , Fehler zu korrigieren die Lesevorgänge durch Birne produziert. Folgen Sie das Schritt für Schritt17beschriebene Protokoll.</li>
	<li>Verwenden von Trinity v. 2.4.018 im Standardmodus die korrigierten Sequenzen zusammenstellen. Für Strang-spezifischen Bibliotheken, verwenden Sie den - SS_lib_type-Parameter. Die Ausgabe ist einer Fasta-Datei (your_assembly.fasta). In der Befehlszeile eingeben: Trinity--SeqType Fq - SS_lib_type FR – Max 10G – Ausgang Trinity_output--links quality_and_adaptor_trimmed_forward_paired_reads.fq – quality_and_adaptor_trimmed_reverse_paired_reads.fq – CPU 10 rechts Hinweis: Die Ausgabe wird in einem neuen Verzeichnis, Trinity_output, platziert und die Versammlung wird den Namen "Trinity.fasta", die als Your_assembly.fasta umbenannt werden können, falls gewünscht. Die Trinity-Website für weitere Informationen siehe: https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Running-Trinity.</li>
</ol>(2) sprengen Sie die Versammlung gegen die Referenzsequenz
Hinweis: Verwendung liest sich diesen Schritt, wenn der Verweis eine Montage oder lange ist wie Sanger; Es besteht aus Roh Illumina liest, finden Sie in Schritt 3 unten die Abfrage liest zuordnen. Alle BLAST Schritte wurden mit Version 2.2.29+ abgeschlossen, obwohl die Befehle auf jedem aktuellen BLAST-Version funktionieren sollte.
<ol><li>Machen Sie eine Datenbank mit BLAST Referenzsequenz (nucleotide_reference.fasta) in der Befehlszeile. Geben Sie in der Befehlszeile Folgendes ein: Makeblastdb - Dbtype Nucl-in nucleotide_reference.fasta-, nucleotide_reference.db
</li>
	<li>BLAST-Match der Abfrageassembly (in Schritt 1 generiert), Referenz-Datenbank. Um eine Ausgabe-Datei zu erhalten, verwenden [-, BLAST_results.txt] und um tabellarische Ausgabe (erforderlich für nachfolgende Bearbeitungsschritte mit Python-Skripten) zu generieren, verwenden Sie [-Outfmt 6]. Diese Optionen können in beliebiger Reihenfolge kombiniert werden, ist so ein Beispiel komplett Befehl [Blastn-your_assembly.fasta - Db nucleotide_reference.db Abfragen-, BLAST_results.txt - Outfmt 6]. Wenn eine e-Wert-Einstellung gewünscht wird, verwenden Sie die Option - Evalue mit einer angemessenen Zahl, z. B. [Evalue-1e-6]. Beachten Sie jedoch, dass der subtraktiven Zyklus effektiv die Evalue in festlegen, wie die Diskussion unter invertiert.</li>
	<li>Verwenden Sie für erhöhte Stringenz Proteinsequenzen aus der Baugruppe als die BLAST-Abfrage mit übersetzten Nukleotid BLAST (tBLASTn), die 6-Wege-Übersetzung (Nukleotid) Datenbank ausführt. Diese Methode empfiehlt sich für die meisten nicht-Modellsysteme, das Problem der unvollständigen Protein Anmerkungen zu vermeiden.<ol>
<li>Gewährleisten den richtigen genetischen Code für den Organismus ausgewählt ist, studiert, mit Hilfe der Db_gencode-Option. Um Proteinsequenzen für die Abfrage zu erhalten, führen Sie den TransDecoder.LongOrfs-Befehl (aus TransDecoder Paket v. 3.0.1) um die längste open Reading Frames zusammengebaute Abfrage Sequenzen zu identifizieren. Der Befehl lautet [TransDecoder.LongOrfs -t your_assembly.fasta]; die Ausgabe wird im Verzeichnis mit dem Namen "transcripts.transdecoder_dir" platziert werden und enthält eine Datei namens longest_orfs.pep, die die längste vorhergesagten Proteinsequenzen aus jeder Sequenz in your_assembly.fasta enthalten.</li>
		<li>Um tBLASTn zu verwenden, führen Sie den Befehl [Tblastn-longest_orfs.pep - Db nucleotide_reference.db Abfragen-, BLAST_results.txt - Outfmt 6]. Wenn eine hochwertiges Eiweiß-Referenz zur Verfügung steht, verwenden Sie Proteinprotein Abgleich mit BLASTp statt tBLASTn.</li>
		<li>Eine Explosion-Datenbank der Protein-Referenz zu machen [Makeblastdb - Dbtype Prot-in protein_reference.fasta-, protein_reference.db] und dann [Blastp-longest_orfs.pep - Db protein_reference.db Abfragen-, BLAST_results.txt - Outfmt 6]. Achten Sie darauf, die Ergebnisse als Datei für die Weiterverarbeitung zu speichern, und verwenden Sie tabellarische (Outfmt 6) um sicherzustellen, dass die Python-Skripte korrekt analysiert werden können.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Karte liest auf der Baugruppe
Hinweis: Diese Methode kann verwendet werden, wenn die Referenz-Dataset aus rohen genomische liest, anstatt montierten Sequenzen besteht oder Sanger, in welchem Fall verwenden BLAST (Schritt 2.1 Sequenzen).
<ol><li>Mit BWA-MEM v. 0.7.1219 oder bowtie220, ordnen Sie die heruntergeladenen roh liest (raw_reads.fastq) auf der Abfrageassembly. Der Ausgang ist .sam Format. Befehle sind wie folgt: zuerst index die Versammlung: [Bwa-Index-your_assembly.fasta], und ordnen Sie die lautet [Bwa Mem your_assembly.fasta raw_reads.fastq > mapped.sam]. (Hinweis der ">" Symbol hier ist nicht mehr-als-Zeichen; stattdessen weist es die Ausgabe in die Datei mapped.sam gehen).</li>
</ol>4. verwenden Sie Python-Skript keine passenden Sequenzen entfernen
Anmerkung: Skripts Arbeit mit Python 2.7 versehen.
<ol><li>Benutzen Sie nach Schritt2 subtraktive Python-Skript mit dem Befehl [./Non-matching_sequences.py your_assembly.fasta BLAST_results.txt]. Sicherstellen Sie bevor Sie das Skript ausführen, dass die BLAST-Ausgabe-Datei im Format 6 (tabellarisch). Das Skript gibt eine Datei mit nicht übereinstimmenden Sequenzen im Fasta-Format mit dem Namen your_assembly.fasta_non-matching_sequences_BLAST_results.txt.fasta und auch die passenden Sequenzen für Aufzeichnungen, als your_assembly.fasta_matching_sequences_BLAST_ Results.txt.FASTA. die nicht übereinstimmenden Datei werden die wichtigsten, als eine Quelle für mögliche T-Sequenzen zum Testen und weitere Zyklen der subtraktiven Genomics.</li>
	<li>Nach Schritt 3, laufen das Python-Skript removeUnmapped.py zu nehmen als Eingang .sam aus Schritt 3.1, und identifiziert die Namen der Abfrage Sequenzen ohne jede passende liest und speichert diese auf eine neue Textdatei. Verwenden Sie den Befehl [./removeUnmapped.py mapped.sam] und der Ausgang ist mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt. (Das Programm generiert eine abgespeckte Sam-Datei mit alle nicht zugeordneten liest entfernt, diese Datei kann ignoriert werden, für Zwecke dieses Protokolls kann jedoch für andere Analysen nützlich).</li>
	<li>Wie die Ausgabe des vorherigen Schrittes eine Liste der Namen der Sequenz in eine Textdatei namens mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt ist, extrahieren eine Fasta-Datei mit diesen Sequenzen: [./getContig.py your_assembly.fasta mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt]. Die Ausgabe ist eine Datei namens mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt.fasta.</li>
</ol>5. Design Primer für die Sequenz, die bleibt
Hinweis: an dieser Stelle gibt es eine Fasta-Datei mit Kandidat T Sequenzen. Dieser Abschnitt beschreibt qPCR experimentell zu testen, ob sie aus T oder bisher unbekannte Regionen der R. kommen Wenn die Subtraktion in Schritt 4 alle Sequenzen entfernt, dann die Erstmontage konnte T einschließen oder Subtraktion kann zu streng gewesen.
<ol><li>Verwenden Sie Geneious21 , um optimale Grundierung Sequenzen manuell bestimmen.<ol>
<li>Markieren Sie eine Kandidat Abfolge von 21-28 bp für die Forward Primer. Vermeiden Sie läuft von 4 oder mehr von jedem Untergrund. Versuchen Sie, eine Region mit einer relativ einheitlichen Kombination aus allen Basenpaaren abzielen. Eine einzelne G oder C am 3'-Ende ist vorteilhaft, zu den Primer verankern hilft.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Registerkarte " Statistik " auf der rechten Seite des Bildschirms anzeigen, dass Sequenz Schmelztemperatur (Tm) geschätzt, da der Kandidat Bereich hervorgehoben ist. Blick auf eine Schmelztemperatur zwischen 55-60 ° C, unter Vermeidung von Wiederholungen und lange Läufe G/c zu erhalten</li>
		<li>Führen Sie die Schritte 5.1.1. und 5.1.2 eine rückwärts-Primer wählen befindet sich 150-250 Basenpaare 3' forward Primer. Während die Grundierung Längen nicht übereinstimmen müssen, sollte das vorhergesagte Tm so nah wie möglich an die Tm der forward Primer. Achten Sie darauf, ergänzen die Reihenfolge umkehren (wenn in Geneious Rechtsklick auf, während die Sequenz markiert ist ist es eine Menü-Option).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Funktion Besser gekleideteres Design , das in der oberen Symbolleiste im Fenster "Sequenz" vorkommt.<ol>
<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche " Besser gekleideteres Design ". Legen Sie die Region um unter Zielregionzu verstärken.</li>
		<li>Fügen Sie unter der Registerkarte " Eigenschaften " gewünschte Größe, Schmelztemperatur (Tm) und % GC (siehe Punkt 5.1.1.).</li>
		<li>Klicken Sie auf "OK" , um Zündkapseln generiert haben. Bestellen Sie die Primer durch einen benutzerdefinierten Oligo-Service.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Validieren Sie Primer mit Kontrolle DNA (Codierung T und R) Tm und Erweiterung Zeit optimieren. Verwenden regelmäßige Taq und Gelelektrophorese Bandgröße zu sehen, aber Optimierung kann auch mit folgenden Methoden in Schritt 6 qPCR durchgeführt werden.<ol>
<li>10 X Verdünnungen von forward und reverse Primer zu machen, so dass die Primer eine Konzentration von 10 μM.</li>
		<li>PCR aus 0,5 μl dNTP, 0,5 μL vorwärts Grundierung, 0,5 μL der rückwärts-Primer, 0,1 μL der Taq Polymerase, 2 μL der Vorlage, 0,75 μL des Magnesiums, 2,5 μL des Puffers und 18.15 μl Wasser verwenden, so dass es 25 μL pro Vorlage mit einer Konzentration von 5 gibt ng / ΜL.</li>
		<li>Testen Sie die Primer an verschiedenen Schmelztemperaturen in der PCR-Programm. In der Regel ist die optimale Leistung beobachteten Schmelztemperaturen leicht unter dem vorhergesagten Tm der Primer, aber in der Regel nicht über 60 ° C. Testen Sie auch auf optimale Erweiterung jederzeit mit Hilfe dieser Anleitung: 1 min pro 1000 bp (also in der Regel 10-30 Sekunden je nach Länge der Amplifikate).</li>
		<li>Durchführen Sie Endpunkt-Gelelektrophorese zu bestätigen, dass die Primer die erwartete Reihenfolge verstärken. Laufen Sie 25 μL des Messguts qPCR gemischt mit 5 μl 6 X Glycerin Farbstoff auf einem 2 % TAE Agarose-Gel bei 200 V für 20 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. qPCR Validierung der restlichen Sequenz
Hinweis: Dieser Schritt erfordert Primer validiert und PCR-Bedingungen, die in Schritt 5 festgelegt.
<ol><li>Führen Sie jede Vorlage in dreifacher Ausfertigung mit der folgenden Mischung; 12.5 μL PowerSYBR Green-master-Mix, 0,5 μL vorwärts Grundierung mit einer Konzentration von 10 μM, 0,5 μL der rückwärts-Primer mit einer Konzentration von 10 μM, 10,5 μL des Wassers und 1 μl DNA-Vorlage (in einer Konzentration von 2 ng/μl) , so dass jeder gut 25 μl Gesamtvolumen enthält.</li>
	<li>Führen Sie qPCR Programm informiert durch die validierte Temperatur und Verlängerung von Schritt 4 aus. Wir entwickelt und überprüft alle Primer kompatibel mit einem zwei-Phasen-Zyklus, 95 ° C für 10 min erste Schmelze, dann 40 Zyklen von 95 ° C für 30 s und 60 ° C für 1 min. Jedoch eine dreistufiges (Schmelze-Tempern-erweitern) Programm möglicherweise mehr optimal für die Primer und sollte bei Bedarf angepasst werden. Wir empfehlen, dass endgültige denaturierenden Kurven erzeugt werden zumindest zum ersten Mal die Primer in qPCR beschäftigt sind, um die Verstärkung eines einzelnen DNA-Produkts zu überprüfen.</li>
	<li>Maßnahme qPCR/SYBR Green signalisiert relativ Aktin (oder jedes andere geeignete 'R'-Steuerelement) durch CT. für alle Fälle zu berechnen, der Mittelwert und die Standardabweichung von 2-(gen Ct - β-Aktin Ct).</li>
	<li>(Optional) Führen Sie Endpunkt Gelelektrophorese um korrekte Größe Produkterkennung durch qPCR zu bestätigen. Hier laufen 25 μL des Messguts qPCR gemischt mit 5 μl 6 x Glycerin Farbstoff auf einem 2 % TAE Agarose-Gel bei 200 V für 20 Minuten.</li>
</ol>7. mit einen neuen Verweis auf Pare die Daten wiederholen .
Hinweis: Wenn Schritt 6 der identifizierten Sequenzen aus T validiert, am Ende des Zyklus hier (Abb. 2A). Allerdings kann eine Vielzahl von Überlegungen motivieren eine Fortsetzung des Zyklus, wenn zum Beispiel viele R Sequenzen in der Datei bleiben oder wenn keiner der Kandidaten T Sequenzen von qPCR validiert wurden in Schritt 6.
<ol><li>Erhalten Sie eine neue Referenz. Dieser Schritt ermöglicht eine neue Iteration des Zyklus und genomische Rohdaten, RNA-Seq-Rohdaten oder anderen zusammengesetzten Datasets beinhalten. Wertvolle Ressourcen für Referenzdaten umfassen die Genom-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome) welche Geschäfte Genome zugänglich per FTP (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/), montiert und der Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) wo rohe nächsten Generation Sequenz liest gespeichert sind. Genom-Projekte können ihre rohen Sequenzdaten durch andere Projekt verbundenen Websites und Datenbanken.</li>
</ol>

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<li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oxytricha+trifallax+Mitochondrial+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biologyogy+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The Oxytricha trifallax Mitochondrial Genome.</a> Genome Biologyogy and Evolution. 4 (2), 136-154 (2011).</li>
<li>Barth, D., Berendonk, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome+sequence+of+the+ciliate+Paramecium+caudatum+reveals+a+shift+in+nucleotide+composition+and+codon+usage+within+the+genus+Paramecium%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium.</a> BMC Genomics. 12 (1), (2011).</li>
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<li>Herschleb, J., Ananiev, G., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed-field+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Pulsed-field gel electrophoresis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während subtraktiven Genomics mächtig ist, ist es kein Cookie-Cutter-Ansatz, Anpassung an mehreren wichtigen Schritte und sorgfältige Auswahl von Referenz-Sequenzen und Proben. Wenn die Abfrageassembly von schlechter Qualität ist, könnte Filterung Schritte nur Montage Artefakte isolieren. Daher ist es wichtig, die de Novo Assemblierung über eine entsprechende Validierung-Protokoll für das jeweilige Projekt gründlich zu überprüfen. RNA-Seq sind Leitlinien vorgesehen auf der Trinity Website18</su...

Der Zweck dieser Methode ist, eine neuartige Ziel (T) genomischen Sequenz, entweder DNA oder RNA, aus einer genomischen Kontext oder Referenz (R) (Abbildung 1) zu identifizieren. Die Methode ist besonders hilfreich, wenn das Ziel nicht physisch getrennt werden, oder es teuer wäre, dies zu tun. Nur wenige Organismen haben Genome für die Subtraktion, perfekt beendet, so dass eine entscheidende Neuerung unserer Methode ist die Kombination aus Rechenleistung und Bank-Methoden in einem Zyklus Forscher um Zielsequenzen zu isolieren, wenn der Verweis nicht perfekt ist, oder ein Entwurf Genom von einem Modellorganismus. Am Ende eines Zyklus wird qPCR Tests verwendet, um festzustellen, ob weitere Subtraktion benötigt wird. Eine validierte Kandidat T-Sequenz zeigt statistisch höhere Erkennung in bekannten T-positiven Proben von qPCR.
Inkarnationen des Verfahrens wurden in Entdeckung neuer bakterielle Drug Targets, die keinen Host homologe1,2,3,4 und Identifikation von neuartigen Viren von infizierten Rechnern umgesetzt 5,6. Zusätzlich zur Identifikation von T kann die Methode verbessern R: wir vor kurzem die Methode verwendet, um 936 fehlenden Gene aus dem Zebrafinken Bezug Genom und aus eine Keimbahn-nur Chromosom (T)7ein neues Gen zu identifizieren. Subtraktive Genomics ist besonders wertvoll, wenn T extrem abweichend von bekannten Sequenzen sein dürfte, oder wenn die Identität des T ist im großen und ganzen nicht definiert, wie in der Zebrafinken Keimbahn eingeschränkt Chromosom7.
Durch die Forderung nicht positive Identifizierung T im Voraus, ist ein entscheidender Vorteil der subtraktiven Genomik, dass es Objektive. In einer aktuellen Studie untersuchten Readhead Et Al. die Beziehung zwischen Alzheimer und virale Fülle in vier Regionen des Gehirns. Für virale Identifizierung erstellt Readhead Et Al. eine Datenbank von 515 Viren8, stark einschränken die virale Agents, die ihre Studie identifizieren konnten. Subtraktive Genomics hätte genutzt werden können, die gesunden und Alzheimer Genome zu vergleichen um mögliche neuartige Viren, verbunden mit der Krankheit, unabhängig von ihrer Ähnlichkeit mit bekannten Infektionserreger zu isolieren. Zwar gibt es 263 Menschen gezielt Viren bekannte, wurde es geschätzt, dass etwa 1,67 Millionen unentdeckte viral Arten existieren, mit 631.000-827.000 von ihnen haben ein Potenzial, Menschen9zu infizieren.
Isolation von neuartigen Viren ist ein Bereich, in dem subtraktiven Genomics ist besonders effektiv, aber einige Studien können keine strenge Methode benötigen. Studien zur Identifizierung neuartige Viren unvoreingenommene Hochdurchsatz-Sequenzierung gefolgt von reverse Transkription und sequenziert für virale Sequenzen5 oder Anreicherung von viralen Nukleinsäuren verwendet haben, zu extrahieren und umkehren transkribieren beispielsweise virale Sequenzen 6. während dieser Studien de Novo Sequenzierung und Montage beschäftigt, Subtraktion wurde nicht verwendet, weil die Zielsequenzen Blast positiv identifiziert wurden. Wenn die Viren wurden völlig neuartige und nicht in Zusammenhang stehen (oder weitläufig verwandten) zu anderen Viren subtraktiven Genomics gewesen wäre eine nützliche Technik. Der Vorteil der subtraktiven Genomik ist Sequenzen, die völlig neu sind können gewonnen werden. Wenn der Organismus Genom bekannt ist, kann es keine viralen Sequenzen verlassen, abgezogen werden. Zum Beispiel in unseren veröffentlichten Studie isoliert wir eine neuartige virale Sequenz von Zebrafinken durch subtraktive Genomics, aber es nicht unsere ursprüngliche Absicht7 war.
Subtraktive Genomics hat auch bei der Identifizierung von bakterieller Impfstoff Ziele, motiviert durch den dramatischen Anstieg der Resistenz gegen Antibiotika1,2,3,4bewährt. Zur Minimierung des Risikos der Autoimmunreaktion eingegrenzt Forscher die potentiellen Impfstoff Ziele durch Subtraktion alle Proteine, die homologe im menschlichen Wirt haben. Eine besondere Untersuchung, Corynebacterium Pseudotuberculosis, betrachten durchgeführt Subtraktion von Wirbeltieren Host Genomen von mehreren bakteriellen Genome um sicherzustellen, dass mögliche Drogeziele Proteine in der Hosts führt zu Nebenwirkungen nicht beeinträchtigen würde 1. grundlegende Arbeitsabläufe dieser Studien ist zum download des bakterielle Proteoms, lebenswichtige Proteine bestimmen, redundante Proteine zu entfernen, verwenden BLASTp, die wesentlichen Proteine zu isolieren und BLASTp gegen Gastgeber Proteom, um Proteine mit Host homologe zu entfernen 1 , 2 , 3 , 4. In diesem Fall subtraktiven Genomics sicherzustellen, dass die Impfstoffe entwickelt keiner Ziel-Host1,2,3,4auswirken werden.
Wir subtraktiven Genomics, das erste Protein-kodierenden gen auf Chromosom Keimbahn eingeschränkt (GRC) (in diesem Fall, T), zu identifizieren, die in Germlines gefunden wird aber keine somatischen Gewebe beider Geschlechter10. Vor dieser Studie war die nur genomische Informationen, die über das DRK bekannt war eine sich wiederholende Region11. De Novo Assemblierung wurde RNA aus dem Eierstock und Teste Gewebe (R + T) von Erwachsenen Zebrafinken sequenziert aufgeführt. Die rechnerische Beseitigung von Sequenzen erfolgte mittels veröffentlichten somatische (Muskel) Genom-Sequenz (R1)12, seine rohe (Sanger) zu lesen, Daten (R2) und eine somatische (Gehirn) Transkriptom (R3)13. Die sequentielle Verwendung von drei Referenzen wurde durch die qPCR Tests bei Schritt 5 eines jeden Zyklus (Abb. 2A), zeigen, dass zusätzliche Filterung erforderlich war getrieben. Das entdeckte α-SNAP-gen wurde durch qPCR von DNA und RNA, und Klonierung und Sequenzierung bestätigt. Wir zeigen in unserem Beispiel, dass diese Methode flexibel ist: Es ist nicht abhängig von passenden Nukleinsäuren (DNA Vs RNA) und die Subtraktion mit Referenzen (R), die aus Baugruppen oder roh liest bestehen durchgeführt werden kann.

<table><tbody><tr><td>Accustart II Taq DNA-Polymerase</td><td>Quanta Bio</td><td>95141</td><td></td></tr><tr><td>Suchwerkzeug für blasische lokale Ausrichtung (BLAST)</td><td></td><td></td><td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td></tr><tr><td>Bowtie 2</td><td></td><td></td><td>https://www.python.org/download/releases/2.7/</td></tr> <tr><td>BWA-MEM v. 0.7.12</td><td></td><td></td><td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td></tr><tr><td>Geneious</td><td></td><td></td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td></tr><tr><td>PEAR v. 0.9.6</td><td></td><td></td><td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td></tr><tr><td>Personal Computer</td><td>Biomatters</td><td></td><td>http://www.geneious.com/</td></tr> <tr><td>PowerSYBR qPCR Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Python v. 2.7</td><td></td><td></td><td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td></tr> <tr><td>Reptile v.1.1</td><td></td><td></td><td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile</td></tr><tr><td>Stratagene Mx3005P</td><td>Agilent Technologies</td><td>401456</td><td></td></tr><tr><td>TransDecoder v. 3.0.1</td><td></td><td></td><td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/</td></tr> <tr><td>Trinity v. 2.4.0</td><td></td><td></td><td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td></tr></tbody></table>

neue sequenz entdeckung durch subtraktive genomics

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtraktive Genomics kann verwendet werden, in jede Forschung, wo das Ziel ist, identifizieren die Sequenz eines Gens, Protein oder allgemeine Region, die in einem größeren genomische Kontext eingebettet ist. Subtraktive Genomics ermöglicht ein Forscher, eine Ziel-Sequenz von Interesse (T) durch umfassende Sequenzierung und Subtraktion bekannte genetische Elemente (Referenz, R) zu isolieren. Die Methode kann verwendet werden, um neuartige Sequenzen wie Mitochondrien, Chloroplasten, Viren zu identifizieren, oder Keimbahn eingeschränkt Chromosomen, und ist besonders nützlich, wenn T von R. beginnend mit umfassenden genomischen Daten (R + T), die Methode leicht isoliert werden kann verwendet grundlegende lokale Alignment Search Tool (BLAST) gegen eine Referenzsequenz oder Sequenzen, um den passenden bekannten Reihenfolgen (R), hinterlässt das Ziel (T) zu entfernen. Für die Subtraktion funktioniert am besten soll R ein relativ vollständigen Entwurf, der T. fehlt Seit Sequenzen nach Subtraktion werden durch quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) getestet muss R nicht vollständig für die Methode funktioniert. Hier verbinden wir rechnergestützte Schritte mit experimentellen Schritte in einem Zyklus, der iteriert werden kann, je nach Bedarf, nacheinander entfernen mehrere Referenz-Sequenzen und verfeinern die Suche nach T. Der Vorteil der subtraktiven Genomik ist eine völlig neuartiges Zielsequenz selbst in Fällen identifiziert werden kann, in denen körperliche Reinigung schwierig, teuer oder unmöglich ist. Ein Nachteil der Methode ist eine geeignete Referenz für die Subtraktion Suche und Erlangung eines T-Positive und negative Proben zu Testzwecken qPCR. Wir beschreiben unsere Implementierung der Methode zur Identifizierung des ersten Gens aus der Keimbahn eingeschränkt Chromosom von Zebrafinken. In diesem Fall drei Verweise (R), nacheinander entfernt über drei Zyklen beteiligt rechnerische Filterung: eine unvollständige genomische Montage, genomische Rohdaten und transkriptomischen Daten.

Nach dem Ausführen von BLAST, haben die Ausgabe-Datei eine Liste der Sequenzen aus der Abfrage, die der Datenbank entspricht. Nach Python Subtraktion wird eine Reihe von verglichen Sequenzen erhalten und von qPCR getestet. Die Ergebnisse dieser und nächsten Schritte werden nachfolgend erläutert.
Negatives Ergebnis. Es gibt zwei mögliche negative Ergebnisse, die nach der Explosion, die Referenzsequenz gesehen wer...

Dieses Protokoll soll verwenden eine Kombination aus Rechenleistung und Bank-Forschung, um neue Sequenzen zu finden, die leicht von einer Co reinigende Sequenz, die nur teilweise bekannt sein kann nicht getrennt werden können.

Neue Sequenz Entdeckung durch subtraktive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Unser Protokoll ist von Bedeutung, weil es verwendet werden kann, um genomische Sequenzen zu identifizieren, die nicht von mitreinigenden Sequenzen isoliert werden können, die selbst nur teilweise bekannt sein können. Die Hauptvorteile dieser Technik ist, dass es kostengünstig ist, mit meist freier Software, die heruntergeladen werden kann, sowie flexibel. Sie können es auf viele biologische Fragen anwenden.Mögliche Anwendungen sind die Identifizierung bakterieller Impfstoffziele und die Identifizierung von Viren, deren Sequenzen sich extrem von bekannten Mikroben unterscheiden. Diese Methode kann auf jedes System angewendet werden, in dem das Unbekannte nicht experimentell getrennt werden kann, solange die Referenzsequenz ohne das genomische Ziel verfügbar ist. Diese Technik erfordert einige Versuch und Fehler, so Geduld ist wichtig.Möglicherweise müssen Sie Probleme haben, die Programme zu schießen. Sie können Andere Programme als die hier beschriebenen verwenden. Verwenden Sie die Bedienungsanleitungen so weit wie möglich.Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist hilfreich, da die Rechenarbeit von einem grundlegenden Verständnis der Struktur der Befehlszeilenprogrammierung abhängt. Verwenden Sie zunächst Trimmomatic 0.32, um Beleuchtungsadapter und Basen niedriger Qualität zu entfernen. Verwenden Sie Birnenversion 0.9.11, um qualitativ hochwertige zusammengeführte Lesevorgänge aus trimmomatischen Ausgabe-gekoppelten Lesevorgängen mit Standardparametern zu erstellen.Verwenden Sie dann Reptile Version 1.1, um fehlerbehaftet die durch Pear erzeugten Lesevorgänge zu korrigieren. Verwenden Sie schließlich Trinity Version 2.4.0 im Standardmodus, um die korrigierten Sequenzen zusammenzustellen. Verwenden Sie für strangspezifische Bibliotheken den Parameter SS_lib_type.Die Ausgabe ist eine FASTA-Datei, die in einem neuen Verzeichnis namens trinity_output abgelegt wird. Erstellen Sie eine BLAST-Datenbank der Referenzsequenz nucleotide_reference. fasta an der Befehlszeile.BLAST stimmte mit der Abfrage überein, die mit der Referenzdatenbank zusammengestellt wurde. Verwenden Sie BLAST_results, um eine Ausgabedatei zu erhalten. txt Um eine tabellarische Ausgabe zu generieren, die für Diesequenzverarbeitungsschritte mit Python-Skripten erforderlich ist, verwenden Sie outfmt 6 Für eine erhöhte Stringenz verwenden Sie Proteinsequenzen aus der Baugruppe als BLAST-Abfrage mit übersetztem Nukleotid BLAST, das eine sechsseitige Übersetzung der Nukleotiddatenbank durchführt.Um Proteinsequenzen für die Abfrage zu erhalten, führen Sie den TransDecoder aus. Long0rfs-Befehl, um die längsten geöffneten Leserahmen aus zusammengesetzten Abfragesequenzen zu identifizieren. Führen Sie nun tblastn aus.Stellen Sie bei Bedarf sicher, dass der richtige genetische Code für den untersuchten Organismus mit dem db_gencode mit entsprechender Codeoption ausgewählt wird. Wenn eine hochwertige Proteinreferenz verfügbar ist, verwenden Sie Protein-Protein-Matching mit Blastp anstelle von tblastn Machen Sie eine BLAST-Datenbank der Proteinreferenz. Stellen Sie sicher, dass Sie das Ergebnis als Datei für die Nachverarbeitung speichern, und verwenden Sie die Tabellarische Ausgabe, um sicherzustellen, dass die Python-Skripts sie korrekt analysieren können.Verwenden Sie nun das subtraktive Python-Skript, um übereinstimmende Sequenzen zu entfernen. Um die Lesevorgänge der Assembly zuzuordnen, verwenden Sie BWA-MEM Version 0.7.12 oder bowtie 2, um die heruntergeladenen Rohlesevorgänge der Abfrageassembly zuzuordnen. Indexierung zunächst die Assembly, und ordnen Sie dann die Lesevorgänge zu.Die Ausgabe wird SAM-Format sein. Führen Sie das Python-Skript removeUnmapped aus. py mit der SAM-Datei als Eingabe.Dadurch werden die Namen von Abfragesequenzen ohne übereinstimmende Lesevorgänge identifiziert und in einer neuen Textdatei gespeichert. Die Ausgabe des vorherigen Schritts ist eine Liste von Sequenznamen in einer txt-Datei. Extrahieren Sie eine FASTA-Datei mit diesen Sequenzen.Die Ausgabe ist eine Fasta-Datei. Verwenden Sie Genius, um optimale Primersequenzen manuell zu bestimmen. Markieren Sie eine Kandidatensequenz von 21 bis 28 Basispaaren für die Vorwärtsgrundierung, wodurch Durchläufe von vier oder mehr einer Basis vermieden werden.Versuchen Sie, eine Region mit einer ziemlich gleichmäßigen Kombination aller Basispaare anzuvisieren. Ein einzelnes G oder C an drei Prime End ist von Vorteil und hilft, die Grundierung zu verankern. Klicken Sie auf die Registerkarte Statistik auf der rechten Seite des Bildschirms, um die geschätzte Schmelztemperatur dieser Sequenz anzuzeigen, wenn die Kandidatenregion hervorgehoben ist.Ziel für eine Schmelztemperatur zwischen 55 und 60 Grad Celsius, unter Vermeidung von Wiederholungen, und lange Läufe von G C.Wählen Sie eine umgekehrte Grundierung in der gleichen Weise, gelegen 150 bis 250 Base-Paare drei Primzahl der vorderen Grundierung. Während die Grundierungslängen nicht übereinstimmen müssen, sollte die vorhergesagte Schmelztemperatur so nah wie möglich an der der vorderen Grundierung liegen. Achten Sie darauf, die Sequenz umzukehren, indem Sie mit der rechten Maustaste in Genius klicken, während eine Sequenz in einer Menüoption hervorgehoben wird.Eine alternative Methode besteht darin, die Primer Design-Funktion zu verwenden, die sich in der oberen Symbolleiste im Sequenzfenster befindet. Fügen Sie die Region ein, um sie unter Zielregion zu verstärken. Geben Sie unter der Registerkarte Eigenschaften die gewünschte Größe, Schmelztemperatur und prozentweise G C ein, und klicken Sie dann auf OK, um Primer generieren zu lassen.Um die quantitative PCR-Validierung der verbleibenden Sequenz durchzuführen, bereiten Sie zunächst ein Reaktionsgemisch für jede Vorlage in dreifacher Ausfertigung vor, mit unserem SYBR Green Master Mix, Vorwärts- und Rückwärtsprimern und Wasser, für ein Gesamtvolumen von 25 Mikrolitern. Führen Sie ein qPCR-Programm aus, das über die zuvor validierte Temperatur und Verlängerungszeit informiert ist. Endgültige Denaturierungskurven sollten mindestens beim ersten Einsatz der Primer in qPCR erzeugt werden, um die Amplifikation eines einzelnen DNA-Produkts zu validieren.Messen Sie die qPCR SYBR Green Signale relativ zu Actin von Ct Für alle Fälle berechnen Sie den Durchschnitt und die Standardabweichung von zwei zum Ct relativ zu Actin. Führen Sie endpunkt-Gelelektrophorese durch, um die korrekte Produktgrößenerkennung durch qPCR zu bestätigen. Hier laufen 25 Mikroliter des qPCR-Produkts gemischt mit fünf Mikrolitern 6X Glitterol Farbstoff auf einem 2%TAE Agarose Gel bei 200 Volt für 20 Minuten.Wenn Ihr qPCR zeigt, dass Sie die Zielsequenzen nicht identifiziert haben, wiederholen Sie den gesamten Zyklus mit einer neuen Referenz, die aus einer Online-Datenbank abgerufen werden kann. Das subtraktive Projekt begann in diesem Fall mit der Sequenzierung der RNA aus keimgefüttertem Gewebe von männlichen und weiblichen erwachsenen Zebrafinken. Letztlich wurden 935 somatische Gene identifiziert, die zuvor nicht in der gesamten Genom-Anmerkung enthalten waren.Nach der Computerfilterung kann die quantitative PCR zu einem negativen Ergebnis führen, bei dem es keinen Unterschied in der Detektion zwischen Vogelgeweben gab. Umgekehrt wird ein positives Ergebnis, das die Identifizierung einer Wahren Zielsequenz darstellt, bestätigt, wenn die genomische DNA qPCR im Interessedesgewebe im Vergleich zur Referenz eine statistisch größere Detektion zeigt. Hier wurde das Alpha-Snap-Gen als Keimbahn-beschränkt validiert, weil es im somatischen Gewebe im Vergleich zur Teste-DNA erschöpft war, wo es vorhanden war, dass die Werte, die Actin entsprechen.Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, die richtigen Eingaben während jeder der Rechenschritte zu verwenden. Möglicherweise müssen Sie die Zyklussubtraktion mehrmals durchlaufen, um die Zielsequenz oder Sequenzen zu erhalten. Eine Vielzahl von phylogenetischen, strukturellen und funktionellen Analysen können an den entdeckten Genen durchgeführt werden.Diese zusätzlichen Methoden geben Einblick in die evolutionären und funktionellen Rollen der Gene. Wir identifizierten das erste Gen auf einem keimlinienbeschränkten Singvogelchromosom, das das Interesse an diesem überraschenden genomischen Element erweiterte. Nachfolgende Arbeiten zeigten ähnliche Chromosomen bei vielen Singvogelarten, die viele zusätzliche Gene enthielten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Wir verfügen über umfassende, unvoreingenommene genomweiten Screens entwickelt, um Gen-Medikament und Gen-Umwelt-Interaktionen zu verstehen. Methoden für das Screening dieser mutierten Sammlungen präsentiert werden.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Pooled DNA-Sequenzierung ist eine schnelle und kostengünstige Strategie, um seltene Varianten mit komplexen Phänotypen assoziiert in großen Kohorten zu erkennen. Hier beschreiben wir die computergestützte Analyse von gepoolten, Next-Generation-Sequenzierung von 32 Krebs-Genen unter Verwendung des SPLINTER Software-Paket. Diese Methode ist skalierbar und für jeden interessierenden Phänotyp.

Nachweis seltener Varianten von Genomic Pooled-Sequenzierung mit SPLINTER

Die Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft ist ein langjähriges Ziel in der Umweltmikrobiologie. Next-Generation-Sequencing-Methoden ermöglichen nun die Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in einer noch nie dagewesenen Tiefe mit minimalem Kosten- und Arbeitsaufwand. Wir beschreiben hier unseren Ansatz zur Sequenzierung bakterieller ribosomaler 16S-RNA-Gene mit einem Tischsequenzierer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

Bisulfit-Amplikon-Sequenzierung (BSAS) ist eine Methode zur Quantifizierung der Cytosin-Methylierung in bestimmten genomischen Regionen von Interesse. Bei dieser Methode wird die Bisulfit-Umwandlung in Kombination mit der PCR-Amplifikation von Zielregionen vor der Next-Generation-Sequenzierung verwendet, um eine absolute Quantifizierung der DNA-Methylierung auf basenspezifischer Ebene zu erzielen.

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

Wir beschreiben eine Technik Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung zu spätere replizierende Regionen des Genoms zu identifizieren, zu kombinieren.

G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Next Generation Sequencing (NGS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genomische Charakterisierung, die durch die hohe Fehlerquote der Plattform (~0.5–2.0%) begrenzt ist. Wir beschreiben unsere Methoden zur Sequenzierung Fehler korrigiert, mit denen wir umgehen die NGS Fehlerquote und erkennen Mutationen bei Variante Allel Brüche so selten wie 0,0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Die Kennung der physikalischen Wechselwirkungen zwischen Genen und regulatorische Elemente ist anspruchsvoll aber erfassen Bezahlungsmethode Chromosom Konformation erleichtert worden. Diese Modifikation des 4C-Seq-Protokolls mildert PCR Bias durch Minimierung der Überverstärkung PCR-Vorlagen und maximiert die Mappability von Lesevorgängen durch den Einbau eines Zusatz Restriktionsenzym verdauen Schritt.

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

Hier wird ein Massenspektrometrie-geführtes Genom-Mining-Protokoll erstellt und beschrieben. Es basiert auf Genomsequenzinformationen und LC-MS/MS-Analysen und zielt darauf ab, die Identifizierung von Molekülen aus komplexen mikrobiellen und pflanzlichen Extrakten zu erleichtern.

Mass Spectrometrie-Guided Genome Mining als Werkzeug zur Aufdeckung neuartiger Naturprodukte

Dieses Protokoll beschreibt einen Arbeitsablauf von Ex-vivo - oder In-vitro-Zellkulturen bis hin zur transkriptomischen Datenvorverarbeitung für ein kostengünstiges Transkriptom-basiertes Wirkstoff-Screening.

Kosteneffizientes transkriptomisches Wirkstoff-Screening

In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur funktionellen Untersuchung der Transkription und der inhibitorischen Aktivität von antibakteriellen Wirkstoffen, die auf die bakterielle Transkription abzielen.

In - vitro - Transkriptionsassays und ihre Anwendung in der Drug Discovery

Erfahren Sie subtraktive Genomik zur Identifizierung neuer Sequenzen, die sich nicht von co-purifizierenden Sequenzen isolieren lassen. Diese kostengünstige Methode nutzt freie Software und ist flexibel für verschiedene biologische Fragestellungen.

Neue Sequenz Entdeckung durch subtraktive Genomics

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